Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Abstract

ATPaz enzimleri, adenozin trifosfatta depolanan serbest enerjiyi vivo'da kendiliğinden oluşmayan çok çeşitli endergonik biyokimyasal süreçleri katalize etmek için kullanırlar. Bu proteinler metabolizma, hücre bölünmesi, çevresel değişikliklere ve harekete tepkiler de dahil olmak üzere hücre yaşamının esasen tüm yönleri için çok önemlidir. Burada sunulan protokol, küçük molekül ATPaz inhibitörlerinin yarı-yüksek iş lenme taramasına adapte edilmiş bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ile birleştirilmiş ATPaz testini tanımlar. Test, prensip kanıtı olarak iki aktin bazlı moleküler motor ATP'ler olan kardiyak ve iskelet kası miyozin II'sine uygulanmıştır. ATP'nin hidrolizi, nadh'ın oksidasyonu ile birleştiğinde, analizdeki enzimatik reaksiyonlar ile biraraya gelindiğinde. İlk olarak, ATP'ler tarafından oluşturulan ADP, pirüuvat kiaz (PK) ile ATP'ye yenilenir. PK paralel olarak piruvate fosfoenolpyruvate (PEP) geçiş katalizler. Daha sonra, pirüuvat laktat dehidrogenaz tarafından azalır (LDH), paralel olarak NADH oksidasyon katalizler. Böylece, ATP konsantrasyonundaki azalma nadh konsantrasyonundaki azalma ile doğrudan ilişkilidir ve bunu NADH'ın içsel floresansında değişim takip eder. PEP reaksiyon sisteminde mevcut olduğu sürece, ADP konsantrasyonu çok düşük kalır, kendi ürünü tarafından ATPase enziminin inhibisyonu kaçınarak. Ayrıca, ATP konsantrasyonu neredeyse sabit kalır, doğrusal zaman kursları verimli. Floresan sürekli olarak izlenir, bu da veri kalitesinin kolayca tahmin edilmesine olanak tanır ve potansiyel eserlerin (örneğin, bileşik yağış veya termal değişikliklerden kaynaklanan) filtrelenmesine yardımcı olur.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Miyozinler ökaryotlar da aktin sitoskeleton filamentleri boyunca yönlü hareket oluşturmak için adenozin trifosfat (ATP) hidrolize mekanokimyasal enerji transdüserler vardır1,2. Onlar hem yapısal hem de kinetically çeşitli hücre içi fonksiyonları adapte var, organellerin taşınması gibi, kas kasılması veya sitoskelet alçit üretimi1,2. Miyozin süper familyası insan genomundaki ~12 farklı miyozin sınıflarına ait ~40 miyozin geni ile temsil edilir3,4. Miyozin sınıflarının üyeleri çeşitli kanserler, nörolojik bozukluklar, iskelet miyopatileri ve hipertrofik kardiyomiyopati5,6gibi çok çeşitli bozukluklar kümesinde çeşitli roller oynamaktadır. Bu moleküler motorların fizyolojik ve patolojik fonksiyonları çok sayıda göz önüne alındığında, bu koşullar çeşitli için giderek ilaç hedefleri olarak kabul ediliyor şaşırtıcı değildir7. Önemli ilerleme son zamanlarda yeni miyozin inhibitörleri keşfi yapılmıştır8,9,10 ve aktivatörler11, ve mevcut olanların özelliklerini geliştirmek için12, 13.000 , 14.000 , 15. yıl.

Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz testi uzun sarcoplasmic reticulum Ca2 + pompa ATPase 16 gibiçeşitli enzimlerin ATPase aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır , DNA onarım ATPase Rad5417, AAA + ATPaz p9718 veya mikrotübül motor kinesin19. Tne bir ATP rejenerasyon döngüsü kullanır. ATPaz tarafından üretilen adenozin difosfat (ADP), fosfoenolpiriuvat (PEP) molekülünü paralel olarak pirüvetmeye dönüştüren pirüvat kinaz (PK) ile ATP'ye yenilenir. Daha sonra, pirüuvat laktat dehidrogenaz (LDH) tarafından laktat azalır. Bu da NADH molekülünün bir molekülünü NAD'a oksitler. Bu nedenle, zaman fonksiyonu olarak NADH konsantrasyonunun azalması ATP hidroliz hızına eşittir. ATP rejenerasyon döngüsü ATP konsantrasyonu neredeyse sabit ve PEP mevcut olduğu sürece ADP konsantrasyonu düşük tutar. Bu, doğrusal zaman dersleri ile sonuçlanır, bu da ilk reaksiyon oranlarını belirlemeyi kolaylaştırır ve ADP19tarafından ürün inhibisyonunun önlenmesine yardımcı olur. NADH-birleştirilmiş ATPase testi zaten 96-iyiformat20adapte edilmiş olmasına rağmen, yüksek tepki hacimleri (~ 150 μL) reaktiflerin yüksek talep nedeniyle nispeten pahalı hale, daha az çok sayıda hızlı tarama için uygun hale Bileşik. ATPaz enzimi tarafından üretilen fosfatın saptanması nda dayanan malakit yeşili çıktı19,21gibi alternatif yöntemler, minyatürleştirme ve yüksek iş lenme taraması için daha uygun olduğu kanıtlanmıştır22 , 23.000 , 24- Ancak, bir uç nokta teşbit birkaç eserler (aşağıda ele) tarafından etkilenecek tir, tam zamanlı dersler yokluğunda keşfedilmemiş kalabilir.

Burada, NADH-birleştirilmiş ATPase tsay küçük molekül inhibitörleri yarı-yüksek iş taranması için optimize edilmiştir. İskelet ve kardiyak kas miyozin II ve miyozin inhibitörleri blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 ve para-nitroblebbistatin12 NADH dayanır tasnif gücünü göstermek için kullanılır bir okuma olarak floresan. Bu protokol, enzim üreten herhangi bir ADP'ye odaklanan projelerin taranmasına olanak sağlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Stok çözümleri nin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Distile suda 1000 mM'lik son konsantrasyona kristal DTT eriterek dithiothreitol (DTT) stok çözeltisini hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  2. Distile suda 100 mM'lik son konsantrasyona kristal ATP eriterek ATP stok çözeltisini hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  3. 70 mM 3-(N-morfolino)propanülfonik asit (MOPS), 10 mM MgCl2, 0.9 mM etilen glikol-bis(β-aminoetil eter)-N,N,N′,N-tetraasetik asit (EGTA) içeren 10x NADH tampon hazırlayın 3 mM NaN3. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. 4 °C'de saklayın.
  4. 10 mM MOPS ve 0,1 mM EGTA içeren 1x miyozin tampon hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. 4 °C'de saklayın. %0.1 (w/v) son konsantrasyonuna büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ve DTT ekleyin ve 1 mM, sırasıyla, kullanmadan önce.
  5. 4 mM MOPS, 0.1 mM EGTA, 2 mM MgCl2ve 3 mM NaN3içeren 1x aktin tampon hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. 4 °C'de saklayın. %0,1 'lik son konsantrasyona BSA ve DTT ekleyin (w/v%) ve 1 mM, sırasıyla, kullanmadan önce.
  6. 10x NADH tamponundaki kristal NADH'yi 5,5 mM'lik son konsantrasyona eriterek NADH stok çözeltisini hazırlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  7. 50 mM son konsantrasyona 10x NADH tampon kristal PEP eriterek PEP stok çözüm hazırlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  8. Gliserol ve 10x NADH tampon (%50:50) karışımı nda lyophilized LDH tozu eriterek LDH stok çözeltisi hazırlayın 2000 U/mL'lik son konsantrasyona kadar. Çözünmemiş proteinleri (7.197 x g, 20 °C, 10 dk) çıkarmak için çözeltiyi santrifüj edin. Supernatant'ı temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  9. Gliserol ve 10x NADH tampon (%50:50) karışımı nda lyophilized PK tozu eriterek PK stok çözeltisi hazırlayın 10000 U/mL'lik son konsantrasyona kadar. Çözünmemiş proteinleri (7.197 x g, 20 °C, 10 dk) çıkarmak için çözeltiyi santrifüj edin. Supernatant'ı temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  10. Sırasıyla ~37.9 μM ve ~40.8 μM miyozin konsantrasyonlarına (monomerik) karşılık gelen 10mg/mL stok çözeltisi elde etmek için 100 μL distile su ekleyerek liyofilize kardiyak ve iskelet kası miyozin II örneklerini yeniden oluşturabilirsiniz. Daha fazla bilgi için üreticinin talimatlarına bakın.
  11. Pardee ve Spudich25tarafından açıklandığı gibi tavşan kas aseton tozu F-actin hazırlayın.

2. Küçük molekül inhibitörlerinin ATPaz aktivitelerinin ve inhibitör etkilerinin ölçülmesi

  1. Bileşik plaka hazırlayın.
    1. Yüksek kaliteli dimetilsülfoksit (DMSO) ilgi bileşikleri çözün.
    2. DMSO'da 10 mM bileşik konsantrasyonundan başlayarak on beş adımlı seri 1:2 seyreltmeler oluşturun.
    3. Örnekleri çok kanallı pipet kullanarak triplicatelerde (her biri 12,5°L) 384 kuyulu polipropilen plakaya aktarın. Kenar etkilerinden etkilenecek kuyu sayısını en aza indirmek için bir bileşik (üç sütun yerine) için bileşik plakaüzerinde iki satır kullanın. Her bileşik için ikinci satırdaki son üç kuyuyu negatif kontrol (yalnızca DMSO) olarak kullanın. Bileşik seyreltmeler için plakanın ilk ve son sırasını kullanmayın.
    4. Saf DMSO'yu ilk sıranın kuyularına aktarın (NADH kalibrasyonu için ayrılmıştır).
    5. Pozitif denetim için son satırı kullanın.
      NOT: Burada DMSO'da 4 mM konsantrasyonda para-aminoblebbistatin kullanılmıştır.
  2. Actin tamponunda actin stok çözeltisini seyrelterek her bir asay plakası (384 kuyulu siyah duvar polistiren mikroplaka) için 4500 μL 20 μL seyreltilmiş actin çözeltisini hazırlayın. Aktin filamentleri kırarak viskoziteyi ve heterojenliği azaltmak için 5 mL'lik pipet kullanarak 30x yukarı ve aşağı boru lar kullanarak çözeltiyi iyice karıştırın. Herhangi bir çökelmiş protein mevcut (7.197 x g, 20 °C, 10 dk) kaldırmak için çözelti santrifüj. Supernatant'ı temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
  3. LDH ve PK enzimleri içeren ana karışımı ("enzim karışımı") hazırlayın. Her tahlil plakası için, 171.4 μL LDH çözeltisi, 171.4 μL PK çözeltisi ve 3189.3 μL veya 3252.9 μL miyozin tamponunu sırasıyla kardiyak veya iskelet kası miyozin II'sini içeren tahliller için 15 mL konik santrifüj tüpünde birleştirin. Toplama ve yağış önlemek için bu noktada herhangi bir miyozin eklemeyin.
  4. Tüm substratları ("substrat karışımı") içeren ana karışımı hazırlayın. Her plaka için 15 mL konik santrifüj tüpte 162,1 μL ATP, 162,1 μL PEP ve 324,1 μL NADH çözeltisini birleştirin. Toplama ve yağış önlemek için bu noktada aktin eklemeyin.
  5. 250 μM'den başlayan kalibrasyon için YEDI adımlı seri 1:2 seyreltmelerini oluşturun.
    1. 1,5 mL mikrosentrifüge tüpte 257,7 μL miyozin tamponu ile 12,3 μL NADH stok çözeltisini karıştırın.
    2. Aliquot 135 μL miyozin tampon yedi 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine.
    3. İlk tüpten 135 μL çözeltiyi ikinci tüpe aktarın ve pipetleme ile karıştırın. 7tüp ulaşana kadar tekrarlayın.
    4. Son tüpü NO-NADH denetimi (yalnızca arabellek) olarak kullanın.
  6. 8 kanallı pipet kullanarak, NADH kalibrasyon çözeltilerinin 20 μL'sini triplicates'teki elektif plakanın ilk satırına aktarın.
  7. Enzim karışımına 68 μL kardiyak veya 4.2 μL iskelet kası miyozin II ekleyin. Girdap kısaca.
  8. İlk sıra dışında, otomatik bir dağıtıcı kullanarak, hazırlanan miyozin-enzim karışımının 8,4 μL'sini, otomatik bir dağıtıcı kullanarak, hesap plakasının her kuyusuna dağıtın.
  9. 100 nL pin alet kafası ile donatılmış otomatik sıvı taşıma sistemi kullanarak enzim karışımı içeren hesap plakasına bileşik plakadan 100 nL çözelti aktarın.
  10. Bir mikroplaka shaker kullanarak 1200 rpm oda sıcaklığında 1 dakika için titret plakası çalkalayın.
  11. Substrat karışımına santrifüjlü aktin çözeltisinin 4.052 μL'sini ekleyin. Girdap kısaca.
  12. Otomatik bir dağıtıcı kullanarak enzimatik reaksiyonu başlatmak için 11,6 μL actin-substrat karışımını hesap plakasının her kuyusuna (ilk sıra hariç) dağıtın.
  13. Bir mikroplaka shaker kullanarak 1200 rpm oda sıcaklığında 1 dakika için titret plakası çalkalayın.
  14. 30 s için 101 x g de saymanlık plaka santrifüj.
  15. Plaka okuyucusunun iç sıcaklığının 25 °C'de stabilize olduğundan emin olun. Plakayı yükleyin ve 30 s daha çalkalayın. Bu sallayarak adım her kuyuda benzer sıvı yüzeyşekli yapmak için gereklidir ve plaka ölçüm sıcaklığına ulaşmak için zaman sağlar.
  16. Plakayı 45 s aralıklarla tarayan 30 dk için NADH floresansını kaydedin. 425 nm kesme dikroik ayna ile birlikte 380 nm, 10 nm bant genişliği uyarma filtresi ve 470 nm, 24 nm bant genişliği emisyon filtresi kullanın. Ölçümü yüksek konsantrasyon modunda çalıştırın. Tahlilleri çalıştırmadan önce yanıp söner sayısını, dedektör kazancını, plaka boyutlarını ve ölçüm yüksekliğini optimize edin.
    NOT: Son tahlil koşulları 300 nM kardiyak/20 nM iskelet kası miyozin II, 10 μM aktin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP içeren bir tamponda 10 mM MOPS (pH = 7.0), 2 mMg MgCl2 , 0.15 mM EGTA, 0.1 mg/mL BSA, %0.5 (v/v) DMSO ve 1 mM DTT. Toplam hacim 20 μL/iyidir. En yüksek son bileşik konsantrasyonu 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin % 0.5 DMSO pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve 0.5% DMSO tek başına negatif kontrol. Tüm ölçümler triplicates yapılır.

3. Verileri analiz etme

  1. Her kuyu için zamana karşı gözlenen floresan yoğunluğunu çizin.
  2. Her kuyu için floresan yanıtlarının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin. Eğim ATP (NADH) tüketim oranıyla orantılıiken, kesişme ölçümün başındaki NADH konsantrasyonuyla orantılıdır (t = 0 s).
  3. PLAKANıN ilk satırı için elde edilen kesitleri NADH konsantrasyonuna karşı çizerek NADH için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Kesişmelerin DOĞRUSAL OLARAK NADH konsantrasyonuna bağlı olduğundan emin olun.
    NOT: Keserler t = 0 s'deki gerçek floresan yoğunluklarını tahmin eder ve ham floresan yoğunluğunun ortalamasından çok daha fazla güven ile t ≤ 0 s'de okunur.
  4. NADH kalibrasyon hattının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin.
    NOT: Kesişme, floresan arka plan sinyalini açıklar (NADH yok), eğim ise o deneydeki 1 M NADH çözeltisinin ekstrapolated/teorik floresan yoğunluğuna karşılık gelir.
  5. Floresan değişikliklerini ATP tüketim oranlarına dönüştürmek için NADH kalibrasyon hattının eğimi ile kuyuların geri kalanı için elde edilen floresan tepkisinin eğimini bölün.
  6. ATP tüketim oranlarını inhibitörün konsantrasyonuna göre çizin.
  7. İnhibisyon sabitlerini belirlemek için, doz-yanıt verilerini basit bire bir bağlayıcı denge modeline karşılık gelen aşağıdaki kuadratik denkleme sığdırmak için uygun istatistiksel yazılım kullanın:
    Equation 1
    nerede Y ATP tüketim oranı, Ymin atp tüketim oranı int inhibitör yokluğu, Ymax teorik ATP tüketim oranı% 100 inhibisyon, KI inhibitör sabittir , [E]t ve [I]t sırasıyla enzim (miyozin) ve inhibitör toplam konsantrasyonu vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tarama deneyleri için kullanılan tipik plaka düzeni haritası Şekil1'de gösterilmiştir. İlk ve son satırlar sırasıyla NADH kalibrasyonu ve pozitif kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin, %0.5 DMSO) için ayrılmıştır. Kalan satırlar (B'den O'ya) bileşiklerin inhibitör aktivitesini test etmek için kullanılır. Burada, DMSO'daki 10 mM bileşik konsantrasyonundan başlayarak on beş adımlı seri 1:2 seyreltmeler hazırlanır ve bileşik plakadan tahlil plakasına aktarılır, böylece en yüksek son bileşik konsantrasyonu tahlil plakasında 50 μM (%0,5 DMSO olarak) olur. Bir bileşik (48 veri noktası/bileşik) için doz-yanıt eğrisi elde etmek için iki satır kullanılır. Plaka düzeni haritalarının belirli bir projenin belirli amaçlarını destekleyecek şekilde yeniden tasarlanabileceğini unutmayın. Örneğin, amaç çok sayıda bileşik için tek noktalı tarama verileri elde etmek olsaydı, pozitif kontrol ve NADH kalibrasyonu için aynı düzeni kullanarak tek bir 384 kuyulu plaka üzerinde 112 bileşiğin test edilmesi (her biri için üçlemeler ile hesaplama bileşik). Her zaman bir bileşik (veya her konsantrasyon için) için en az 3 veri noktası olması ve bu veri noktaları kenar etkileri etkilenebilir gibi, bir bileşik için plaka kenarları boyunca sadece kuyular kullanmaktan kaçınmak için tavsiye edilir. Kenar etkilerinin önemini tahmin etmek için, her zaman yalnızca önce negatif denetime sahip tam bir plaka çalıştırın.

Floresan yoğunlukları Şekil 2A'dagösterildiği gibi NADH konsantrasyonuna doğrusal bir bağımlılığa sahiptir. Doğrusal uyumun eğimi, floresan değişikliklerini reaksiyon oranlarına dönüştürmek için veri analizi sırasında kullanılır. NADH kalibrasyonunun her bir kuyusu için elde edilen ham floresan yoğunluğu izinin önce doğrusal regresyon ile analiz edildiğini unutmayın (bileşik veriler için Şekil 2B,C'de benzer bir analiz gösterilmiştir). Bu izlerin floroforfotobeyazlatma nedeniyle zaman içinde üstel çürüme göstermesi beklenmektedir. Ancak, fotobeyazrlama çok yavaş ve bu nedenle, ham veri doğrusal uyaran tarafından analiz edilebilir. Bu fitlerin eğimi ve kesişmesi, sırasıyla t = 0 s'deki ilk fotobeyazrlama oranına ve floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Bu doğrusal fitelerin kesişmeleri, NADH kalibrasyon eğrisini oluşturmak için t = 0 s'deki ham floresan okumaortalaması yerine kullanılır, çünkü kesişmeler daha fazla veriye dayalı olarak tahmin edilir ve bu nedenle ilişkili hatalar çok daha küçüktür.

Şekil 2B,C, kullanılan miyozin veya inhibitörün varlığı ne olursa olsun, zaman derslerinin ölçümlerin zaman penceresinde doğrusal olduğunu göstermektedir. Buradaki en yüksek (50 μM) ve en düşük (0 μM) inhibitör konsantrasyonları sırasıyla ~%100 ve %0 inhibisyona karşılık gelmektedir. Ham veri miktarı nedeniyle, tek bir panelde gösterildiğinde gerçek çözümlemenin kaotik görüneceğini unutmayın. Bu nedenle, bu paneller daha iyi süreci görselleştirmek için basitleştirilmiştir. Ham floresan yoğunluğunun ortalaması tüm paralel deneyler (her konsantrasyon için üçaylık ler) için hesaplanmış ve burada NADH konsantrasyonlarına dönüştürülmüştür. Sadece 3 inhibitör konsantrasyonu gösterilmiştir. Gerçek analizde, her ham floresan yoğunluğu izi (48/bileşik test) önce doğrusal regresyon ile analiz edilir ve daha sonra eğimler ATP tüketim oranlarına dönüştürülür.

İskelet ve kardiyak kas miyozin II'lerinde şekil 2D ve Şekil2E'de gösterildiği gibi reaksiyon oranlarının enzim konsantrasyonu ile doğrusal olarak değiştiğini göstermek her zaman tavsiye edilir. Doğrusal krizlere bağlı olarak, enzimin son tahlil konsantrasyonu kolayca tahmin edilebilir. Örneğin, 30 dk-zaman kursları için ~5 x 10-8 Ms-1 reaksiyon oranı önerilir. Reaksiyon karışımlarında (burada aktin gibi) bir aktivatör kullanılıyorsa, beklenen etkinin (aktivasyonun) mevcut olduğundan emin olmak için deneylerin hem aktivatörün varlığında hem de yokluğunda çalıştırılması önerilir. Koşullar ve yordam, son protokolü mümkün olduğunca yakından takip etmelidir. Burada, miyozin bir seyreltme serisi miyozin tampon sekiz mikrosantrifüj tüpler ilk hazırlanmıştır. Daha sonra LDH ve PK enzimlerinin bir karışımı eklendi. Son olarak, reaksiyonlar çok kanallı bir pipet kullanılarak her boruya paralel olarak substrat karışımı eklenerek başlatılmıştır. Reaksiyon karışımları hemen triplicates olarak bir sıra sınamak plaka aktarıldı. Aktin yoksa, bunun yerine actin tamponu kullanılmıştır. Başka parametre değiştirilmemiştir (son tahlil koşulları için protokoldeki 2.16 adım notuna bakın).

Şekil 2F, birden fazla negatif ve pozitif kontrol reaksiyonu için elde edilen ATP tüketim oranlarını gösterir (her biri yarım plaka). Bu veriler, yüksek verimli tahlillerin kalitesini tahminetmek için yaygın olarak kullanılan istatistiksel bir parametre olan Z' değeri veya "tarama penceresi katsayısı" 26'ya göre karşılaştırılabilir. Hem araçları hem de standart sapmaları dikkate alarak pozitif ve negatif kontrolleri karşılaştırır:

Equation 2,

σn, σp ve μn, μp sırasıyla negatif ve pozitif kontrollerin standart sapmaları ve araçlarıdır. Z' değeri 0.5 ile 1 arasında düşerse iki popülasyon iyi ayrılır. Burada elde edilen Bir Z' = 0.78, talının mükemmel26olarak kabul edilebilmektedir.

İnhibitör sabitlerini belirlemek için tetkikin kullanılabileceğini göstermek için küçük molekül miyozin inhibitörü blebbistatin8 ve iki analog, para-nitroblebistatin12 ve para-aminoblebbistatin13 Şekil 3A ve Şekil 3B'degösterildiği gibi burada seçilmiştir. Blebbistatin rekabetçi olmayan, allosteric miozin inhibitörü27,28. Blebbistatin bir molekül ümültin bir motor etki alanına bağlanır ve miyozin-ADP-fosfat kompleksi stabilize ederek ATPpase döngüsünü engeller27,28. Bu nedenle, blebbistatin türevlerinin inhibitör etkileri burada basit, bire bir bağlama modeli kullanılarak modellenmiştir (protokoldeki adım 3.7'ye bakınız). ATP tüketim oranları miyozin konsantrasyonuna doğrusal bağımlılık göstermemişse bu modelin geçerli olmayabilir (bkz. Şekil 2D,E). Blebbistatin, para-nitroblebbistatin ve para-aminoblebbistatin kinetik sulu çözünürlüğü sırasıyla13olmak üzere 426 μM, 3.6 μM ve 9.3 μM olarak bildirilmiştir. Deneylerimizde bildirilen çözünürlüklerin altında veya altında sinyalde anormallik gözlenmedi; ancak, şekil4'te gösterildiği gibi, bildirilen çözünürlük değerlerinin üzerinde bibbistatin veya para-nitroblebbistatin kullanıldığında çeşitli eserler ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, çözünürlükten daha yüksek konsantrasyonlarda kaydedilen sinyal bu durumlarda veri analizinin dışında tutulmuştu. Para-aminoblebbistatin son derece çözünür, ve bu nedenle, çözünürlük bu durumda sınırlayıcı bir faktör değildi.

Son olarak, her zaman herhangi bir pozitif isabet inhibitör etkileri hedef ATPase enzimözgü olup olmadığını test etmek için tavsiye edilir. Birleştirilmiş reaksiyon sistemi ldh ve PK olmak üzere iki enzim daha kullanır ve bunlardan birinin inhibisyonu yanlış pozitif sinyalle sonuçlanır. Alakasız bir ATPaz enzimi ile ATPase testi nin çalıştırılması bu yanlış pozitif vuruşları filtrelemek için yardımcı olabilir (daha fazla öneri için, tartışmaya bakın). ADPve inorganik fosfat29üreten bir ATP hidrolize enzimi olan para-aminoblebbistatin ve apiraz, şekil5'te gösterildiği gibi böyle bir kontrol deneyini göstermek için örnek olarak kullanılmıştır.

Figure 1
Şekil 1 : Assay plakası düzeni. 250 μM konsantrasyonundan başlayarak NADH'nin yedi adımlı seri 1:2 seyreltmeleri hazırlanır ve daha sonra kalibrasyon için üç eki küçil olarak A satırına (siyah-yeşil renk gradyanı) dağıtılır. A satırının son üç kuyusu yalnızca miyozin arabelleği içerir (NADH denetimi yoktur, beyaz). Son satır (P) pozitif kontrol için kullanılır (20 μM para-aminoblebbistatin; kırmızı). Tipik bir doz-yanıt deneyi iki satır gerektirir (örneğin, B ve C). Bu nedenle, 7 doz-yanıt deneyleri tek bir 384-iyi plaka üzerinde paralel olarak çalıştırılabilir (beyaz renk degradeleri mavi ile temsil). Her örnek üç kat olarak yüklenir. Burada, en yüksek nihai bileşik konsantrasyonları 50 μM (% 0.5 DMSO) başlar. Her ikinci satırın son üç kuyusu negatif kontrol için ayrılmıştır (bileşik yok, sadece %0.5 DMSO; camgöbeği). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 : Temsilci ATPase verileri. (A) NADH'nin iki kat seyreltme serisi hazırlandı ve her ölçüm plakasının ilk satırına aktarıldı. Floresan yoğunluğu 30 dakika boyunca kaydedildi ve ham veriler basit doğrusal regresyon ile analiz edildi. Her bir regresyon hattının kesişme hattı NADH konsantrasyonuna karşı çizildi. İdeal bir durumda, t = 0 s'deki floresan yoğunluğunun kalibrasyon hattını elde etmek için kullanılabileceğini unutmayın. Ancak, ham floresan verileri çok gürültülü olsa da, kesişmeler t = 0 s'deki floresan yoğunluğunun doğru bir tahminini verir ve ilişkili standart hatası (hata çubukları olarak gösterilmiştir) çok küçüktür. (B,C) Para -aminoblebbistatinin çeşitli düzeylerde (insets) varlığında iskelet (B) ve kardiyak (C)kas miyozin II ATPase reaksiyonlarının temsili floresan yoğunluğu izleri kaydedildi. Basitlik için, veri noktaları ve hata çubukları sırasıyla üç bağımsız ölçümün ortalamasını ve ilişkili standart sapmayı temsil eder. Reaksiyon oranlarını elde etmek için basit doğrusal regresyon (düz çizgiler) uygulandı. Tipik bir doz-yanıt deneyinin 15 farklı inhibitör konsantrasyonu ve ölçüm plakasındaki triplicatelerde negatif kontrolden oluştuğunu unutmayın (bkz. Şekil 1) ve doğrusal regresyon her floresan için ayrı ayrı yapılır yoğunluk izi. Basitlik için, sadece 3 farklı konsantrasyonları burada gösterilir. (D,E) Bazal (kırmızı) ve aktin aktive (mavi) ATPaz oranları çeşitli iskelet (D) ve kardiyak (E) kas miyozin II konsantrasyonları için belirlendi. ATPaz oranları miyozin konsantrasyonuna doğrusal bağımlılık gösterir. (F) Pozitif (kırmızı) ve negatif (mavi) kontroller (her biri yarım plaka) 384 kuyuluk plaka üzerinde paralel olarak çalıştırıldı ve AtPaz testinin kalitesini değerlendirmek için Z faktörü (Z') hesaplandı. 0,78'lik Z değeri, çok iyi ayrılmış pozitif ve negatif kontrollere sahip güvenilir bir testi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 : Doz-yanıt eğrileri ve inhibitör sabitlerin analizi. Blebbistatin, para-aminoblebbistatin ve para-nitroblebbistatin inhibitör aktivitesini test etmek için kardiyak (A) ve iskelet ( B ) kas miyozin II's kullanıldı. Ham floresan verilerine basit doğrusal regresyon uygulanarak ATPaz oranları (mavi) elde edilebilmektedir. Hata çubukları montaj standart hata temsil eder ve basit bir denge bağlama modeli (kırmızı) temsil eden bir kuadratik denklem (protokolde adım 3.7 bakınız) montaj sırasında ağırlık faktörleri olarak kullanılmıştır. Çözünürlük yukarıda elde edilen veriler eserlerden etkilenmiş ve analiz dışı edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4 : Çözünürlükle ilgili eserler. (A) İskelet kası miyozin II kullanılarak ATPase tsay'ında elde edilen blebbistatin için floresan yoğunluk izleri, mevcut inhibitör miktarına bağlı olarak doğrusal azalan sinyal (mavi) gösterir. Ancak, blebbistatin çözünürlük üzerinde kullanıldığında (50 μM ilk blebbistatin konsantrasyonu), sinyalbir artış gözlendi (kırmızı), parlak floresan blebbistatin kristalleri oluşumu nedeniyle büyük olasılıkla13. (B) Blebbistatin12'ninfloresan olmayan analogu olan para-nitroblebbistatin durumunda ham floresan şiddeti izleri normal (azalan) ortaya çıkmıştır. Ancak, inhibisyon en yüksek düzeyde beklenenden çok daha düşüktü (pozitif kontrol dayalı). Bu nedenle veri analizine sadece çözünürlük (mavi) altında elde edilen reaksiyon oranları dahil edilmiştir. Çözünürlük (kırmızı) üzerinde elde edilen reaksiyon oranları, çökeltme çözeltisinde kalan inhibitörün miktarını (konsantrasyonu) sınırlanınca, belirlenen doz-tepki eğrisinden (yeşil) ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5 : Inhibitör etkileri para- iskelet kası myosin II ve apiraz ATPaz tahlillerinde aminoblebbistatin. Para-aminoblebbistatin iskelet kası miyozin II'yi 1.7 μM KI ile inhibe ederken, aynı çift reaksiyon sisteminde apiraz29 atpaz olarak kullanıldığında inhibisyon saptanmadı. Bu deney açıkça para-aminoblebbistatin miyozin özgü olduğunu ve PK veya LDH inhibe etmez, bu nedenle tespit inhibitör etkisi bir artifakı olmadığını göstermektedir. Apiraz 0.5 nM konsantrasyonda kullanıldı. Miyozin veya aktin yoktu ve reaksiyon 100 mM MOPS (pH = 7.0), 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 3 mM NaN3, 1 mM DTT ve %0.1 BSA içeren bir tamponda gerçekleştirildi. Protokolde başka değişiklik yapılmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokoldeki kritik adımlar

Plaka düzenini yalnızca negatif kontrole sahip birkaç plaka çalıştırarak optimize edin (inhibitör olmadan ATPaz reaksiyonu). Reaksiyon oranlarındaki desenler için sonuçları dikkatle inceleyin. Örneğin, bunlar "bağlayıcı olmayan" plakaların hidrofilik yüzey kaplamasındaki kenar etkileri ve/veya kusurlardan kaynaklanabilir. Bir desen gözlenirse, yapıları en aza indirmek için plaka türünü ve/veya plaka düzenini değiştirin. Örneğin, tipik bir doz-yanıt eğrisi (16 üçaylık konsantrasyonları, 48 puan toplam) ya üç sütun veya 384-iyi plaka üzerinde iki satır düzenlenebilir. Bu düzenlemeler, kenar etkilerinin etkilendiği sırasıyla 6 ve 4 veri noktası verir. Bu nedenle, satır düzenlemesi her zaman tercih edilir.

Değişiklikler ve sorun giderme

Gözlenen floresan yanıtlarının reaksiyonun tam zamanlı seyri boyunca doğrusal olması gerektiğini unutmayın. Termal değişiklikler nedeniyle ilk birkaç dakika içinde veya dengeye ulaşması nedeniyle son birkaç dakika içinde doğrusal olmayanlıklar oluşabilir. Doğrusal olmayan lar varsa, reaksiyon parametrelerini ayarlayabilir (örn. seyreltme miyozin, ölçüm sıcaklığını değiştirmek) ya da analizleri verilerin doğrusal kısmıyla sınırlandırabilir.

Inhibitörün ATPaz enzimine bağlanması yavaşsa (dakikalar içinde meydana geliyorsa) reaksiyonların başında doğrusal olmayanlıklar da mevcut olabilir. Bu durumda, enzim inhibitörü kompleksi birikir gibi reaksiyon zaman içinde yavaşlaması bekleniyor. Bu sorunu önlemek için gerekli substrat karışımı eklemeden önce bakteri plakası inkübün.

Teşp koşulları, reaksiyonların doğrusal kısmının 15 dakikadan uzun olacak şekilde seçilmesi gerekir. Daha kısa doğrusal parçalar daha az kullanışlı veri noktalarına karşılık gelir (<20, tüm plakanın taranması ~45 saniye sürer). Bu nedenle, doğrusal uyumlar çok daha yüksek standart hatalarla daha az güvenilir eğimler (reaksiyon oranları) sağlar. Diğer taraftan, ~120 dakikadan daha uzun kinetik okumalar elde etmek önerilmez. Bu tür deneyler, çözücü buharlaşmasına bağlı protein denatürasyonu veya konsantrasyon değişikliklerinden etkilenebilir. Bu kriterler miyozin konsantrasyonu ayarlayarak en kolay karşılanabilir.

PK ve LDH tarafından katalize edilen reaksiyonların birleştirilmiş reaksiyon sisteminde hız sınırlaması olmadığından emin olmak önemlidir. İlgi ATPase olmadan veya güçlü bir ATPaz inhibitörü yüksek düzeyde yapılan kontrol deneyleri hiçbir (veya az) aktivite gösterir. Ancak, LDH ve PK aktif ve doğru çalışırdurumda adp eklenmesi hızlı bir sinyal azalmasına neden olur. Nadh tüketim oranının bu kontrol deneyinde çok yüksek olması beklenmektedir, bu nedenle ADP'nin eklenmesiyle reaksiyon başlatıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede tespitişlemine başlamak çok önemlidir.

Inhibitörün çözünürlüğü üzerinde elde edilen gözlenen ATPAz oranlarının veri analizinden hariç tkullanılması her zaman tavsiye edilir. Çözünürlüğü, çözeltinin sıcaklığına, saflığına ve çözeltinin bileşimindeki farklılıklara bağlı olduğundan, çözeltinin gerçek koşullarına (sıcaklık, tampon, vb.) son derece benzer koşullarda ölçülmesi şiddetle tavsiye edilir. hangi ATPase tsay yapılır. Çözünürlük üzerinde küçük molekül inhibitörleri kullanmaya çalışmak sonuçları etkileyebilecek yağışla sonuçlanabilir (bkz. Şekil4). Yağış, bileşik konsantrasyonunun çözünürlüğe yakın veya çözünürlüğe yakın bir seviyede olduğunu sınırlar. Bu nedenle, ATPaz oranları daha fazla inhibitör eklenerek daha azaltılmaz. ~% 100 inhibisyon gösteren iyi bir pozitif kontrol kullanarak, bu nedenle, çözünürlük bilinmese bile, sinyal bu tür anomaliler belirlemek için yardımcı olabilir. Pozitif kontrolün gözlenen reaksiyon hızı ile montaj ile belirlenen maksimal inhibisyon seviyesine (Imax)ait reaksiyon hızı arasındaki büyük fark her zaman sorunun iyi bir göstergesidir. Yavaş yavaş analiz den daha fazla veri hariç ve / veya benmax olarak pozitif kontrol kullanarak ve daha iyi bir uyum elde edilene kadar montaj işlemi sırasında sabit tutmak gibi durumlarda tavsiye edilir. Inhibitör yağış da güçlü ışık saçılma neden olabilir ve aynı zamanda inhibitörün optik özelliklerini değiştirebilir, reaksiyonların başında anormal yüksek gözlenen sinyal yoğunlukları yol ve / veya zaman içinde artan sinyalleri. Ham veriler her zaman dikkatle kontrol edilmeli ve etkilenen konsantrasyonlar analizin dışında tutulmalıdır.

Yöntemin sınırlamaları

Düşük ciro numarasına sahip ATAlar için son tahlil konsantrasyonu (örneğin, kardiyak kas miyozin II) tahlil süresi içinde ölçülebilir reaksiyon oranları elde etmek için yüksek olmalıdır (30−120 dakika). Bu nedenle, doz-yanıt eğrilerinin analizi için kuadratik bağlama modeli kullanmak önemli olabilir. Diğer bağlama modelleri (hiperbolik, Tepe) genellikle bu tür verilerin analizi için uygun değildir. Ayrıca, ATP'lerin konsantrasyonu ölçülebilir inhibitör sabitlerin aralığına daha düşük bir sınır belirler, çünkü doz yanıt eğrileri, K I'e yakın veya daha az ise deneysel hataların varlığı nedeniyle pratikte ayırt edilemez hale gelmiştir. ATPAz konsantrasyonu.

Bileşik potensler arasındaki farklılıklar her zaman doz-yanıt deneyleri gerçekleştirerek ve inhibitör sabitleri belirleyerek ölçülmelidir. Tek noktalı tarama verileri teorideki bu farklılıkları yansıtsa da, yanıtların doğrusal olmayanlığı, deneysel hata ile birlikte böyle bir analizin gerçekleşmesini son derece zorlaştıracak. Tek noktalı tarama deneyleri, aktif ve inaktif ayrımı yapmak için uygun bir inhibitör konsantrasyonu ve önceden tanımlanmış bir eşik yanıt düzeyi seçerek yüksek güvene sahip nispeten zayıf inhibitörleri bile yakalamak için tasarlanmalıdır. Bileşik.

İnhibitör sabitleri arasındaki farkların istatistiksel olarak anlamlı olduğunu nisbeten anlamlı olduğunu nisbeten, pK I yerine pKI (-logKI)belirlemek için doğrusal olmayan regresyon denkleminin yeniden yazılmasıyla gerçekleştirilir. normalde dağıtılmış, KI 30değil iken . PKI için belirsizlik simetriktir, KI31için simetrik olmasa da. PK I için güven aralıkları hesaplanabilir ve pKI ölçümlerinin anlamlı olarak farklı olup olmadığını belirlemek için pKI veya varyans analizi (ANOVA) kullanılabilir. Ancak, homoscedastisite (gruplardaki verilerin aynı farkı) varsayalım gibi istatistiksel test yaparken dikkatli olunmalıdır. Bileşik çözünürlük sorunları nedeniyle tam doz-yanıt eğrisi elde edilemediğinde pKI ile ilişkili daha yüksek varyans beklenebilir. Bu durumda, eşit varyansları varsaymayan diğer uygun istatistiksel testler (örneğin, Welch'in t-testi) kullanılmalıdır.

PK veya LDH inhibe herhangi bir bileşik NADH-çift ATPase testi yanlış pozitif sinyal verecektir. Bu yanlış pozitif bazı ilgisiz bir ADP üreten enzim ile titreşme çalıştırılarak tespit edilebilir. Bu durumda, inhibitör her iki enzime de bağlanan bir ATP analogu olmadığı sürece, gerçek pozitif isabetler için herhangi bir inhibisyon beklenebilir. Böyle bir analizi göstermek için, miyozinlerle ilgili olmayan bir ATP hidrolize enzimi olan para-aminoblebbistatin ve apiraz kullanarak ATPe tahlillerini gerçekleştirdik (Bkz. Şekil5). Alternatif olarak, ilgi enzimine özgü farklı bir fonksiyonel titreşme veya PK ve LDH'yi çalıştırmayan farklı bir ATPe testi gerçek ve yanlış pozitif isabetleri (örn. malakit yeşili testi) ayırt etmek için çalıştırılabilir.

Tüm kuyularda floresan şiddetinin ölçülmesi ve analizi~ 90−60 saniyeden daha kısa bir sürede tüm plakayı tatacak kadar hızlı bir plaka okuyucu gerektirir.

Mevcut/alternatif yöntemleraçısından yöntemin önemi

"Geleneksel" emici tabanlı okuma karşı16,17,18,19,20, değiştirilmiş NADH birleştiğinde ATPase tsay burada sunulan NADH floresan dayanır. Bu, kullanıcının uyarma ışık yoğunluğunu azaltmasına ve böylece NADH'yi veya inhibitörleri fotokimyasal ayrışmaya karşı korumasını sağlayarak, tayini daha hassas hale getirir.

Test genellikle çok sayıda numunenin işlenmesi için uygun olmadığı düşünülse de32,burada 384 kuyulu bir formatta elde edilen küçük reaksiyon hacimleri özellikle yarı yüksek iş hacmi tarama uygulamaları için uygun hale getirir, özellikle inhibitör sabitlerin belirlenmesi dikkate alınıp düşünülse.

Alternatif yöntemler genellikle ATPaz enzimi tarafından üretilen inorganik fosfatın saptanması üzerine kurulur. Örneğin, [γ-32P]ATP ATPase için bir substrat olarak kullanılabilir ve daha sonra, serbest inorganik fosfat radyoaktivite dayalı ölçülebilir. Tsay hassastır; ancak, radyoaktif maddelerin işlenmesini gerektirir ve kalan ATP inorganik fosfat (örneğin, kömür üzerine ATP adsorpsiyon)33ayrılmalıdır. Yukarıda bahsedilen malakit yeşil iyat, fosfat asidik koşullar altında molybat ile reaksiyona girer ve ortaya çıkan fosfathomolybdate kompleksi onun emilim spektrumu bir kayma neden malachite yeşil boya bağlar19,21, 22,23,24. Bu yöntem aynı zamanda ATPaz reaksiyonunun söndürülmesini gerektirir; bu nedenle, özellikle yüksek iş formatında, çoğunlukla bir uç nokta-teşp olarak kullanılır. NADH-coupled satoyonundaki ATPaz reaksiyonunun sürekli izlenmesinin aksine, bir uç nokta tonu sadece doğrusal zaman derslerini varsayar ve doğrusal olmayan lara yol açan yapıları ortaya çıkaramaz. Malakit yeşili ile etkileşime girilen bileşikler veya oluşan kompleks deeserler21yol açabilir. Ayrıca, malakit yeşil irat fosfat kontaminasyonu çok hassastır24. Buna karşılık, NADH-çiftli test ADP kontaminasyonuna duyarlı değildir ( atp örneklerinde her zaman çeşitli düzeylerde bulunur) reaksiyonun başlangıcında PK tarafından hızlı bir şekilde ATP'ye dönüştürülür. Ürünlerin söndürülme veya ayrılmasına gerek yoktur. ATPe oranlarının ölçümü için bir başka florometrik töz zaten nükleozit fosforilaz34katalize reaksiyonata ATP hidrolizi kaplayarak geliştirilmiştir. Ancak, bu titreşme bir ATP rejenerasyon döngüsü kullanmaz, bu nedenle ilk reaksiyon oranlarının belirlenmesi çok daha zor olabilir.

Yöntemin gelecekteki uygulamaları veya yönleri

ATPaz aktivitesine dayanan birçok enzim potansiyel ilaç hedefi olarak araştırılmıştır. Bunlar arasında kinesin35 ve dynein ailelerine ait sitosiskelet motor proteinleri36 ve DNA helicase37 , bunların hepsi farklı sinyal yollarında terminal efektörleridir. Burada açıklanan tsay kolayca adp bir ürün olduğu bir reaksiyon katalize herhangi bir enzim içeren ilaç keşif ve geliştirme projeleri için optimize edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü ve Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü NS096833 (CAM) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17, (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125, (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6, (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8, (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39, (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43, (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299, (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351, (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1, (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53, (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277, (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24, (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321, (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7, (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169, (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327, (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279, (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12, (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31, (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161, (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52, (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307, (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266, (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7, (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11, (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter