Summary
Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.
Abstract
Gli enzimi ATPase utilizzano l'energia libera immagazzinata nel triposfato adenosina per catalizzare un'ampia varietà di processi biochimici endergonici in vivo che non si verificherebbero spontaneamente. Queste proteine sono fondamentali per essenzialmente tutti gli aspetti della vita cellulare, tra cui il metabolismo, la divisione cellulare, le risposte ai cambiamenti ambientali e il movimento. Il protocollo qui presentato descrive un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) che è stato adattato allo screening semi-alto della produttività degli inibitori ATPase a piccole molecole. Il saggio è stato applicato alla miosina cardiaca e scheletrica di miosina II, due ATPases motori molecolari basati su actin, come prova di principio. L'idrolisi dell'ATP è accoppiata all'ossidazione di NADH da reazioni enzimatiche nel saggio. In primo luogo, l'ADP generato dall'ATPase viene rigenerato in ATP dalla chinasi pirativae (PK). PK catalizza la transizione del fosforolpyruvate (PEP) alla pirofavia in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato mediante dehydrogenase di lattato (LDH), che catalizza l'ossidazione di NADH in parallelo. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di ATP è direttamente correlata alla diminuzione della concentrazione di NADH, seguita da un cambiamento alla fluorescenza intrinseca di NADH. Finché la PEP è disponibile nel sistema di reazione, la concentrazione di ADP rimane molto bassa, evitando l'inibizione dell'enzima ATPase da parte del proprio prodotto. Inoltre, la concentrazione ATP rimane quasi costante, producendo corsi temporali lineari. La fluorescenza viene monitorata continuamente, il che consente una facile stima della qualità dei dati e aiuta a filtrare i potenziali artefatti (ad esempio, derivanti da precipitazioni composte o cambiamenti termici).
Introduction
I miosini sono trasduttori di energia meccanochimica che idrolizzano il tripfosfato di adenosina (ATP) per generare movimento direzionale lungo i filamenti del citoscheletro actinos in eucarioti1,2. Si sono adattati sia strutturalmente che kineticamente alle loro varie funzioni intracellulari, come il trasporto di organelli, la contrazione muscolare o la generazione di tensione citoscheletrica1,2. La superfamiglia della miosina è rappresentata da 40 geni della miosina appartenenti a classi di miosina distinte da 12 dollari nel genoma umano3,4. I membri delle classi di miosina svolgono vari ruoli in una serie molto diversificata di disturbi, come diversi tumori, disturbi neurologici, miopatie scheletriche e cardiomiopatia ipertrofica5,6. Dato il gran numero di funzioni fisiologiche e patologiche di questi motori molecolari, non è sorprendente che stiano diventando sempre più riconosciuti come bersagli farmacologici per una varietà di condizioni7. Recentemente sono stati compiuti progressi significativi nella scoperta di nuovi inibitori della miosina8,9,10 e attivatori11, e per migliorare le proprietà di quelli esistenti12, 13 del sistema , 14 Del sistema , 15.
Il saggio ATPase (NADH) accoppiato alla nicotinammide adenina (NADH) è stato a lungo utilizzato per misurare l'attività ATPase di vari enzimi, come il reticulum sarccoplasmico Ca2o pompa ATPase16, la riparazione del DNA ATPase Rad5417, l'AAA ATPase p9718 o il motore microtubulo kinesin19. Il saggio utilizza un ciclo di rigenerazione ATP. Il difosfato di adenosina (ADP) generato dall'ATPase viene rigenerato all'ATP dalla chinasi pirata (PK), che trasforma una molecola di fosforenolpyruvate (PEP) in pyruvate in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato dalla dehydrogenasi lattato (LDH). Che, a sua volta, ossida una molecola di NADH a NAD. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di NADH in funzione del tempo è uguale al tasso di idrolisi ATP. Il ciclo di rigenerazione ATP mantiene la concentrazione ATP quasi costante e la concentrazione di ADP bassa fino a quando è disponibile PEP. Questo si traduce in corsi di tempo lineari, rendendo semplice determinare i tassi di reazione iniziali e aiuta a evitare l'inibizione del prodotto da ADP19. Anche se il test ATPase accoppiato con NADH è già stato adattato ad un formatoa96 ben20, gli elevati volumi di reazione (150 dollari) lo rendono relativamente costoso a causa dell'elevata domanda di reagenti, rendendolo meno suscettibile di screening rapido di un gran numero di Composti. I metodi alternativi, come il test verde malessere19,21, che si basa sulla rilevazione del fosfato prodotto dall'enzima ATPase, si sono dimostrati più adatti per la miniaturizzazione e lo screening ad alto valore22 , 23 del 23 o , 24.Tuttavia, è più probabile che un'espressione endpoint sia influenzata da diversi artefatti (discussi di seguito), che potrebbero rimanere sconosciuti in assenza di corsi a tempo pieno.
In questo caso, il saggio ATPase accoppiato nADH è stato ottimizzato per lo screening semi-alto della produttività degli inibitori delle piccole molecole. La miosina scheletrica e cardiaca muscolare miosina II e gli inibitori della miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 sono utilizzati per dimostrare la potenza del saggio, che si basa su NADH fluorescenza come una lettura. Questo protocollo è suscettibile di vagliare progetti incentrati su qualsiasi enzimi che producono ADP.
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Protocol
1. Preparazione di soluzioni e reagenti azionari
- Preparare la soluzione di stock dithiothreitol (DTT) sciogliendo il DTT cristallino in acqua distillata fino a una concentrazione finale di 1000 mM. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione di riserva ATP sciogliendo l'ATP cristallino nell'acqua distillata fino a una concentrazione finale di 100 mM. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare il buffer 10x NADH contenente 70 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonico acid (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 m etilene glicol-bis(Etere n-aminoethyl)-N,N'n'tetraacetic acid (EGTA) e 3 mM NaN3. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare 1x buffer di miosina contenente 10 mM MOPS e 0,1 mM EGTA. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Conservare a 4 gradi centigradi. Aggiungere l'albumina del siero bovino (BSA) e la DTT a una concentrazione finale dello 0,1% (w/v%) e 1 mM, rispettivamente, prima dell'uso.
- Preparare 1x buffer di actin contenente 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2e 3 mM NaN3. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Conservare a 4 gradi centigradi. Aggiungere BSA e DTT a una concentrazione finale dello 0,1% (w/v%) e 1 mM, rispettivamente, prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di stock NADH sciogliendo il nADH cristallino nel buffer 10x NADH a una concentrazione finale di 5,5 mM. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione stock PEP sciogliendo pep cristallino nel buffer 10x NADH ad una concentrazione finale di 50 mM. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione stock LDH sciogliendo la polvere LDH lofilia in una miscela di glicerolo e buffer 10x NADH (50%:50%) ad una concentrazione finale di 2000 U/mL. Centrifugare la soluzione per rimuovere qualsiasi proteina non disciolta presente (7.197 x g, 20 c, 10 min). Trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga pulito con attenzione. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione PK stock sciogliendo la polvere di PK liofilizzata in una miscela di glicerolo e 10x buffer NADH (50%:50%) ad una concentrazione finale di 10000 U/mL. Centrifugare la soluzione per rimuovere qualsiasi proteina non disciolta presente (7.197 x g, 20 c, 10 min). Trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga pulito con attenzione. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Ricostituire i campioni di miosina del muscolo leofilato cardiaco e scheletrico aggiungendo rispettivamente 100 acqua distillata l'acqua per ottenere 10 soluzioni di stock mg/mL corrispondenti rispettivamente a 37,9 e 40,8 M di concentrazioni di miosina (monomerico). Per ulteriori dettagli, vedere le istruzioni del produttore.
- Preparare F-actin da polvere di acetone muscolo coniglio come descritto da Pardee e Spudich25.
2. Misurazione delle attività ATPase e degli effetti inibitori degli inibitori delle piccole molecole
- Preparare la piastra composta.
- Sciogliere composti di interesse in dimethylsulfossido di alta qualità (DMSO).
- Creare diluizioni seriali 1:2 in 13 fasi a partire dalla concentrazione composta di 10 mM in DMSO.
- Trasferire i campioni su una piastra di polipropilene 384 pozzetto in triplice (12,5 l ciascuno) utilizzando una pipetta multicanale. Utilizzare due file sulla piastra composta per un composto (invece di tre colonne) per ridurre al minimo il numero di pozzi potenzialmente influenzati dagli effetti del bordo. Utilizzare gli ultimi tre pozze nella seconda riga per ogni composto come controllo negativo (solo DMSO). Non utilizzare la prima e l'ultima fila sulla piastra per le diluizioni composte.
- Trasferire DMSO puro nei pozze della prima fila (riservato per la calibrazione NADH).
- Utilizzare l'ultima riga per il controllo positivo.
NOTA: Qui è stata utilizzata lapara-aminoblebbistatin a 4 mM di concentrazione nel DMSO.
- Preparare una soluzione di actina diluita per ogni piastra di analisi (piastra di asini 384-well black-wall microptirone) diluendo la soluzione di riserva di actina nel buffer di actina. Mescolare accuratamente la soluzione pipetting up e down 30x utilizzando una pipetta da 5 mL per ridurre la viscosità e l'eterogeneità rompendo i filamenti di actina. Centrifugare la soluzione per rimuovere qualsiasi proteina precipitata presente (7.197 x g, 20 c, 10 min). Trasferire con attenzione il supernatante in un tubo di centrifuga pulito.
- Preparare il mix master contenente enzimi LDH e PK ("mix di enzimi"). Per ogni plato di analisi, unire 171,4 l di soluzione LDH, 171,4 l di soluzione PK e 3189,3 l o 3252,9 l di buffer di miosina per i saggi che coinvolgono la miosina del muscolo cardiaco o scheletrico II, rispettivamente, in un tubo centrifuga connico 15 mL. Non aggiungere alcuna miosina a questo punto per evitare l'aggregazione e le precipitazioni.
- Preparare la miscela principale contenente tutti i substrati ("mix di substrati"). Per ogni piastra, unire 162,1 gradi di ATP, 162,1 l di PEP e 324,1 L di soluzione NADH in un tubo di centrifuga conica da 15 mL. Non aggiungere actin a questo punto per evitare l'aggregazione e le precipitazioni.
- Creare diluizioni seriali 1:2 in sette passaggi di NADH per la calibrazione a partire da 250 M.
- Mescolare la soluzione di stock da 12,3 litri di NADH con 257,7 tamponanti di miosina in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aliquota 135 L di buffer di miosina in sette tubi di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Trasferire 135 l di soluzione dal primo tubo al secondo e mescolare con la pipettatura. Ripetere fino a raggiungere il tubo 7 th.
- Utilizzare l'ultimo tubo come controllo no-NADH (solo buffer).
- Utilizzando una pipetta a 8 canali, trasferire 20 gradi l delle soluzioni di calibrazione NADH nella prima fila della piastra di analisi in triplicati.
- Aggiungere al mix di enzimi 68 -L di cardiaco o 4,2 gradi di miosina muscolare scheletrica. Vortice brevemente.
- Ad eccezione della prima fila, erogare 8,4 litri della miscela miosina-enzima preparata in ogni pozzo della piastra di analisi utilizzando un dispenser automatizzato.
- Trasferire 100 nL di soluzioni dalla piastra composta alla piastra di analisi contenente mix di enzimi utilizzando un sistema di movimentazione liquida automatizzato dotato di una testa di utensile perno da 100 nL.
- Agitare la piastra di analisi per 1 min a temperatura ambiente a 1200 giri/mm utilizzando uno shaker a microplacca.
- Aggiungere alla miscela di substrato 4.052 l della soluzione di actina centrifuga. Vortice brevemente.
- Distribuisci 11,6 l di miscela actina-substrato in ogni pozzetto della piastra di analisi (tranne la prima fila) per avviare la reazione enzimatica utilizzando un dispenser automatizzato.
- Agitare la piastra di analisi per 1 min a temperatura ambiente a 1200 giri/mm utilizzando uno shaker a microplacca.
- Centrifugare la piastra di saggio a 101 x g per 30 s.
- Assicurarsi che la temperatura interna del lettore di placche sia stata stabilizzata a 25 gradi centigradi. Caricare la piastra e agitare per altri 30 s. Questa fase di agitazione è necessaria per rendere la forma della superficie liquida simile in ogni pozzo e consente alla piastra di raggiungere la temperatura di misurazione.
- Registrare la fluorescenza NADH per la scansione della piastra a 30 min a intervalli di 45 s. Utilizzare un filtro di eccitazione larghezza di banda 380 nm e un filtro di emissione larghezza di banda da 24 nm di 470 nm in combinazione con un mirror dicroico tagliato a 425 nm. Eseguire la misurazione in modalità ad alta concentrazione. Ottimizzare il numero di lampi, guadagno del rilevatore, dimensioni della piastra e altezza di misurazione prima di eseguire i saggi.
NOTA: le condizioni di analisi finale sono 300 nM cardiaco/20 nM muscolo scheletrico miosina II, 10 actina m, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220M - NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP in un buffer contenente 10 mM MOPS (pH 7,0), 2 mM MGCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO e 1 mM DTT. Il volume totale è di 20 l/well. La più alta concentrazione finale di composti è 50 m. 20 m para-aminoblebbistatin in 0,5% DMSO serve come controllo positivo e 0,5% DMSO da solo è il controllo negativo. Tutte le misurazioni vengono effettuate in triplicati.
3. Analisi dei dati
- Tracciare l'intensità di fluorescenza osservata rispetto al tempo per ogni pozzo.
- Eseguire una regressione lineare semplice per determinare la pendenza e l'intercetta delle risposte di fluorescenza per ogni pozzo. La pendenza è proporzionale al tasso di consumo atP (NADH), mentre l'intercetta è proporzionale alla concentrazione di NADH all'inizio della misurazione (t - 0 s).
- Costruire una curva di calibrazione per NADH tracciando le intercettazioni ottenute per la prima fila della piastra contro la concentrazione di NADH. Assicurarsi che le intercettazioni dipendano linearmente dalla concentrazione di NADH.
NOTA: Le intercettazioni stimano le intensità di fluorescenza reale a t s 0 s con molta più sicurezza rispetto alla media dell'intensità di fluorescenza grezza si legge a 0 s. - Eseguire la regressione lineare semplice per ottenere la pendenza e l'intercetta della linea di calibrazione NADH.
NOTA: L'intercetta descrive il segnale di fondo a fluorescenza (nessun NADH presente), mentre la pendenza corrisponde all'intensità di fluorescenza estrapolata/teorica di una soluzione NADH da 1 M in quel particolare esperimento. - Dividere la pendenza della risposta di fluorescenza ottenuta per il resto dei pozzi per la pendenza della linea di calibrazione NADH per convertire le variazioni di fluorescenza nei tassi di consumo ATP.
- Tracciare i tassi di consumo dell'ATP rispetto alla concentrazione dell'inibitore.
- Per determinare le costanti inibitorie, utilizzare un software statistico appropriato per adattare i dati dose-risposta alla seguente equazione quadratica corrispondente a un semplice modello di equilibrio di legame uno a uno:
dove Y è il tasso di consumo ATP, Ymin è il tasso di consumo ATP inassenza dell'inibitore, Ymax è il tasso teorico di consumo ATP al 100% inibizione, KI è la costante inibitoria , [E]t e [I]t sono rispettivamente la concentrazione totale dell'enzima (miosina) e dell'inibitore.
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Representative Results
La tipica mappa di layout delle lame utilizzata per gli esperimenti di screening è illustrata nella Figura1. La prima e l'ultima riga sono riservate rispettivamente alla calibrazione NADH e al controllo positivo (20 m para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO). Le righe rimanenti (da B a O) vengono utilizzate per testare l'attività inibitoria dei composti. Qui, le diluizioni seriali 1:2 in quindici in fasi a partire dalla concentrazione composta di 10 mM in DMSO vengono preparate e trasferite dalla piastra composta alla piastra di analisi, in modo che la più alta concentrazione finale composta è 50M (in 0,5% DMSO) sulla piastra di analisi. Due righe vengono utilizzate per ottenere una curva dose-risposta per un composto (48 punti dati/composto). Si noti che le mappe di layout piastra possono essere riprogettate per supportare gli obiettivi specifici di un determinato progetto. Ad esempio, se l'obiettivo fosse quello di ottenere dati di screening monopunto per un gran numero di composti, si potrebbero testare 112 composti su una singola piastra di 384 pozze utilizzando lo stesso layout per il controllo positivo e la calibrazione NADH (calcolando con triplicati per ogni composto). Si consiglia sempre di avere un minimo di 3 punti dati per un composto (o per ogni concentrazione) ed evitare di utilizzare solo i pozzi lungo i bordi della piastra per un composto, in quanto questi punti dati possono essere influenzati da effetti di bordo. Per stimare l'importanza degli effetti del bordo, eseguire sempre una piastra completa con controllo negativo solo prima.
Le intensità di fluorescenza hanno una dipendenza lineare dalla concentrazione di NADH, come illustrato nella Figura 2A. La pendenza dell'adattamento lineare viene utilizzata durante l'analisi dei dati per convertire le variazioni di fluorescenza in tassi di reazione. Si noti che la traccia di intensità di fluorescenza non elaborata ottenuta per ogni pozzo della calibrazione NADH viene analizzata per prima mediante regressione lineare (un'analisi simile è illustrata nella Figura 2B,C per i dati composti). Si prevede che queste tracce mostrino un decadimento esponenziale nel tempo a causa del fotosbiancamento del fluoroforo. Tuttavia, il fotosbiancamento è molto lento e, pertanto, i dati grezzi possono essere analizzati da attacchi lineari. La pendenza e l'intercettazione di questi attacchi corrispondono rispettivamente al tasso iniziale di fotosbiancamento e all'intensità di fluorescenza a t e 0 s. Le intercettazioni di questi adattamenti lineari vengono utilizzate al posto della media delle letture a fluorescenza grezza a t - 0 s per costruire la curva di calibrazione NADH perché le intercettazioni sono stimate sulla base di più dati e, pertanto, gli errori associati sono molto più piccoli.
Figura 2B,C dimostra che indipendentemente dalla miosina utilizzata o dalla presenza dell'inibitore, i corsi temporali sono lineari nell'intervallo temporale delle misurazioni. Le concentrazioni di inibitori più alte (50 m) e più basse (0 m) qui corrispondono rispettivamente al 100% e allo 0% di inibizione. Si noti che a causa della quantità di dati grezzi, l'analisi effettiva apparirebbe caotica se visualizzata su un singolo pannello. Pertanto, questi pannelli sono stati semplificati per visualizzare meglio il processo. La media delle letture di intensità di fluorescenza grezza è stata calcolata per tutti gli esperimenti paralleli (triplicati per ogni concentrazione) e convertita in concentrazioni di NADH qui. Vengono mostrate solo 3 concentrazioni di inibitori. Nell'analisi reale, ogni traccia di intensità a fluorescenza grezza (48/composto testato) viene analizzata per prima per regressione lineare e successivamente, le pendenze vengono convertite in tassi di consumo ATP.
È sempre consigliabile dimostrare che i tassi di reazione cambiano linearmente con la concentrazione di enzimi, come illustrato nella Figura 2D e nella Figura2E rispettivamente per la miosina iI del muscolo scheletrico e cardiaco. Sulla base delle vestibilità lineari, la concentrazione di analisi finale dell'enzima può essere facilmente stimata. Ad esempio, un tasso di reazione di 5 x 10-8 Ms-1 è raccomandato per i corsi di tempo di 30 min. Se un attivatore viene utilizzato nelle miscele di reazione (come actin qui), si consiglia di eseguire gli esperimenti sia in presenza che in assenza dell'attivatore per garantire che l'effetto previsto (attivazione) sia presente. Le condizioni e la procedura devono seguire il protocollo finale il più fedelmente possibile. Qui, una serie di diluizione di miosina è stata preparata nel buffer della miosina in otto tubi di microcentrifuga prima. Successivamente, è stata aggiunta una combinazione di enzimi LDH e PK. Infine, le reazioni sono state iniziate aggiungendo il mix di substrati ad ogni tubo in parallelo, utilizzando una pipetta multicanale. Le miscele di reazione sono state immediatamente trasferite su una riga della piastra di analisi in triplicati. Se actin era assente, è stato utilizzato actin buffer. Non sono stati modificati altri parametri (vedere la nota del passaggio 2.16 nel protocollo per le condizioni di analisi finale).
La figura 2F mostra i tassi di consumo ATP ottenuti per più reazioni di controllo negative e positive (mezza piastra ciascuna). Questi dati possono essere confrontati in base al valore di "coefficiente di finestra di screening"26, che è un parametro statistico ampiamente utilizzato per stimare la qualità dei saggi ad alta produttività. Confronta i controlli positivi e negativi tenendo conto sia dei mezzi che delle deviazioni standard:
,
in cui, rispettivamente, i controlli negativi e positivi sono n, p e n. Le due popolazioni sono ben separate se il valore di ' è compreso tra 0,5 e 1. A ' ' 0,78 ottenuto qui dimostra che l'analisi può essere considerata come eccellente26.
Per dimostrare che il saggio può essere utilizzato per determinare le costanti inibitorie, la piccola molecola di miosina inibitore blebbistatin8 e due analoghi, para-nitroblebbistatin12 e para-aminoblebbistatin13 hanno è stato scelto qui, come illustrato nella figura 3A e nella figura 3B. Blebbistatin è un inibitore della miosina alforica non competitivo,27,28. Una molecola di blebbistatina si lega a un dominio motorio della miosina e blocca il ciclo ATPase stabilizzando il complesso miosina-ADP-fosfato27,28. Pertanto, gli effetti inibitori dei derivati della blebbistatina sono stati modellati utilizzando un modello di rilegatura semplice e uno a uno (vedere il passaggio 3.7 nel protocollo). Si noti che questo modello potrebbe non essere stato applicabile se i tassi di consumo ATP non avevano mostrato una dipendenza lineare dalla concentrazione di miosina (vedere la figura 2D,E). La solubilità cinetica della blebbistatin, dellaparabottistatina e dell'ammiercimina è stata segnalata rispettivamente di 426, 3,6 m e 9,3 M, rispettivamente13. Nessuna anomalia nel segnale è stata osservata al di sotto o al di sotto delle solubilità segnalate nei nostri esperimenti; tuttavia, diversi artefatti sono apparsi quando blebbistatin o paratroblebbistatin è stato utilizzato sopra i loro valori di solubilità segnalati, come illustrato nella Figura 4. Pertanto, il segnale registrato a concentrazioni superiori alla solubilità è stato escluso dall'analisi dei dati in questi casi. Para-aminoblebbistatin è altamente solubile, e quindi, la solubilità non era un fattore limitante in quel caso.
Infine, si raccomanda sempre di testare se gli effetti inibitori di eventuali colpi positivi sono specifici per l'enzima ATPase bersaglio. Il sistema di reazione accoppiato impiega altri due enzimi, LDH e PK, e l'inibizione di uno di questi si tradurrà in un segnale falso positivo. L'esecuzione del saggio ATPase con un enzima ATPase non correlato può aiutare a filtrare questi risultati falsi positivi (per ulteriori raccomandazioni, vedi discussione). Para-aminoblebbistatin e apyrae, un atP idrolizing enzima che produce ADP e fosfato inorganico29, sono stati utilizzati qui come esempio per dimostrare un tale esperimento di controllo, come mostrato Figura 5.
Figura 1 : layout piastra di qualità. Le diluizioni seriali 1:2 in sette fasi di NADH a partire dalla concentrazione di 250 m vengono preparate e successivamente erogate nella fila A in triplice copia per la calibrazione (sfumatura di colore da nero a verde). Gli ultimi tre pozze della riga A contengono solo buffer di miosina (nessun controllo NADH, bianco). L'ultima riga (P) viene utilizzata per il controllo positivo (20 - m para-aminoblebbistatin; rosso). Un tipico esperimento dose-risposta richiede due righe (ad esempio, B e C). Pertanto, 7 esperimenti di risposta alla dose possono essere eseguiti in parallelo su una singola piastra di 384 pozze (rappresentata da gradienti di colore da blu a bianco). Ogni campione viene caricato come triplicati. In questo caso, le concentrazioni di composti finali più elevate partono da 50 m (in 0,5% DMSO). Gli ultimi tre pozze di ogni seconda riga sono riservati per il controllo negativo (nessun composto, 0,5% solo DMSO; ciano). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Dati di rappresentante ATPase. (A) È stata preparata e trasferita una serie di diluizione bidimensionale di NADH nella prima riga di ciascuna piastra di misurazione. L'intensità della fluorescenza è stata registrata per 30 minuti e i dati grezzi sono stati analizzati mediante semplice regressione lineare. L'intercettazione di ogni retta di regressione è stata tracciata rispetto alla concentrazione di NADH. Si noti che in un caso ideale, l'intensità della fluorescenza a t e 0 s potrebbe essere semplicemente utilizzata per ottenere la linea di calibrazione. Tuttavia, mentre i dati di fluorescenza grezza sono molto rumorosi, le intercettazioni forniscono una stima accurata dell'intensità della fluorescenza a t - 0 s e il loro errore standard associato (mostrato come barre di errore) è molto piccolo. (B,C) Sono state registrate tracce rappresentative di intensità di fluorescenza delle reazioni scheletriche (B) e cardiache (C) muscolari miosina II ATPase in presenza di vari livelli (vedi insemi) di para-aminoblebbistatin. Per semplicità, i punti dati e le barre di errore rappresentano rispettivamente la media di tre misurazioni indipendenti e la deviazione standard associata. È stata eseguita una regressione lineare semplice (linee solide) per ottenere i tassi di reazione. Si noti che un tipico esperimento dose-risposta è costituito da 15 diverse concentrazioni di inibitori e controllo negativo nei triplicati sulla piastra di misurazione (vedi Figura 1) e la regressione lineare viene eseguita singolarmente per ogni fluorescenza traccia di intensità. Per semplicità, qui vengono mostrate solo 3 diverse concentrazioni. (D,E) I tassi di ATPase attivati dall'actina (rosso) e dall'actina (blu) sono stati determinati per varie concentrazioni scheletriche (D)e cardiache (E) muscolari miosine II. I tassi ATPase mostrano una dipendenza lineare dalla concentrazione di miosina. (F) I controlli positivi (rossi) e negativi (blu) (mezza piastra ciascuno) sono stati eseguiti in parallelo su una piastra di analisi di 384 piani e il fattore z (') è stato calcolato per valutare la qualità del saggio ATPase. Un valore di 0,78 indica un'analisi affidabile con controlli positivi e negativi molto ben separati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : curve dose-risposta e analisi delle costanti inibitorie. La miosina muscolare cardiaca (A) e scheletrica (B) sono stati utilizzati per testare l'attività inibitoria di blebbistatin, para-aminoblebbistatin e para-nitroblebbistatin. I tassi di ATPase (blu) sono stati ottenuti applicando una semplice regressione lineare ai dati di fluorescenza grezza. Le barre di errore rappresentano l'errore standard del raccordo e sono state utilizzate come fattori di ponderazione durante l'adattamento di un'equazione quadratica (vedere il passaggio 3.7 nel protocollo) che rappresenta un semplice modello di rilegatura dell'equilibrio (rosso). I dati ottenuti sopra la solubilità sono stati influenzati dagli artefatti ed esclusi dall'analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : artefatti relativi alla solubilità. (A) Le tracce di intensità di fluorescenza per la blebbistatin ottenuta in un saggio ATPase utilizzando il muscolo scheletrico miosina II mostrano un segnale linearmente decrescente a seconda della quantità di inibitore presente (blu). Tuttavia, quando la blebbistatina è stata utilizzata sopra la solubilità (concentrazione di blebbistatin iniziale di 50 M), è stato osservato un aumento del segnale (rosso), molto probabilmente a causa della formazione di cristalli di blebbistatia fluorescenteluminosi 13. (B) Nel caso della para-nitroblebbistatin, che è un analogo non fluorescente della blebbistatin12, le tracce di intensità di fluorescenza grezza sono apparse normali (in diminuzione). Tuttavia, il più alto livello di inibizione era molto più basso del previsto (basato sul controllo positivo). Pertanto, solo i tassi di reazione ottenuti al di sotto della solubilità (blu) sono stati inclusi nell'analisi dei dati. I tassi di reazione ottenuti al di sopra della solubilità (rosso) divergono dalla curva dose-risposta determinata (verde), poiché la precipitazione limita la quantità (concentrazione) dell'inibitore rimanente in soluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : effetti inibitori di para- aminoblebbistatin in miosina muscolare scheletrica II e saggi apyrase ATPase. Para-aminoblebbistatin inibito la miosina muscolare scheletrica II con una KI di 1,7 M, mentre non è stata rilevata alcuna inibizione quando l'apira29 è stato utilizzato come ATPase nello stesso sistema di reazione accoppiato. Questo esperimento dimostra chiaramente che la paraumidistatina è specifica per la miosina e non inibisce PK o LDH, quindi l'effetto inibitorio rilevato non è un artefatto. L'apirasi è stata utilizzata a concentrazione di 0,5 nM. Non era presente miosina o actina, e la reazione è stata eseguita in un buffer contenente 100 mM MOPS (pH - 7.0), 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 3 mM NaN3, 1 mM DTT e 0.1% BSA. Non sono state apportate altre modifiche al protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici nel protocollo
Ottimizzare il layout della piastra eseguendo più piastre con controllo negativo (reazione ATPase senza inibitore). Esaminare attentamente i risultati per i modelli nei tassi di reazione. Ad esempio, questi possono derivare da effetti di bordo e/o imperfezioni nel rivestimento superficiale idrofilo di piastre "non vincolanti". Se si osserva un motivo, modificare il tipo di piastra e/o il layout della lastra per ridurre al minimo gli artefatti. Ad esempio, una tipica curva dose-risposta (16 concentrazioni con triplicati, 48 punti totali) può essere disposta in tre colonne o due righe su una piastra di 384 pozze. Questi accordi producono rispettivamente 6 e 4 punti dati che sono probabilmente influenzati dagli effetti dei bordi. Pertanto, la disposizione delle righe è sempre preferibile.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Si noti che le risposte di fluorescenza osservate devono essere lineari per tutto il corso a tempo pieno della reazione. La non linearità può verificarsi nei primi minuti a causa di cambiamenti termici o negli ultimi minuti a causa di raggiungere l'equilibrio. Se sono presenti non linearità, è possibile regolare i parametri di reazione (ad esempio, diluire la miosina, modificare la temperatura di misurazione) o semplicemente limitare l'analisi alla parte lineare dei dati.
Le non linearità possono anche essere presenti all'inizio delle reazioni se il legame dell'inibitore all'enzima ATPase è lento (che si verifica nel corso dei minuti). In questo caso, la reazione dovrebbe rallentare nel tempo come il complesso enzimatico-inibitore si accumula. Incubare la piastra di analisi prima di aggiungere la miscela di substrato, se necessario, per evitare questo problema.
Le condizioni di analisi devono essere scelte in modo tale che la parte lineare delle reazioni sia più lunga di 15 minuti. Le parti lineari più corte corrispondono a punti dati meno utili (<20, poiché la scansione dell'intera piastra richiede 45 secondi). Pertanto, gli attacchi lineari producono pendenze meno affidabili (tassi di reazione) con errori standard molto più elevati. D'altra parte, non è consigliabile ottenere letture cinetiche più lunghe di 120 minuti. Tali esperimenti potrebbero essere influenzati dalla denaturazione delle proteine o dai cambiamenti di concentrazione dovuti all'evaporazione del solvente. Questi criteri possono essere soddisfatti più facilmente regolando la concentrazione di miosina.
È importante assicurarsi che le reazioni catalizzate da PK e LDH non siano limitanti nel sistema di reazione accoppiato. Gli esperimenti di controllo eseguiti senza l'ATPase di interesse o ad alti livelli di un potente inibitore ATPase non mostrerebbero alcuna (o poca) attività. Tuttavia, l'aggiunta di ADP comporterebbe una rapida diminuzione del segnale se LDH e PK sono attivi e funzionano correttamente. Il tasso di consumo di NADH dovrebbe essere molto elevato in questo esperimento di controllo, quindi è fondamentale avviare il rilevamento il più presto possibile dopo che la reazione è stata avviata con l'aggiunta di ADP.
Si raccomanda sempre di escludere dall'analisi dei dati eventuali tassi DI ATPase osservati al di sopra della solubilità dell'inibitore. Poiché la solubilità dipende dalla temperatura, dalla purezza del composto e dalle differenze nella composizione della soluzione, si consiglia vivamente di misurarlo in condizioni che sono altamente simili alle condizioni effettive (temperatura, tampone, ecc.) sotto che viene eseguito il saggio ATPase. Il tentativo di utilizzare inibitori di piccole molecole di cui sopra solubilità può provocare precipitazioni che potrebbero influenzare i risultati (vedere Figura 4). Le precipitazioni limitano la concentrazione del composto a solubilità o vicino. Pertanto, i tassi di ATPase non possono essere ulteriormente ridotti con l'aggiunta di più inibitore. L'utilizzo di un buon controllo positivo che mostra l'inibizione del 100%, quindi, può aiutare a identificare tali anomalie nel segnale, anche se la solubilità è sconosciuta. Una grande differenza tra il tasso di reazione osservato del controllo positivo e il tasso di reazione appartenente al livello massimo di inibizione (Imax) determinato dal montaggio è sempre una buona indicazione del problema. Escludendo gradualmente sempre più dati dall'analisi e/o utilizzando il controllo positivo come homax e mantenendolo fisso durante il processo di montaggio fino a quando non si ottiene una migliore vestibilità in questi casi. Le precipitazioni inibitorie potrebbero anche provocare una forte dispersione della luce e possono anche modificare le proprietà ottiche dell'inibitore, portando a intensità di segnale osservate anormalmente elevate all'inizio delle reazioni e/o all'aumento dei segnali nel tempo. I dati grezzi devono sempre essere attentamente ispezionati e le concentrazioni interessate devono essere escluse dall'analisi.
Limitazioni del metodo
La concentrazione finale del test per ATPases con un basso numero di turnover (ad esempio, miosina cardiaca muscolare II) deve essere alta (diverse centinaia di nM) per raggiungere tassi di reazione misurabili entro la finestra di tempo del saggio (30-120 minuti). Pertanto, potrebbe essere importante utilizzare il modello di rilegatura quadratica per l'analisi delle curve dose-risposta. Altri modelli di binding (iperbolica, Hill) non sono in genere adatti per l'analisi di tali dati. Inoltre, la concentrazione dell'ATPase fissa un limite inferiore alla gamma di costanti inibitorie misurabili perché le curve di risposta alla dose si ottengono indistinguibili in pratica a causa della presenza di errori sperimentali se il KI è vicino o inferiore al concentrazione dell'ATPase.
Le differenze nelle potencie composte dovrebbero sempre essere quantificate eseguendo esperimenti dose-risposta e determinando le costanti inibitorie. Sebbene i dati di screening dei singoli punti riflettano queste differenze teoriche, la non linearità delle risposte, insieme all'errore sperimentale renderebbe estremamente difficile eseguire tale analisi. Gli esperimenti di screening a punto unico dovrebbero essere progettati per catturare anche gli inibitori relativamente deboli con alta fiducia, scegliendo una concentrazione inibitore appropriata e un livello di risposta di soglia predefinito per distinguere tra attivi e inattivi Composti.
Stabilire che le differenze tra le costanti inibitorie sono statisticamente significative è meglio eseguire riscrivendo l'equazione per la regressione non lineare per determinare pKI (-logKI) invece di KI, come pKI è normalmente distribuiti, mentre KI non è30. L'incertezza per il pKI è simmetrica, mentre non è simmetrica per KI31. Gli intervalli di confidenza possono essere calcolati per il pKI e t-test o analisi della varianza (ANOVA) può essere utilizzato per determinare se i mezzi delle misurazioni di pKI sono significativamente diversi. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si esegue tale test statistico in quanto presuppongono l'omoscedasticità (stessa varianza dei dati nei gruppi). Ci si può aspettare una maggiore varianza associata a pKI quando non è possibile ottenere una curva completa dose-risposta a causa di problemi di solubilità composta. In questo caso, devono essere utilizzati altri test statistici appropriati che non assumono variazioni uguali (ad esempio, il test t di Welch).
Qualsiasi composto inibitore PK o LDH darebbe un segnale falso positivo nel saggio ATPase accoppiato NADH. Alcuni di questi falsi positivi possono essere identificati eseguendo il saggio con un enzima ADP non correlato. In questo caso, non ci si può aspettare alcuna inibizione per i veri successi positivi, a meno che l'inibitore non sia un legame analogo ATP a entrambi gli enzimi. Per dimostrare tale analisi, abbiamo eseguito un saggio ATPase utilizzando para-aminoblebbistatin e apyrae, un enzima idrolizing ATP non correlato alla miosina (vedi Figura 5). In alternativa, è possibile eseguire un saggio funzionale diverso specifico per l'enzima di interesse o un altro saggio ATPase che non utilizza PK e LDH per distinguere tra colpi positivi reali e falsi (ad esempio, l'analisi verde malachite).
La misurazione e l'analisi della cinetica dell'intensità della fluorescenza in tutti i pozzi richiedono un lettore di lamiere abbastanza velocemente da scansionare l'intera piastra in meno di 90-60 secondi.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Opposto alla lettura "tradizionale" basata sull'assorbimento16,17,18,19,20, il saggio ATPase accoppiato NADH modificato qui presentato si basa sulla fluorescenza NADH. Questo rende il saggio più sensibile, permettendo all'utente di ridurre l'intensità della luce di eccitazione e quindi proteggere NADH o gli inibitori dalla decomposizione fotochimica.
Anche se la testazione è stata generalmente considerata non adatta per la gestione di un gran numero di campioni32, i piccoli volumi di reazione raggiunti qui (20 - L) in un formato 384-well lo rendono disponibile per applicazioni di screening semi-alto, in particolare se si considera la determinazione delle costanti inibitorie.
I metodi alternativi di solito si basano sulla rilevazione del fosfato inorganico prodotto dall'enzima ATPase. Ad esempio, [-32P]ATP può essere utilizzato come substrato per l'ATPase e, successivamente, il fosfato inorganico liberato può essere misurato in base alla sua radioattività. Il saggio è sensibile; tuttavia, richiede il trattamento di sostanze radioattive e il restante ATP deve essere separato dal fosfato inorganico (ad esempio, mediante adsorbimento dell'ATP sul carbone)33. Nel suddetto saggio saggio saggio verde malachite, il fosfato reagisce con molybdate in condizioni acide e il risultante complesso di fosfomofilpo lega il colorante verde malilita causando uno spostamento nel suo spettro di assorbimento19,21, 22,23,24. Questo metodo richiede anche la disinvolto della reazione ATPase; pertanto, viene utilizzato principalmente come endpoint-assay, soprattutto in formato ad alta velocità effettiva. In contrasto con il monitoraggio continuo della reazione ATPase nel saggio accoppiato NADH, un assaggio finale assume semplicemente corsi temporali lineari e non può rivelare artefatti che portano a non linearità. Composti che interagiscono con il verde malessere o la forma complessa può anche portare a manufatti21. Inoltre, l'esagente verde di malachite è molto sensibile alla contaminazione da fosfato24. Al contrario, l'analisi accoppiata NADH non è sensibile alla contaminazione da ADP in quanto ADP (che è sempre presente a vari livelli nei campioni ATP) viene rapidamente trasformato in ATP da PK all'inizio della reazione. Non è necessario staccare o la separazione dei prodotti. Un altro saggio fluorometrico per la misurazione dei tassi ATPase è già stato sviluppato acconciliando l'idrolisi ATP alla reazione catalizzata dal fosforo nucleoside34. Tuttavia, questo saggio non utilizza un ciclo di rigenerazione ATP, quindi la determinazione dei tassi di reazione iniziali può essere molto più impegnativa.
Applicazioni future o indicazioni del metodo
Molti enzimi che si basano sull'attività di ATPase sono stati esplorati come potenziali bersagli farmacologici. Questi includono proteine motorie citoscheletriche appartenenti alla kinesin35 e famiglie dineina36 e il DNA helicases37, tutti gli effetti terminali in diverse vie di segnalazione. Il saggio qui descritto può essere facilmente ottimizzato per la scoperta di farmaci e progetti di sviluppo che coinvolgono qualsiasi enzima catalizzare una reazione in cui ADP è un prodotto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus e Istituto Nazionale per l'abuso di droga NS096833 (CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
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