Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.
Kanser kök hücreleri (CSC) tümörigenez, tedaviye direnç ve tekrarlayan hastalıklardan sorumlu kendi kendini yenileme ve plastisite ile küçük bir popülasyondur. Bu popülasyon yüzey belirteçleri, enzimatik aktivite ve fonksiyonel profil ile tanımlanabilir. Bu yaklaşımlar, henotibik heterojenlik ve CSC plastisite nedeniyle sınırlıdır. Burada, meme ve jinekolojik kanserlerden CSC küreleri elde etmek, fonksiyonel özellikleri, CSC belirteçleri ve protein ekspresyonu değerlendirmek için küre oluşturan protokolü güncelliyoruz. Küreler, süspansiyon kültüründe düşük yoğunlukta tek hücreli tohumlama ile, göç ve agregaları önlemek için yarı katı metilselüloz orta kullanılarak elde edilir. Bu karlı protokol kanser hücre hatlarında değil, primer tümörlerde de kullanılabilir. Tümör mikroçevresini taklit ettiği düşünülen üç boyutlu non-yapışık süspansiyon kültürü, özellikle CSC-niş, epidermal büyüme faktörü ve temel fibroblast büyüme faktörü ile csc sinyalizasyon sağlamak için desteklenmektedir. CSC’nin sağlam bir şekilde tanımlanmasını hedefleyen, fonksiyonel ve henotipik değerlendirmeyi birleştiren tamamlayıcı bir yaklaşım öneriyoruz. Küre oluşturma kapasitesi, kendini yenileme ve küre projeksiyon alanı CSC fonksiyonel özellikleri oluşturur. Ayrıca, karakterizasyon, ALDH göz önünde bulundurularak CD44+/CD24– ve CD133 ve Western blot ile temsil edilen işaretçilerin akış sitometri değerlendirmesini içerir. Sunulan protokol ayrıca, çevirisel araştırmalar için yararlı olan bir örnek sindirim prosedürü nden sonra primer tümör örnekleri için optimize edildi.
Kanser popülasyonları heterojendir, farklı morfolojiler, proliferasyon ve invazyon kapasitesi sunan hücreler, diferansiyel gen ekspresyonuna bağlı olarak. Bu hücreler arasında, bir azınlık popülasyon kanser kök hücreleri adlı var (CSC)1, kendi kendini yenileme kapasitesine sahip, primer tümör niş heterojenite recapitulating ve homeostatik kontrollere yeterince yanıt vermez anormal ayırt edici ataları üreten2. CSC özellikleri doğrudan klinik uygulamada tercüme edilebilir, olaylar ile ilişki göz önüne alındığında, tümörijenite veya kemoterapi direnci gibi3. CSC’nin tanımlanması, yüzey belirteçlerinin tıkanmasını, CSC farklılaşmasının teşvikini, CSC sinyal yol bileşenlerinin engellenmesini, niş yıkımını ve epigenetik mekanizmaları içerebilir hedefli tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir4.
CSC izolasyonu hücre hatlarında ve primer tümör örneklerinde5,6,7,8olarak gerçekleştirilmiştir. CSC için tanımlanan fonksiyonel profil klojenik kapasite, yan popülasyon ve tümöroferoluşumunuiçerir 9 . CD44yüksek/ CD24düşük fenotip sürekli meme CSC ile ilişkili olmuştur, hangi in vivo tümörijenik olduğu kanıtlanmıştır ve zaten mezenkimal geçiş epitel ile ilişkili olmuştur5,10. Yüksek ALDH aktivitesi de solid tümörlerin çeşitli tiplerinde kalsuk ve mezenkimal geçiş (EMT) epitelyal ile ilişkili olmuştur11. ALDH ekspresyonu kemoterapiye direnç ve CSC fenotip in vitro12,13,14,15,16ile ilişkili olmuştur. Cd133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 ve diğerleri gibi farklı tümör türlerinde CSC özelliklerine eklenmiştir.
Tümör küreleri çalışma ve CSC genişlemesi için üç boyutlu bir model oluşur. Bu modelde, hücre hatları ve kan veya tümör örneklerinden hücre süspansiyonları büyüme faktörleri ile desteklenen bir ortamda yetiştirilmektedir, yani epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), fetal sığır serum olmadan ve non-adherent koşullarda17. Hücre adezyonunun inhibisyonu, farklılaşmış hücrelerin anoikis tarafından ölümle sonuçlanır18. Küreler izole bir hücrenin klonal büyüme türetilmiştir. Bu amaçla, hücreler hücre füzyonu ve toplama önlemek için düşük yoğunlukta dağıtılır19. Başka bir strateji yarı katı metilselüloz kullanımını içerir20.
Küre oluşturan protokol CSC izolasyon ve genişleme popülerlik kazandı, zaman ve maliyet ve teknik nedeniyle, karlı, ve tekrarlanabilir nedenlerle21,22. Küre oluşumunun CSC’yi ne ölçüde yansıttığına dair bazı rezervlere rağmen, kök hücrelerin doğal mikroçevreye benzeyen karakteristik fenotip ile yapışık olmayan koşullarda büyüme eğilimi vardır21. CSC’nin katı tümörlerden izole edilmesi için kullanılan yöntemlerin hiçbiri tam bir verime sahip değildir ve daha spesifik belirteçler veya metodoloji ve belirteç kombinasyonları geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.
Bu protokolde, CSC’nin küre oluşturan protokolle izolasyonu, yapışık olmayan koşullarda tek hücreli büyüme prensibi ve farklılaştırılmış fenotip üretme kapasitesi ile ayrıntılarıyla açıklanmaktadır. Bu yordamın şematik bir gösterimi Şekil 1’detemsil edilir. Ayrıca meme ve jinekolojik tümör hücreleri hatları ve primer tümör örnekleri için, csc için yüzey belirteçleri ve ALDH ekspresyonu ile karakterizasyonu açıklıyoruz.
Bu protokol, kanser hücre hatları ve birincil insan örneklerinden tümör küreleri elde etmek için bir yaklaşım ayrıntıları. Tümörküreler kök hücre benzeri özelliklere sahip bir alt popülasyonda zenginleştirilmiştir36. CSC’deki bu zenginleştirme, ankrajsız bir ortamda canlılığa bağımlıyken, farklılaşmış hücreler37. Süspansiyon uyguluyor düşük bir yapışma ortamında tümör hücrelerinin birincil kaplama olarak kendi kendine yenileme (k?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Portekiz Jinekoloji Derneği tarafından 2016 Araştırma Ödülü ve CIMAGO tarafından finanse edilmiştir. Cnc. IBILI, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (UID/NEU/04539/2013) ve FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440) tarafından finanse edilmektedir. CHUC Etik Sağlık Komitesi ve Portekiz Ulusal Veri Koruma Komisyonu tarafından onaylanan Coimbra Hastanesi ve Universitary Center (CHUC) Tümör Bankası, kurumun Jinekoloji Servisi’nde takip edilen hastaların endometrial örneklerinin kaynağı oldu. Şekil 1 Servier Tıp Sanatı kullanılarak üretildi, www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |