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Chemistry

क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों के डिजाइन, संश्लेषण, और फोटोकेमिकल गुण

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

Summary

क्लिक करने योग्य moieties के साथ मॉड्यूलर बंदी यौगिकों के photochemical गुणों के संश्लेषण और माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

Abstract

पिंजरा यौगिकों उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ सेल शरीर क्रिया विज्ञान के फोटो मध्यस्थता हेरफेर सक्षम. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध caging समूहों की सीमित संरचनात्मक विविधता और उनके photolysis क्षमता त्याग के बिना सिंथेटिक संशोधन में कठिनाइयों लाइव सेल के लिए बंदी यौगिकों के प्रदर्शनों का विस्तार करने के लिए बाधाएं हैं अनुप्रयोगों. के रूप में coumarin-प्रकार फोटो-केजिंग समूहों के रासायनिक संशोधन विविध भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ बंदी यौगिकों की तैयारी के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है, हम क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों कि संशोधित किया जा सकता के संश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट तांबे के माध्यम से विभिन्न कार्यात्मक इकाइयों के साथ आसानी से (मैं)-catalyzed Huisgen चक्रीकरण. मॉड्यूलर मंच अणु एक (6-ब्रोमो-7-hydroxycoumarin-4-yl) मिथाइल (Bhc) समूह एक फोटो-केजिंग समूह है, जो पारंपरिक 2-नाइट्रोबेन्ज़िल के उन लोगों की तुलना में एक उच्च फोटो अपघटन दक्षता दर्शाती है के रूप में शामिल हैं। amines युक्त क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों की तैयारी के लिए सामान्य प्रक्रियाओं, alcohols, और carboxylates प्रस्तुत कर रहे हैं. अतिरिक्त गुण जैसे पानी घुलनशीलता और सेल लक्ष्यीकरण क्षमता को आसानी से क्लिक करने योग्य पिंजरित यौगिकों में शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, भौतिक और photochemical गुण, photolysis क्वांटम उपज सहित, मापा गया और इसी Bhc बंदी यौगिकों के उन लोगों से बेहतर पाया गया. इसलिए वर्णित प्रोटोकॉल उपलब्ध पिंजरा यौगिकों में संरचनात्मक विविधता की कमी के लिए एक संभावित समाधान माना जा सकता है.

Introduction

बंदी यौगिकों सिंथेटिक अणुओं जिसका मूल कार्यों को सहसंयोजक रूप से संलग्न फोटो हटाने योग्य सुरक्षा समूहों द्वारा अस्थायी रूप से नकाबपोश कर रहे हैं डिजाइन किए हैं. दिलचस्प बात यह है कि जैविक रूप से संबंधित अणुओं के पिंजरित यौगिक कोशिकीय शरीर क्रिया विज्ञान1,2,3,4,5 के स्थैरिक नियंत्रण के लिए एक अनिवार्य विधि प्रदान करते हैं। ,6. 1977 में, Engels और Schlaeger एक झिल्ली पारगम्य और कैम्प7के photolabile व्युत्पन्न के रूप में कैम्प के 2-nitrobenzyl एस्टर की सूचना दी. अगले वर्ष, Kaplan ATP (एनपीई-एटीपी) के 1-(2-nitrophenyl) एस्टर की सूचना दी और इस परिसर का नाम "कैद" एटीपी8. तब से, फोटोकेमिकल रूप से हटाने योग्य सुरक्षा समूहों की एक श्रृंखला जैसे 2-नाइट्रोबेन्जिल्स, पी-हाइड्रॉक्सीफेनासिल्स9, 2-(2-निट्रोफेनिल)एथिल10, 11,7-नाइट्रोइनोलिन-1-yls12, 13, और (कुमारिन-4-yl)मेथिल14,15,16 का उपयोग पिंजरित यौगिकों की तैयारी के लिए किया गया है।

इस तरह के झिल्ली पारगम्यता, पानी घुलनशीलता, और सेलुलर लक्ष्यीकरण क्षमता के रूप में वांछनीय अतिरिक्त गुणों के साथ पिंजरा यौगिकों के संश्लेषण सेल जैविक अनुप्रयोगों की सुविधा की उम्मीद की जाएगी. चूंकि इन अणुओं के भौतिक और फोटोकेमिकल गुण मुख्य रूप से उन्हें तैयार करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले फोटोकेमिकल हटाने योग्य सुरक्षा समूहों की रासायनिक संरचना पर निर्भर करते हैं, इसलिए फोटो-केजिंग समूहों की एक विविध प्रदर्शनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध caging समूहों है कि उच्च photolysis क्षमता प्रदर्शन की संरचनात्मक विविधता सीमित है. यह बंदी यौगिकों के उपयोग को बढ़ाने के लिए एक बाधा हो सकती है।

इस मुद्दे को हल करने के लिए, फोटो-केजिंग समूहों के प्रदर्शनों का विस्तार मौजूदा फोटोरिमोबल रक्षण समूहों के रासायनिक संशोधन या बेहतर फोटोफिजिकल और फोटोकेमिकल गुणों के साथ नए फोटोलेबिल क्रोमोफोर्स के डिजाइन द्वारा किया गया है। उदाहरण ों में शामिल हैं नाइट्रोडीबेन्जोफरन (एनडीबीएफ)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-2-butyl] (DMNPB)18,19, एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील 2-नाइट्रोबेन्ज़िल फोटोकैज20, प्रतिस्थापित coumarinylhils (DEAC45021 , डीईएडीसीसीएम22, 7-एज़ेटिटिनिल-4-मेथिलकोमारिन23, और स्टिरिल कूमारिन24, सायनीन डेरिवेटिव्स (साइट-पैन)25, और बोडीपी डेरिवेटिव26,27.

इसके अलावा, हमने पहले (6-ब्रोमो-7-हाइड्रोक्सीकोमारिन-4-yl) मिथाइल (Bhc) समूह विकसित किया और न्यूरोट्रांसमीटर के विभिन्न पिंजरित यौगिकों को सफलतापूर्वक संश्लेषितकिया 28, दूसरा दूत29,30, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स31,32,33 बड़े एक और दो-फोटोन उत्तेजना पार वर्गों का प्रदर्शन। यदि अतिरिक्त गुण उनकी photosensitivity समझौता किए बिना caging समूहों में आसानी से स्थापित किया जा सकता है, तो बंदी यौगिकों के प्रदर्शनों का विस्तार किया जा सकताहै 34,35,36, 37,38,39. इसलिए हम मॉड्यूलर पिंजरा यौगिकों कि तीन भागों शामिल डिजाइन, अर्थात् एक फोटो प्रतिक्रियाकोर कोर के रूप में Bhc समूह, अतिरिक्त functionalities की स्थापना के लिए रासायनिक संभालती है, और अणुओं कि नकाबपोश किया जा करने के लिए कर रहे हैं40, 41.

इस प्रकार, यह लेख जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं के पिंजरित यौगिकों की तैयारी के लिए एक व्यावहारिक विधि प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल फोटो-केजिंग समूहों के लिए एक क्लिक करने योग्य मंच की तैयारी के लिए तरीकों का वर्णन करता है, अतिरिक्त कार्यक्षमताओं की शुरूआत के लिए बंदी यौगिकों के प्रदर्शनों का विस्तार, उनके भौतिक और photochemical की माप गुण, और आगे सेलुलर आवेदन के लिए एक क्लिक करने योग्य बंदी यौगिक के सेल प्रकार चयनात्मक लक्ष्यीकरण.

Protocol

1. क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों के लिए मॉड्यूलर caging paBhc समूह का संश्लेषण28,41

  1. की तैयारी (6-ब्रोमो-7-hydroxycoumarin-4-yl) मेथिल क्लोराइड (Bhc-CH2Cl)
    1. एक 100 एमएल गोल नीचे एक हलचल पट्टी से सुसज्जित फ्लास्क में 4-bromoresorcinol (9.742 ग्राम, 51.5 mmol) प्लेस।
    2. फ्लास्क में कॉन्क एच2SO4 (98%, 30 एमएल) जोड़ें और मिश्रण को भंग करने के लिए हिलाएं।
    3. एथिल 4-क्लोरोऐसीटेट (10 एमएल, 74 एमएल) ड्रॉपवार जोड़ें।
    4. 5 दिनों के लिए परिवेश के तापमान पर मिश्रण सरगर्मी जारी रखें.
    5. अलग से, एक 500 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में कुचल बर्फ क्यूब्स ($200 एमएल) जगह है।
    6. बर्फ में प्रतिक्रिया मिश्रण डालो और 30 मिनट के लिए जोरदार हलचल जब तक एक पतले पाउडर वेग प्राप्त है.
    7. वैक्यूम निस्पंदन के माध्यम से वेग ले लीजिए। हल्के भूरे रंग के वेग को पांच बार पानी से धो लें।
    8. एक हल्के भूरे रंग के पाउडर (13.57 ग्राम, 46.9 mmol) के रूप में BhcCH2Cl उपज करने के लिए रात भर वैक्यूम के तहत वेग सूखी।
  2. की तैयारी (6-ब्रोमो-7-hydroxycoumarin-4-yl)मेथेनॉल (Bhch2OH)
    1. एक एल गोल-नीचे फ्लास्क में तैयार BhcCH2Cl (1.1440 ग्राम, 3.95 mmol) और 1 M HCl (300 एमएल) रखें। मिश्रण को 140 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए हिलाएं। इस समय के बाद, परिवेश के तापमान के लिए मिश्रण ठंडा.
    2. वैक्यूम के तहत रोटरी वाष्पीकरण द्वारा प्रतिक्रिया से पानी निकालें BhcCH2OH (1) एक हल्के भूरे रंग के पाउडर के रूप में उपज (1.0359 g, 3.82 mmol, 97% उपज).
      नोट: BhcCH2Cl के प्रति 1 m HCl के 250 एमएल का उपयोग एक संतोषजनक परिणाम देता है।
  3. paBhch2OH (2) मैनिच प्रतिक्रिया के माध्यम से तैयारी
    1. 50 एमएल गोल-नीचे फ्लास्क में पैराफॉर्मेल्डिहाइड (446.4 मिलीग्राम, 14.9 मिलीग्राम) रखें। फ्लास्क में एनहाइड्रोस इथेनॉल (5 एमएल) और एन-मेथिलप्रोपर्ग्यालामाइन (1.25 एमएल, 14.8 एममोल) जोड़ें।
    2. एक अर वातावरण के तहत 1 ज के लिए परिवेश के तापमान पर मिश्रण हिलाओ.
    3. फ्लास्कमेंBhcCH 2 OH (1) (1.367 g, 5.04 mmol) जोड़ें। एक ब्लॉक हीटर उपकरण के साथ 80 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण गर्मी, और एक Ar वातावरण के तहत 2 एच के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सरगर्मी जारी है.
    4. ब्लॉक हीटर बंद करो और कमरे के तापमान के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण ठंडा.
    5. वैक्यूम निस्पंदन द्वारा परिणामी हल्के भूरे-पीले वेग को एकत्र करें। एहाइड्रोस इथेनॉल (1 एमएल हर बार) की एक छोटी राशि के साथ दो बार वेग धो लें।
    6. paBhch2OH (2) (1.393 g, 3.96 mmol) उपज के लिए निर्वात के तहत अतिरिक्त इथेनॉल निकालें।

2. क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों की तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं hydroxyl युक्त अन्य क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों की तैयारी के लिए लागू किया जा सकता है, एमिनो, और carboxylate कार्यात्मक समूहों.

  1. सामान्य प्रक्रिया 1: एक क्लिक करने योग्य बंदी amine की तैयारी
    1. 30 एमएल गोल तले वाले फ्लास्क में प्लेस paBhcCH2OH (2) (709.6 मिलीग्राम, 2.02 मिलीग्राम) और एन,एन-कार्बोनिल डाइमिडाज़ोल (सीडीआई, 397.6 मिलीग्राम, 2.45 एममोल)। सूखी CH2Cl2 (6 एमएल) जोड़ें और 1 ज के लिए परिवेश के तापमान पर समाधान हलचल.
    2. जोड़ें 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324.8 मिलीग्राम, 2.66 मिलीग्राम) और tert-butyl (6-aminohexyl) carbamate (533.1 mg, 2.46 mmol). 3 ज के लिए परिवेश के तापमान पर समाधान हिलाओ।
    3. निर्वात के तहत एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग विलायक और अन्य अस्थिर सामग्री निकालें। सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके सीधे अवशेषों को शुद्ध करें।
  2. सामान्य प्रक्रिया 2: एक क्लिक करने योग्य बंदी शराब की तैयारी
    1. एक 30 एमएल राउंड-नीचे फ्लास्क में एक 30 एमएल राउंड-नीचे फ्लास्क में एक 3-वे स्टॉपकॉक और एक अर गुब्बारा से लैस paclitaxel (PTX, 48.7 मिलीग्राम, 0.057 mmol) रखें। सूखी सीएच2सीएल2 (1 एमएल), 4-डीमैप (17.1 मिलीग्राम, 0.14 मिलीग्राम) और 4-नाइट्रोफेनिल क्लोरोफ्लोरेट (26.0 मिलीग्राम, 0.13 एममोल) जोड़ें।
    2. एक अर वातावरण के तहत 2.5 एच के लिए परिवेश के तापमान पर समाधान हिलाओ.
    3. समाधान के लिए 4-डीमैप (15.7 मिलीग्राम, 0.13 मिमोल) और paBhch2OH (2) (39.1 मिलीग्राम, 0.111 mmol) जोड़ें। 17 ज के लिए परिवेश के तापमान पर मिश्रण सरगर्मी जारी रखें।
    4. मिश्रण में CHCl3 (10 एमएल) और 15% जलीय NaHCO3 (5 एमएल) जोड़ें। मिश्रण को लगभग 3 मिनट के लिए जोर से हिलाएं। एक पिपेट के साथ जलीय परत निकालें।
    5. जैविक परत युक्त फ्लास्क में 0.5 एम साइट्रिक एसिड (5 एमएल) जोड़ें। मिश्रण हिलाओ और ऊपर के रूप में जलीय परत को हटा दें.
    6. चरण पृथक्करण स्तंभ का उपयोग करके ऑर्गेनिक परत को अलग करें. वैक्यूम के तहत एक रोटरी वाष्पित्र के साथ सॉल्वैंट्स निकालें। मानक सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर उत्पाद को शुद्ध करें।
  3. सामान्य प्रक्रिया 3: एक क्लिक करने योग्य बंदी carboxylic एसिड की तैयारी
    1. शुष्क सीएच2सीएल 2(2एमएल) में आर्किडोनिक एसिड (33.0 डिग्री सेल्सियस, 0.100 एममोल), paBhch2OH ( 2 ) (39.6 मिलीग्राम, 0.112 mmol), और 4-DMAP (14.1 मिलीग्राम, 0.115 mmol) को भंग करें। एन,एन, एन -diisopropylcarbodiimide जोड़ें (डीआईपीसी, 17.0 $L, 0.110 mmol) और 140 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर समाधान हलचल.
    2. निर्वात के तहत विलायक निकालें. सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके सीधे अवशेषों को शुद्ध करें।

3. क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों में एक कार्यात्मक इकाई की स्थापना

  1. आयन-विनिमयित जल (आईईडब्ल्यू, 10 एमएल) में कॉपर (II) सल्फेट पेंटाहाइड्रेट (249 मिलीग्राम) को भंग करके 0.1 एम क्यूओ4 समाधान दिया जा सकता है।
  2. भंग 2-paBhcmoc-PTX (8.0 मिलीग्राम, 6.5 [मोल), tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA, 17.5 mg, 40.3 [mol), सोडियम एल-एसकॉर्बेट (162.4 मिलीग्राम, 0.825 mmol), और 15-क्लोरो-3,6,9-trioxapentadel azide (3.1 mg, 1]) में 0 बफर (2.5 एमएल, पीएच 7.2) और डाइमेथिल सल्फाइड (डीएमएसओ, 0.5 एमएल)।
  3. 0ण्1 उ क्यूसो4 विलयन (81ण्2 ल्, 8ण्1$मोल) को अभिक्रिया मिश्रण में मिलाइए। 80 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर मिश्रण हिलाओ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी।
  4. 75% एसीटोनिट्रिल/जल समाधान (3.5 एमएल) जोड़कर वेग को भंग करें। वांछित उत्पाद को शुद्ध करने के लिए सीधे अर्द्ध-पूर्व तैयारी HPLC प्रणाली के लिए जिसके परिणामस्वरूप समाधान लागू करें।
    नोट: tert-butanol के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण का Solubilization प्रतिक्रिया की प्रगति में तेजी लाने कर सकते हैं.

4. बंदी यौगिकों की फोटोलिटिक अनकमिंग प्रतिक्रिया

  1. स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. 10 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए डीएमएसओ (500 एल) में वांछित पिंजरा यौगिक (5 डिग्री मोल) को भंग करें। प्रत्येक विलयन (10 डिग्री सेल्सियस) के एक ऐलिकोट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वितरित करें और उपयोग करने से पहले तक फ्रीजर ($20 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
    2. 6 mM K3[F2O4)3] (100 एमएल): 80 एमएल जल में पुन: क्रिस्टलीकृत पोटैशियम फेरियोक्सालेट (0.295 ग्राम, 0ण्675 एममोल) को भंग करें। जोड़ें 0.5 M H2SO4 (10 एमएल) और IEW की एक उचित राशि 100 एमएल करने के लिए मात्रा बनाने के लिए.
      नोट: पोटेशियम फेराऑक्सैलेट को गर्म पानी से पुनः क्रिस्टलीकरण के माध्यम से शुद्ध किया जाना चाहिए और अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए। ट्राइहाइड्रेट के रूप में पुन: क्रिस्टलीकृत पोटेशियम फेराऑक्सालेट प्राप्त किया जाता है; अतः इसका सूत्र K3[C2O4)3]3H2O और 491.24 का सूत्र भार स्टॉक समाधान तैयार करने के दौरान विचार किया जाना चाहिए। 510 एनएम पर इसके अवशोषण को मापने के द्वारा 6 एमएम समाधान की शुद्धता की जाँच करें। यदि अवशोषण है और 0.02, यह प्रयोग में उपयोग के लिए उपयुक्त है.
    3. 0.1% बफर-फेन (30 एमएल): नाओएसी को भंगकरें 3एच 2ओ (7.35 ग्राम), 1,10-फेनथ्रोलाइन (फेन)] एच2ओ (30 मिलीग्राम), और IEW (20 एमएल) में एच2एसओ4 (0.9 एमएल)। 30 एमएल करने के लिए वॉल्यूम बनाने के लिए IEW जोड़ें।
      नोट: समाधान 1.8 एम NaOAc, 0.54 एम एच2SO4,और 0.1% 1,10-phenanthroline शामिल हैं।
  2. फेरियोऑक्सलेट एक्टिनोमिति का उपयोग करके फोटॉनों की संख्या का मापन
    1. एक क्वार्ट्ज क्यूवेट में 6 एमएम K3[Fe (C2O4)3] (ट1 एल ) रखें। 5 s के लिए 350 एनएम प्रकाश के साथ समाधान विकिरण।
    2. एक l [cm] पथ लंबाई के साथ एक Pyrex cuvette करने के लिए विकिरणित समाधान स्थानांतरण।
    3. विकिरणित नमूना समाधान के लिए 0.1% बफर-फेन(वी2 एल) जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 510 एनएम पर नमूने के अवशोषण को मापने। प्रति इकाई समय औसत अवशोषण परिवर्तन की गणना करें ([A510 [s]1]).
    4. निम्न समीकरण के अनुसार उत्पन्न फे2+ आयनों की संख्या की गणना करें।
      nFe2 + [mol s]1] (( V1 + V2) [L] [ ] [A510 [s]]/(l [cm] ] ]510 [L mol ] 1 cm[1 ]
      जहाँ (ट1 ़ ट2) अवशोषण माप के लिए नमूने का आयतन है, स कुवट की प्रकाशिक पथ लंबाई है, और र्510 फे 2़की मोलर अवशोषणशीलता है - 510 एनएम पर फेन परिसर.
      नोट: विशिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, ट1 के मान 2ण्0 र् 10 $3 ल, ट2 र् 0ण्33 र्े 10े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े cm]1 का उपयोग किया गया.
    5. निम्नसूत्र का उपयोग करके नमूने (I0) तक पहुँचने वाले फोटॉनों के मोल्स की संख्या की गणना करें:
      मैं0 [आइंस्टीन सेमी ]2 s[1] nFe2 +/
      जहाँ 350 द.उ. पर फेरिऑक्सालेट की प्रकाश-अपघटन की क्वांटम दक्षता है।
      नोट: हालांकि 350 एनएम पर पोटेशियम फेराऑक्सालेट एक्टिनोमीटर की क्वांटम दक्षता की सूचना नहीं है, 358 एनएम पर 1.2542 की रिपोर्ट मूल्य कार्यरत था।
  3. क्वांटम दक्षता माप पर 350 एनएम
    1. के-एमओपीएस में 0.1% DMSO युक्त 10 डिग्री एम पी एस समाधान देने के लिए K-MOPS बफर (pH 7.2, 10 एमएल) के साथ नमूना स्टॉक समाधान (DMSO में, 10 डिग्री सेल्सियस) को हल करें।
      नोट: K-MOPS बफर 100 एमएम KCl और 10mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic एसिड (Mops) को KOH के साथ पीएच 7.2 के लिए titrated शामिल थे।
    2. विलयन(ट1 ल) के एक ऐलिकोट को रासायनिक ऐक्टिनोमीटर की प्रकाश प्रतिक्रिया में प्रयुक्त एक ही कव्टेट में स्थानांतरित करें। चरण 4.2.1 में वर्णित के रूप में एक ही सेटअप का उपयोग कर नमूना समाधान Irradiate।
    3. समय-समय पर विकिरणित समाधान से एक एलिकोट (50 जेडएल) निकालें और एचपीएलसी का उपयोग करके विश्लेषण करें।
    4. विकिरण समय का निर्धारण, सेकंड में, जिसमें प्रारंभिक सामग्री का 90% प्रतिक्रिया व्यक्त की (t90%) प्रारंभिक सामग्री के समय पर निर्भर गायब होने के भूखंडों फिटिंग द्वारा.
      नोट: विकिरणित नमूने के अवशोषण को और भी बनाए रखा जाना चाहिए ताकि विकिरण की आंतरिक फ़िल्टरिंग की उपेक्षा की जा सके। यह वांछनीय है कि प्रारंभिक सामग्री के फोटोअपिक खपत एकल-अनुमानात्मक क्षय द्वारा अनुमानित किया जा सकता है ताकि कोई अवांछित माध्यमिक प्रभाव है कि photolysis प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप है.
    5. निम्नलिखित समीकरण28का उपयोग करते हुए गायब होने की क्वांटम उपज की गणना करें -
      [dis ] 1/(t90% ] I0 ]350)
      जहाँ t90% [s] विकिरण समय है जिसमें 90% प्रारंभिक सामग्री का उपभोग किया गया था, मैं0 [आइंस्टीन सेमी ]2 s[1] फोटॉनों के मोल्स की संख्या है, और [350 [cm 2 मोलख्1डिग्री 350 दउ पर नमूने का दशकीय विलुप्ति गुणांक है।
      नोट: [350 [cm2 mol]1] 103350 [M]1 सेमी]1].

5. एक हेलोटैग लिगन्ड के साथ एक क्लिक करने योग्य बंदी यौगिक का लक्ष्यीकरण

नोट: उपयोग करने से पहले, Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम में Hela कोशिकाओं को बनाए रखने (DMEM, कम ग्लूकोज, सोडियम pyruvate, l-glutamine) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त के साथ पूरक (streptomycin सल्फेट, पेनिसिलिन जी, और amphotericin) पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2|

  1. माध्यम निकालें और trypsinize कोशिकाओं trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड के साथ इलाज के द्वारा (EDTA, 1 एमएल) 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर. कोशिकाओं के लिए DMEM (4 एमएल) जोड़ें और धीरे से पाइप द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित. बीज लगभग 5 $ 105 कोशिकाओं DMEM में 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन में प्रति पकवान (2 एमएल) 24 ज transfection से पहले.
  2. चार व्यंजनों के लिए, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में, कम सीरम मध्यम (700 $L) में प्लाज्मिड डीएनए (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 डिग्री ग्राम) पतला. अलग-अलग, कम सीरम माध्यम (150 डिग्री सेल्सियस) में lipofection अभिकर्मक (5 डिग्री सेल्सियस) चार ट्यूबों में से प्रत्येक में पतला और उन्हें 5 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर खड़े होने की अनुमति.
  3. पतला लिपोफेक्शन अभिकर्मक नमूनों में से प्रत्येक के लिए पतला प्लाज्मिड डीएनए (150 जेडएल) का एक हिस्सा जोड़ें। 5 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर इनक्यूबेट।
  4. 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को बनाए रखने के बाद, DMEM aspirate और फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस, 2 एमएल) के साथ कोशिकाओं कुल्ला। कम सीरम मध्यम (1.5 एमएल) जोड़ें.
  5. प्रत्येक डिश के लिए प्लाज्मिड-लिपोफेक्शन अभिएजेंट (150 डिग्री सेल्सियस) जटिल जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 48 एच के लिए बनाए रखें।
  6. माध्यम को प्रेरित करें, ताजा तैयार डीएमईएम (1 एमएल) के एक हिस्से को जोड़ें जिसमें 2 $M paBhc-hex-FITC/Halo शामिल है, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. पिंजरे में यौगिक युक्त माध्यम को प्रेरित करें और किसी भी असीमित यौगिकों को हटाने के लिए पीबीएस + (1 एमएल प्रति कुल्ला) के साथ दो बार कोशिकाओं को कुल्ला करें। कम सीरम माध्यम (500 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और कोशिकाओं में प्रवेश करने वाले यौगिकों को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: पीबीएस + फॉस्फेट-बफर नमकीन 2 एमएम CaCl2 और 1 m M MgCl2के साथ पूरक है।
  8. मध्यम निकालें और कोशिकाओं को पीबीएस + (1 एमएल) के साथ दो बार कुल्ला। किसी माध्यम (1 एमएल) का एक भाग जोड़ें जिसमें फीनॉल लाल नहीं होता है। लेजर स्कैनिंग confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा रिकॉर्ड फ्लोरोसेंट छवियों।

6. एक क्लिक करने योग्य बंदी यौगिक का उपयोग कर एक kinase स्थानीयकरण के Photomediated मॉडुलन

नोट: उपयोग करने से पहले, हैम एफ-12 मध्यम में CHO-K1 कोशिकाओं को बनाए रखने के 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 10% FBS के साथ पूरक.

  1. DMSO में paBhc-AA (5) के एक 100 डिग्री कार्य समाधान (1 m)।
    नोट: यौगिक के एक 10 मीटर स्टॉक समाधान तैयार है और एक फ्रीजर में संग्रहीत (-20 डिग्री सेल्सियस) है।
  2. बीज लगभग 5 $ 105 कोशिकाओं DMEM में 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन में प्रति पकवान (2 एमएल) 24 ज transfection से पहले.
  3. Transfect CHO-K1 कोशिकाओं GFP के लिए एक प्लाज्मिड कोडिंग के साथ-DGK$ 48 एच uncaging प्रयोगों से पहले.
    नोट: Transfection चरण 5.2-5.5 के अनुसार किया जाता है.
  4. मध्यम को कम सीरम माध्यम (2 एमएल) से बदलें। 100 डिग्री paBhc-AA काम कर समाधान (20 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और 5 मिनट और 1 एच के बीच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: लोडिंग समय नियोजित यौगिक पर निर्भर करता है।
  5. एक उलटा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के उद्देश्य चरण पर कोशिकाओं को एक दोहरी प्रकाश स्रोत फ्लोरोसेंट प्रदीपक के साथ सुसज्जित रखें.
  6. प्रत्येक 10 s. एक फ्लोरोसेंट छवि ले लो. एक उपयुक्त समय के लिए एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से 330-385 एनएम प्रकाश के साथ कोशिकाओं को विकिरण. वैकल्पिक रूप से, लचीला क्वार्ट्ज फाइबर के माध्यम से एक Xe दीपक का उपयोग कर 405 एनएम प्रकाश के साथ कोशिकाओं विकिरण.
  7. 10 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए जारी रखें।

Representative Results

आर्चिडोनिक अम्ल और पैलिटेक्ले सहित कुछ जैविक रूप से रोचक अणुओं के क्लिक करने योग्य पिंजरित यौगिक सफलतापूर्वक संश्लेषित किए गए (चित्र 1)28,41. पानी घुलनशीलता और सेलुलर लक्ष्यीकरण क्षमता के रूप में अतिरिक्त गुण तांबे के माध्यम से paBhcmoc-PTX में पेश किए गए थे (मैं)-catalyzed Huisgen चक्रीकरण ("क्लिक करें" प्रतिक्रिया) (चित्र 2) . ये क्लिक करने योग्य बंदी PTXs तो 350 एनएम पर विकिरण पर अपने माता पिता PTXs का उत्पादन करने के लिए photolyzed थे (चित्र 3), और क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों के भौतिक और photochemical गुण तालिका 1 में संक्षेप कर रहे हैं. क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों की क्वांटम पैदावार 2]-glc-paBhcmoc-PTX ([dis 0.14) और paBhc-AA ($dis 0.083) पारंपरिक Bhcaged यौगिकों के दो बार से अधिक थे 2 ]-Bhcmoc-PTX (]dis 0.040) और Bhc-AA ($dis 0.038)43| इसके अलावा, 2 "glc-paBhcmoc-PTX, जिसमें एक ग्लूकोज moiety शामिल के लिए एक बेहतर पानी घुलनशीलता मनाया गया.

लाइव सेल प्रयोगों में, अनुकूल स्तनधारी कोशिकाओं के लिए paBhc-hex-FITC/Halo का लक्ष्य क्षणिक रूप से एक हेलोटैग प्रोटीन और एपिडर्मल विकास कारक रिसेप्टर (EGFR) का एक संलयन प्रोटीन व्यक्त करने में सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था। पेBhc-hex-FITC/Halo के फ्लोरोरेसिन मोइटी का ग्रीन फ्लोरोसेंट कोशिका झिल्ली पर देखा गया (चित्र 4)। एक kinase के subcellular स्थानीयकरण के फोटो-मध्यस्थ मॉडुलन एक paBhc बंदी यौगिक का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. आर्किडोनिक एसिड (एए)44की उपस्थिति में डाइसाइल्ग्लिसरोल काइनेस (डीजीकेजेड) के स्थानांतरण को सक्रिय होने की सूचना मिली है। CHO-K1 कोशिकाओं क्षणिक GFP-DGK$ व्यक्त या तो ए.ए. या paBhc-AA (5) के साथ इलाज किया गया. ए.ए. के अतिरिक्त डीजीकेजेड के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का मॉडुलन(चित्र 5ए, बी) का कारण बना। डीजीकेजेड के स्थानीयकरण में इसी प्रकार के परिवर्तन यूवी प्रकाश के संपर्क में आने के बाद paBhc-AA-उपचारित कोशिकाओं के लिए देखे गए (चित्र 5C, D)।

Figure 1
चित्र 1: क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों की तैयारी.
(क)रिएजेंट्स और शर्तें: a. ethyl 4-chloraceaceecate/conc. H2SO4/rt/7 days/91% उपज, b. 1 M HCl/reflux/3 days/97% उपज. c. N-methylpropargylamine /HCHO/EtOH, तो जोड़ें (1) और भाटा पर गर्मी 17 h/ (बी)क्लिक करने योग्य बंदी अमीन, PTX, और arachidonic एसिड के syntheses. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों में कार्यात्मक इकाइयों की स्थापना।
(क)तांबे के माध्यम से एक जल-विलेय पिंजरे में बंद PTX का संश्लेषण (I)-catalyzed Huisgen चक्रीकरण. (ख)सेल्युलर लक्ष्यीकरण के लिए हेलोटैग लिगन्ड युक्त क्लिक करने योग्य पिंजरित यौगिकों की संरचनाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 2 के फोटो-ग्लिसिस-paBhcmoc-PTX (6).
के-एमओपीएस घोल (पीएच 7.2) में नमूने (10 डिग्री सेल्सियस) 350 एनएम पर विकिरणित किए गए थे। (ए) 6 के फोटो लिलासिस के लिए विशिष्ट HPLC निशान (254 एनएम पर मापा). नमूनों निर्दिष्ट विकिरण समय पर विश्लेषण किया गया. (ख) 6के फोटो लिसिस के लिए समय पाठ्यक्रम . ब्लू सर्कल 6की खपत दिखाते हैं. ठोस रेखा 6के लिए एक सरल क्षय घातीय के लिए कम से कम वर्गों वक्र फिट से पता चलता है. लाल वर्गों PTX की उपज दिखाते हैं. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन ($SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों को paBhc-hex-FITC/Halo (8) के साथ इनक्यूबेट किया गया है।
pcDNA3-Halo-EGFR के साथ transfected कोशिकाओं 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यौगिक 8 के एक 2 डिग्री सेल्सियस समाधान के साथ incubated थे. छवियों PBS + के साथ दोहराया धोने के बाद प्राप्त किए गए थे. मॉक-उपचार HEK293T कोशिकाओं(ए:अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवि और डी:फ्लोरोसेंट छवि). HEK293T कोशिकाओं (बी और ई) और Hela कोशिकाओं (सी और एफ) क्षणिक हेलो-EGFR व्यक्त (बी और सी: डीआईसी छवियों और ई और एफ: फ्लोरोसेंट छवियों). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: चो-के 1 कोशिकाओं के यूवी विकिरण के बाद फ्लोरोसेंस छवियों को Bhc बंदी arachidonic एसिड के साथ incubated। CHO-K1 कोशिकाओं को एक संलयन प्रोटीन DGK$-EGFP के साथ transfected थे.
(क)ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की एक फ्लोरोसेंट छवि। (बी) 100 s arachidonic एसिड के एक 10 डिग्री सेल्सियस समाधान के अलावा के बाद. (ग) कोशिकाओं को 5 मिनट (डी) 100 एस के बाद 20-यूवी विकिरण (330-385 एनएम) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर paBhc-AA (5) के 10 डिग्री सेल्सियस समाधान के साथ इनक्यूबेट किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यौगिकों $ अधिकतम (एनएम)एक उ -1 बउ-1ब )ख $disc $डीडी विलेयता (जेडएम)ई
पीटीएक्स 1.0
2'-भीमको-पीटीएक्स 340 10500 0.040 400 55
2'-paBhcmoc-PTX 359 9300 0.059 670 8.3
2'-glc-Bhcmoc-PTX 373 12300 0.14 1280 650
बी.सी.ए.ए. 341 10800 0.038 390
paBhc-AA 366 10300 0.083 750

तालिका 1: क्लिक करने योग्य बंदी यौगिकों के भौतिक और फोटोकेमिकल गुण।
a. अवशोषण अधिकतम (nm), b. मोलर अवशोषण पर $अधिकतम (M]1 सेमी]1), c. 350 nm, d. पर प्रारंभिक सामग्री के गायब होने की क्वांटम उपज. मोलर अवशोषणशीलता का उत्पाद और 350 एनएम, ई पर गायब होने की क्वांटम उपज। K-MOPS (pH 7.2) में संतृप्त विलयन की सांद्रता ($g एमएलर्1)।

Discussion

हमने पहले विभिन्न जैविक रूप से सक्रिय अणुओं के बी सी बंदी यौगिकों का विकास किया जो उच्च प्रकाश-अपघटनी क्षमता28,45,46,47प्रदर्शित करते हैं . Bhc caging समूहों के प्रदर्शनों का विस्तार करने के उद्देश्य से, हम भी मॉड्यूलर पिंजरा यौगिकों कि विभिन्न कार्यात्मक इकाइयों32,40,41की शुरूआत से आसानी से संशोधित किया जा सकता है के प्लेटफार्मों की सूचना दी. वर्तमान प्रोटोकॉल इसलिए Bhc caging समूहों है कि तांबे के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है की एक क्लिक करने योग्य अग्रदूत के संश्लेषण के लिए एक विधि का प्रतिनिधित्व करता है (मैं)-catalyzed Huisgen चक्रीकरण. क्लिक करने योग्य अग्रदूत का संश्लेषण, paBhch2OH (2), एक चार कदम प्रतिक्रिया अनुक्रम के माध्यम से प्राप्त किया गया था व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4-bromoresorcinol से शुरू (चित्र 1A) . वर्तमान प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि कोई परिश्रमी शुद्धि कदम (उदाहरण के लिए, स्तंभ क्रोमैटोग्राफी जुदाई) की आवश्यकता है।

के रूप में क्लिक करने योग्य अग्रदूत paBhcCH2OH (2) विभिन्न कार्यात्मक समूहों मुखौटा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, amines के क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिकों, alcohols, और carboxylic एसिड का उपयोग कर संश्लेषित किया गया 2 अग्रदूत के रूप में (चित्र 1B) . Amines उनके carbamates के रूप में संशोधित किया गया है, जबकि शराब उनके कार्बोनेट के रूप में संशोधित किया गया. सामान्य प्रक्रियाओं में 1 और 2, CDI क्लिक करने योग्य carbamates की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि 4-nitrophenyl क्लोरोफ्लोरेट कार्बोनेट की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया था. के रूप में प्रतिक्रिया तंत्र द्वारा संकेत दिया, दोनों अभिकर्मकों carbamates और कार्बोनेट की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि वांछित बंदी यौगिक की उपज अणु की रासायनिक संरचना पर निर्भर करता है जिसे बंदी बना दिया गया है। अन्य उदाहरण हमारी पिछली रिपोर्ट28,30,33,48में देखे जा सकते हैं .

क्लिक संशोधन तो रिपोर्ट की गई प्रक्रिया49के एक मामूली संशोधन का उपयोग किया गया था. tris के अलावा (triazolylmethyl) amine आधारित ligands उच्च पैदावार के लिए अच्छा में वांछित उत्पादों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. चूंकि विभिन्न प्रकार के अज़ीदे आसानी से वाणिज्यिक स्रोतों और साहित्य प्रक्रियाओं से उपलब्ध हैं, इसलिए हम विभिन्न मॉड्यूलर बंदी यौगिकों को अतिरिक्त गुणों जैसे जल विलेयता और सेलुलर लक्ष्यीकरण क्षमता (चित्र 2)के साथ तैयार कर सकते हैं।

इसके बाद प्रकाश-विलाईन की मात्रा को एक रिपोर्ट की गई प्रक्रिया28,50के अनुसार मापा गया . चित्र 3 से पता चलता है कि 2 के फोटोअपिक खपत-glc-paBhcmoc-PTX और PTX की रिहाई क्रमशः एकल-अनुभव क्षय और वृद्धि द्वारा अनुमानित थे, विकिरण या अवांछित माध्यमिक प्रभाव की कोई आंतरिक फ़िल्टरिंग का सुझाव. पूर्व सूचित भcक जबंद यौगिकों की तुलना में क्लिक करने योग्य paBhc बंदी यौगिकों के लिए उन्नत प्रकाश-lysis क्वांटम पैदावार(र्) और प्रकाश-lysis क्षमता (]) देखी गई . 43. चूंकि प्रकाश-lysis दक्षता (] )Bhc बंदी यौगिकों की तुलना में एक सौ गुना अधिक है 2-नाइट्रोबेन्ज़िल-प्रकार के पिंजरित यौगिकों48, paBhccing समूहों की उपस्थिति के कारण चिह्नित सुधार स्पष्ट रूप से है इस प्रणाली के लिए एक लाभ.

एक सबूत के रूप में अवधारणा के प्रयोग के रूप में, एक हाइड्रोफिलिक moiety 2 में पेश किया गया था-paBhcmoc-PTX (4) और एक सेलुलर लक्ष्यीकरण लिगन्ड यौगिक 3 में पेश किया गया था (चित्र 2). 2 डिग्री-glc-paBhcmoc-PTX का जल विलेयता मूल PTX (तालिका 1)की तुलना में 650 गुना अधिक थी। चुनिंदा सेलुलर लक्ष्यीकरण एक टैग-प्रोब प्रणाली का उपयोग कर हासिल किया गया था, और paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) हेलोटैग लिगन्ड असर सफलतापूर्वक सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को लक्षित किया गया था हेलोटैग / चित्र 4) . एक kinase के subcellular स्थानीयकरण के फोटो-मध्यस्थ मॉडुलन भी एक क्लिक करने योग्य पिंजरा यौगिक 5 का उपयोग कर प्राप्त किया गया था (चित्र 5) .

अंत में, हम सफलतापूर्वक जैविक रूप से दिलचस्प अणुओं है कि इस तरह के पानी घुलनशीलता और एक सेलुलर के रूप में अतिरिक्त गुणों के साथ आसानी से संशोधित किया जा सकता है की फोटो-कैज्ड यौगिकों के लिए क्लिक करने योग्य प्लेटफार्मों की तैयारी के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया लक्ष्यीकरण क्षमता. चूंकि paBhc caging समूह संशोधन कार्यात्मक समूहों के साथ किसी भी अणुओं को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वर्तमान प्रोटोकॉल के आवेदन यहाँ वर्णित अणुओं तक ही सीमित नहीं है. एक मॉड्यूलर मंच का उपयोग करना, अर्थात् paBhc caging समूह, वांछित पिंजरा यौगिकों आसानी से तैयार किया जा सकता है, और उनके भौतिक और रासायनिक गुण क्लिक संशोधन के माध्यम से संग्राहक किया जा सकता है.

Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP16H01282 (TF), अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था "स्मृति गतिशीलता," और JP19H05778 (TF), "MolMovies."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile, EP Nacalai 00404-75
acetonitrile, super dehydrated FUJIFILM Wako 010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher 15240062
4-bromoresorcinol TCI Chemicals B0654
N,N’-carbonyldiimidazole FUJIFILM Wako 034-10491
chloroform Kanto 07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% FUJIFILM Wako 032-12511
dichloromethane, dehydrated Kanto 11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) TCI Chemicals D0254
4-dimethylaminopyridine TCI Chemicals D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- Kanto 10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW Olympus
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako 054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate TCI Chemicals C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red FUJIFILM Wako 087-08335
hydrochloric acid FUJIFILM Wako 087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71 Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL Biotage 120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt FUJIFILM Wako 196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher 11668027 lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Dojindo 345-01804 MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) TCI Chemicals C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Thermo Fisher 11058021 reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate Nacalai 26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate FUJIFILM Wako W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate Nacalai 31115-05
Sodium Bicarbonate FUJIFILM Wako 199-05985
Sulfuric Acid, 96-98% FUJIFILM Wako 190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ALDRICH 762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate Nacalai 31404-15
Xenon light source, MAX-303 Asahi Spectra

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