En protokol til syntese og måling af de foto kemiske egenskaber af modulære bur forbindelser med klikbare fugt præsenteres.
Caged forbindelser muliggør foto-medieret manipulation af celle fysiologien med høj spatiotemporale opløsning. Den begrænsede strukturelle diversitet i de aktuelt tilgængelige anbringelse-grupper og vanskelighederne i forbindelse med syntetisk modifikation uden at ofre deres fotolyse effektivitet er imidlertid hindringer for at udvide det repertoire af bur forbindelser til levende celle Programmer. Da den kemiske modifikation af coumarin-typen foto-caging grupper er en lovende tilgang til fremstilling af bur forbindelser med forskellige fysiske og kemiske egenskaber, rapporterer vi en metode til syntese af klikbare bur forbindelser, der kan ændres let med forskellige funktionelle enheder via kobber (I)-katalyseret Huisgen cyklisering. Den modulære platform molekyle indeholder en (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe som en foto-caging gruppe, som udviser en høj fotolyse effektivitet i forhold til de konventionelle 2-nitrobenzyls. Der fremlægges generelle procedurer for tilberedning af klikbare bur-forbindelser indeholdende aminer, alkoholer og carboxylater. Yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og celle målretning evne kan let inkorporeres i klikbar bur forbindelser. Desuden blev de fysiske og foto kemiske egenskaber, herunder fotolyse kvante udbyttet, målt og fandtes at være overlegne i forhold til de tilsvarende BHC-bur-forbindelser. Den beskrevne protokol kan derfor betragtes som en potentiel løsning på manglen på strukturel diversitet i de tilgængelige bur-forbindelser.
Caged forbindelser er designet syntetiske molekyler, hvis oprindelige funktioner er tidsmæssigt maskeret af kovalent vedhæftet foto-flytbare beskyttelse grupper. Interessant, bur forbindelser af biologisk relevante molekyler giver en uundværlig metode til spatiotemporale kontrol af cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterede Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl ester af lejren som en membran gennemtrængelig og photolabile derivat af cAMP7. Det følgende år, Kaplan rapporterede 1-(2-nitrophenyl) ethylester af ATP (NPE-ATP) og hedder denne sammensatte “caged” ATP8. Siden da, en række fotokemisk aftagelige beskyttende grupper såsom 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (coumarin-4-yl) methyls14,15,16 er blevet anvendt til fremstilling af bur forbindelser.
Syntesen af bur forbindelser med ønskelige yderligere egenskaber såsom membran permeabilitet, vandopløselighed, og cellulære målretning evne forventes at lette celle biologiske applikationer. Da de fysiske og foto kemiske egenskaber af disse molekyler primært afhænger af den kemiske struktur af de fotokemisk flytbare beskyttelse grupper, der anvendes til at forberede dem, et mangfoldigt repertoire af foto-caging grupper er påkrævet. Men den strukturelle mangfoldighed af nuværende tilgængelige anbringelse grupper, der udviser høj fotolyse effektivitetsgevinster er begrænset. Dette kunne være en hindring for at øge brugen af bur forbindelser.
For at løse dette problem, er repertoiret af foto-caging grupper blevet udvidet med den kemiske modifikation af eksisterende photoremovable beskyttelse grupper eller udformningen af nye photolabile kromoforer med overlegne photophysical og foto kemiske egenskaber. Eksempler omfatter nitrodibenzofuran (ndbf)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (dmnpb)18,19, et calcium følsomt 2-nitrobenzyl photocage20, substitueret coumarinylmethyls (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl coumariner24), cyanine derivater (cyet-pan)25, og bodipy derivater26,27.
Derudover har vi tidligere udviklet (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe og med succes syntetiseret forskellige bur forbindelser af neurotransmittere28, anden budbringere29,30, og oligonukleotider31,32,33 udviser store en-og to-foton excitation tværsnit. Hvis yderligere egenskaber kan installeres nemt i anbringelse grupper uden at kompromittere deres lysfølsomhed, så repertoiret af bur forbindelser kan udvides34,35,36, 37,38,39. Vi designede derfor modulære bur-forbindelser, der består af tre dele, nemlig BHC-gruppen som en foto lydhør kerne, kemiske håndtag til installation af yderligere funktionaliteter og de molekyler, der skal maskeres40, 41.
Således indeholder denne artikel en praktisk metode til fremstilling af bur forbindelser af biologisk relevante molekyler. Denne protokol beskriver metoder til udarbejdelse af en klikbar platform for foto-caging grupper, indførelse af yderligere funktionaliteter til at udvide repertoiret af bur forbindelser, måling af deres fysiske og foto kemiske egenskaber, og den celle-type selektiv målretning af en klikbart bur sammensatte for yderligere cellulære applikation.
Vi har tidligere udviklet BHC bur forbindelser af forskellige biologisk aktive molekyler, der udviser høj fotolytiske effektivitetsgevinster28,45,46,47. Med det formål at udvide repertoiret af BHC anbringelse grupper, vi også rapporteret platforme af modulære bur forbindelser, der kan ændres nemt ved indførelsen af forskellige funktionelle enheder32,40,41. Denne protokol repræsenterer derfor en metode til syntese af en klikbart forløber for BHC anbringelse grupper, der kan modificeres via kobber (I)-katalyseret huisgen cyklisering. Syntesen af den klikbare forløber, paBhcCH2Oh (2), blev opnået via en fire-trins reaktions sekvens startende fra den kommercielt tilgængelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen ved denne protokol er, at der ikke er behov for besværlige rensningstrin (f. eks. kolonne kromatografiske separationer).
Som klikbare forløber pabhcch2Oh (2) kan bruges til at maskere forskellige funktionelle grupper, klikbare bur forbindelser af aminer, alkoholer, og carboxylsyrer blev syntetiseret ved hjælp af 2 som forløber (figur 1b). Aminer blev modificeret som deres carbamater, mens alkoholer blev modificeret som deres carbonater. I generelle procedurer 1 og 2 blev CDI anvendt til fremstilling af klikbare carbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformat blev anvendt til fremstilling af carbonater. Som det fremgår af reaktions mekanismen, kan begge reagenser anvendes til fremstilling af carbamater og carbonater. Det skal også bemærkes, at udbyttet af den ønskede bur sammensatte afhænger af den kemiske struktur af molekyle, der skal bur. Andre eksempler kan ses i vores tidligere rapporter28,30,33,48.
Klik på ændring blev derefter udført ved hjælp af en mindre ændring af den rapporterede procedure49. Tilsætning af tris (triazolylmethyl) Amin-baserede ligander er nødvendig for at opnå de ønskede produkter i god til høje udbytter. Da en række azider er let tilgængelige både fra kommercielle kilder og fra litteratur procedurer, kan vi forberede forskellige modulære bur forbindelser med yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og cellulære målretning evne (figur 2).
Kvante udbyttet af photolyse blev derefter målt i henhold til en rapporteret procedure28,50. Figur 3 viser, at det fotolytiske forbrug af 2-GLC-paBhcmoc-PTX og frigivelsen af PTX var tilnærmende ved en enkelt eksponentiel henfald og stigning, hvilket antyder, at der ikke var nogen indre filtrering af strålingen eller uønskede sekundære virkninger. Der blev observeret forbedrede kvante udbytter (Φ) og fotolyse-effektivitet (εφ) for de klikbare pabhc-bur-forbindelser sammenlignet med de tidligere rapporterede BHC-bur-forbindelser (tabel 1)41 . 43. da fotolysis-effektiviteten (εφ) af BHC-bur-forbindelser er mere end 100 gange højere end for 2-nitrobenzyl-type-bur-forbindelser48, er den markante forbedring på grund af tilstedeværelsen af pabhc-anbringelse-grupper klart en fordel for dette system.
Som et proof-of-concept-eksperiment blev en hydrofile-delen introduceret i 2 ‘-paBhcmoc-PTX (4) og en cellulær målrettethed blev introduceret i sammensatte 3 (figur 2). Vandopløseligheden af 2-GLC-paBhcmoc-PTX var 650 gange højere end for moderselskabet PTX (tabel 1). Selektiv cellulær målretning blev opnået ved hjælp af et tag-Probe system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) med halotag ligand blev med succes målrettet til cellemembranen af dyrkede pattedyrsceller, der udtrykker halotag/EGFR fusion protein ( Figur 4). Foto medieret graduering af den subcellulære lokalisering af en kinase blev også opnået ved hjælp af et klikbart bur sammensatte 5 (figur 5).
Afslutningsvis, vi med succes demonstreret en metode til fremstilling af klikbare platforme for foto-caged forbindelser af biologisk interessante molekyler, der kan ændres nemt med yderligere egenskaber, såsom vandopløselighed og en cellulær målretning evne. Da pabhc anbringelse-gruppen kan anvendes til at forberede eventuelle molekyler med modificerbare funktionelle grupper, er anvendelsen af denne protokol ikke begrænset til de molekyler, der er beskrevet heri. Ved hjælp af en modulær platform, nemlig pabhc anbringelse gruppe, de ønskede bur forbindelser kan let forberedes, og deres fysiske og kemiske egenskaber kan moduleres via Click modifikation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en støtte til videnskabelig forskning i innovative områder “Memory dynamik” og JP19H05778 (TF), “MolMovies.”
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |