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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Abstract

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une petite population avec l’auto-renouvellement et la plasticité qui sont responsables de la tumorigénèse, la résistance au traitement et la maladie récurrente. Cette population peut être identifiée par des marqueurs de surface, une activité enzymatique et un profil fonctionnel. Ces approches en soi sont limitées, en raison de l’hétérogénéité phénotypique et de la plasticité du SCC. Ici, nous mettons à jour le protocole de formation de sphère pour obtenir des sphères de CSC des cancers du sein et gynécologiques, évaluant des propriétés fonctionnelles, des marqueurs de CSC et l’expression de protéine. Les sphères sont obtenues avec l’ensemencement unicellulaire à faible densité dans la culture de suspension, en utilisant un milieu semi-solide de méthylcellulose pour éviter la migration et les agrégats. Ce protocole rentable peut être utilisé dans les lignées cellulaires cancéreuses, mais aussi dans les tumeurs primaires. La culture tridimensionnelle de suspension non-adhérente pensée pour imiter le microenvironnement de tumeur, particulièrement le CSC-niche, est complétée avec le facteur épidermique de croissance et le facteur de croissance de base de fibroblaste pour assurer la signalisation de CSC. Visant une identification robuste du SCC, nous proposons une approche complémentaire, combinant l’évaluation fonctionnelle et phénotypique. La capacité de formation de sphère, l’auto-renouvellement et la zone de projection de sphère établissent des propriétés fonctionnelles de CSC. En outre, la caractérisation comprend l’évaluation de la cytométrie du débit des marqueurs, représentés par CD44/CD24- et CD133, et Western blot, compte tenu de l’ALDH. Le protocole présenté a également été optimisé pour les échantillons primaires de tumeur, suivant une procédure de digestion d’échantillon, utile pour la recherche translationnelle.

Introduction

Les populations cancéreuses sont hétérogènes, avec des cellules présentant différentes morphologies, la prolifération et la capacité d’invasion, en raison de l’expression différentielle des gènes. Parmi ces cellules, une population minoritaire existe des cellules souches cancéreuses (CSC)1, qui ont la capacité d’auto-renouvellement, récapitulant l’hétérogénéité de la niche tumorale primaire et produisant des progéniteurs aberrants différenciants qui ne répondent pas adéquatement aux contrôles homéostatiques2. Les propriétés de CSC peuvent être directement traduites dans la pratique clinique, étant donné l’association avec des événements, tels que la tumorigénicité ou la résistance à la chimiothérapie3. L’identification du SCC peut mener à la mise au point de thérapies ciblées qui peuvent inclure le blocage des marqueurs de surface, la promotion de la différenciation du SCC, le blocage des composantes de la voie de signalisation du SCC, la destruction des niches et les mécanismes épigénétiques4.

L’isolement du SCC a été effectué dans les lignées de cellules et dans des échantillons de tumeurs primaires5,6,7,8. Le profil fonctionnel décrit pour le SCC comprend la capacité clonogène, la population latérale et la formation de tumorosphère9. Le phénotypefaible cD44élevé/CD24 a été uniformément associé au CSC de sein, qui s’est avéré être tumorigenic in vivo et a été déjà associé à la transition épithéliale à la transition mésenchymale5,10. L’activité élevée d’ALDH a été également associée à la tige et à la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) dans plusieurs types de tumeurs pleines11. L’expression d’ALDH a été associée à la résistance à la chimiothérapie et au phénotype de CSC in vitro12,13,14,15,16. Plusieurs autres marqueurs ont été liés aux propriétés du SCC dans différents types de tumeurs, comme CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 et d’autres, comme décrit dans le tableau 1.

Les tumorspheres se composent d’un modèle tridimensionnel pour l’étude et l’expansion de CSC. Dans ce modèle, les suspensions cellulaires des lignées cellulaires et des échantillons de sang ou de tumeur sont cultivées dans un milieu complété par des facteurs de croissance, à savoir le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF), sans sérum bovin fœtal et dans des conditions non adhérentes17. L’inhibition de l’adhérence cellulaire entraîne la mort par anoikis de cellules différenciées18. Les sphères sont dérivées de la croissance clonale d’une cellule isolée. À cette fin, les cellules sont distribuées à faible densité pour éviter la fusion cellulaire et l’agrégation19. Une autre stratégie comprend l’utilisation de la méthylcellulose semi-solide20.

Le protocole de formation de sphère a gagné la popularité dans l’isolement et l’expansion de CSC, en raison du temps et du coût et des raisons techniques, profitables, et reproductibles21,22. Malgré certaines réserves sur l’étendue de la formation de sphère soumet le SCC, il y a une propension des cellules souches à se développer dans des conditions non adhérentes avec le phénotype caractéristique, qui ressemble au microenvironnement indigène21. Aucune des méthodes disponibles pour l’isolement du SCC des tumeurs pleines n’a l’efficacité complète, soulignant l’importance de développer des marqueurs plus spécifiques ou des combinaisons des méthodologies et des marqueurs.

Dans ce protocole, nous détaillons l’isolement du SCC avec le protocole de formation de sphère, avec le principe de la croissance unicellulaire dans des conditions non adhérentes et la capacité de produire un phénotype différencié. Une représentation schématique de cette procédure est représentée à la figure 1. Nous décrivons également la caractérisation avec des marqueurs de surface et l’expression d’ALDH pour CSC, pour des lignes de cellules de tumeur de sein et gynécologiques et des échantillons des tumeurs primaires.

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Protocol

Ce protocole a été exécuté conformément aux directives éthiques de la Banque de tumeurs de l’Hôpital et du Centre Universitaire de Coimbra (CHUC), et a été approuvé par le Comité d’éthique de la santé du CHUC et par la Commission nationale portugaise de protection des données.

1. Protocole de formation de sphères et populations adhérentes dérivées des cultures cellulaires continues

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures dans des conditions stériles strictes.

  1. Préparation de flacons ou de plaques de culture de suspension non adhérents en enrobant la surface de croissance de poly(2-hydroxyethyl-méthacrylate (poly-HEMA)
    1. Préparer une solution de 15 mg/ml en remuant le poly-HEMA dans de l’éthanol absolu à 65 oC. Enrober les flacons ou les plaques de culture cellulaire avec 50 l/cm2.
    2. Laisser sécher à 37 oC dans un four à sécher. Si nécessaire, envelopper les assiettes et les conserver à température ambiante.
  2. Préparation des supports de culture de sphère (SCM)
    1. Préparer une solution de 2% de méthylcellulose dans de l’eau ultrapure et stériliser dans l’autoclave. La méthylcellulose a tendance à être plus facile à solubilité par refroidissement; donc disperser la poudre dans l’eau à 80 oC et remuer jusqu’à ce qu’elle soit refroidie23.
    2. Préparer une solution deux fois concentrée de SCM (solution stock). La solution de travail SCM contient du DMEM-F12, complété par 100 mM de putréscine, 1 % d’insuline, de transferrine, de sélénium et 1 % de solution antibiotique-antimycotique (10 000 u/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine et 25 'g/mL d’amphotericine B).
    3. Pour préparer le SCM, mélanger des volumes égaux de la solution de stock SCM avec la solution de 2% de méthylcellulose.
    4. Terminer le milieu immédiatement avant l’utilisation en ajoutant 10 ng/mL facteur de croissance épidermique (EFG) et 10 ng/mL facteur de croissance de base de fibroblaste (bFGF).
    5. Si des lignées cellulaires plus exigeantes sont utilisées, complétez le milieu avec 0,4 % d’albumine bovine, ce qui pourrait être un avantage.
  3. Commencez par un flacon de MCF7 ou HCC1806 cancer du sein ou ECC-1 ou RL95-2 cellules cancéreuses endométriales (ou autre lignée de cellules cancéreuses de choix) avec 80% à 90% de confluence.
  4. Jeter le support de culture cellulaire, laver avec une solution saline tamponnée en phosphate (PBS) et détacher les cellules avec de la trypsine-EDTA (1 à 2 ml pour un flacon de culture cellulaire de 75 cm2).
  5. Ajouter le support de culture cellulaire (2 à 4 ml pour un flacon de culture cellulaire de 75 cm2) et la centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour jeter les enzymes.
  6. Suspendre la pastille dans un volume connu de support de culture cellulaire et pipette de haut en bas pour assurer une suspension de cellule unique. À cette fin, une passoire cellulaire de 40 m peut être utilisée.
  7. Comptez les cellules dans l’hémocytomètre et calculez la concentration cellulaire de la suspension cellulaire. Profitez de cette étape pour assurer l’observation d’une suspension à cellule unique. Un comptage minutieux des cellules est essentiel pour quantifier avec précision les effets des traitements.
  8. Suspendre la quantité déterminée de suspension cellulaire dans le milieu complet SCM et le transférer dans des plats enduits poly-HEMA. Comme valeur de référence pour la densité d’ensemencement, considérez 500 à 2000 cellules/cm2.
    REMARQUE : L’optimisation de la densité d’ensemencement et du temps de culture pour chaque lignée cellulaire est fortement recommandée24.
  9. Incuber à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 jours sans déranger les plaques.
  10. Rétablir la concentration des facteurs de croissance en ajoutant 10 ng/mL EFG et 10 ng/mL bFGF au média de culture cellulaire. Répétez cette étape tous les deux jours.
  11. Incuber à 37 oC et 5 % de CO2 jusqu’à 5 jours après le placage (ce qui peut varier de 3 à 12 jours selon la lignée cellulaire) pour obtenir des sphères, qui présentent la morphologie des colonies cellulaires en forme de boule de suspension.
  12. Utiliser ou collecter les sphères, par pipetting, pour les expériences.
  13. Pour obtenir des populations adhérentes dérivées, placer les sphères dans des conditions de culture standard, respectivement de la ligne cellulaire utilisée. 1 à 2 jours plus tard, il est possible d’observer une monocouche de cellules poussant autour des sphères adhérentes, ce qui présente une morphologie similaire à la lignée cellulaire d’origine.

2. Protocole de formation de sphère à partir d’échantillons de tumeurs humaines

REMARQUE : L’utilisation d’échantillons humains à des fins de recherche doit être conforme à la législation de chaque pays et être approuvée par le Comité d’éthique des institutions concernées.

  1. Préparer le support de transport contenant du DMEM/F12, complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 2 % de solution antibiotique-antimycotique (10 000 pénicilline U/mL, 10 mg/mL de streptomycine et 25 'g/mL amphotericin B).
  2. Préparer le support de digestion contenant DMEM/F12, complété par 10% FBS, 1% solution antimycotique antibiotique, 1 mg/mL de type IV collagène et 100 'g/mL DNAse I.
  3. Préparer le support d’inactivation d’enzymecontenant contenant d’autres d’un DMEM/F12, complété par 10 % de FBS et 1 % de solution antibiotique-antimycotique (10 000 u/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine et 25 'g/mL d’amphotericine B).
  4. Préparer le MCS tel que décrit à la section 1.2.
  5. Obtenir l’échantillon au cours de l’étude macroscopique de la pièce opératoire dès que possible après l’ablation chirurgicale.
  6. Placez les échantillons dans les supports de transport et transférez-les au laboratoire pour le traitement. Le traitement de l’échantillon devrait commencer dans les 1 h suivant la collecte afin d’améliorer le taux de réussite de la procédure. Appliquez la prudence dans la collecte d’échantillons. Manipulez soigneusement les échantillons. Évitez l’utilisation de zones nécrotiques ou cautérisées.
  7. Sous la chambre d’écoulement stérile, transférer l’échantillon dans un plat et le couper en petits morceaux (environ 1 mm3) avec un scalpel.
  8. Incuber le tissu humain dans un tube avec un support de digestion dans un shaker rotatif jusqu’à 180 min, à 37 oC. Identifiez ce tube comme tube A.
  9. Remplacer la solution enzymatique toutes les 15 min.
    1. Recueillir le support de digestion (sans enlever les fragments de tissu) et le transférer à travers une passoire cellulaire de 40 m à un nouveau tube à moitié rempli de médias d’inactivation d’enzymes. Maintenez ce tube à température ambiante et identifiez-le comme tube B.
    2. Ajouter un nouveau support de digestion au tube A et le remettre dans le shaker rotatif à 37 oC.
    3. À chaque collecte, vérifiez la viabilité des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion bleu trypan.
    4. Répétez cette procédure pendant 180 min ou jusqu’à ce que le nombre de cellules soit significativement inférieur.
  10. Incuber les fragments de tissu dans le tube A dans une deuxième solution de digestion contenant des parties égales de l’accutase et de la trypsine-EDTA, en remuant pendant 10 min à 37 oC.
  11. Ajouter le milieu d’inactivation d’enzyme s’asseoir dans le tube A et filtrer le contenu à travers une passoire cellulaire de 40 m dans le tube B.
  12. Centrifugelant la suspension cellulaire dans le tube B à 200 x g pendant 10 min.
  13. Suspendre la pastille dans SCM et vérifier la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
  14. Suspendre la quantité déterminée de suspension cellulaire en SCM et transférer dans des plats enduits poly-HEMA (voir l’étape 1.1) avec une densité d’ensemencement de 4000 cellules/cm2.
  15. Incuber à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 jours sans déranger les plaques.
  16. Rétablir la concentration des facteurs de croissance en ajoutant 10 ng/mL EFG et 10 ng/mL bFGF au média de culture cellulaire.
    REMARQUE: Vous devez le faire tous les deux jours.
  17. Incuber à 37 oC et 5 % de CO2 jusqu’à 5 jours après le placage (ce qui peut varier jusqu’à 12 jours) pour obtenir des sphères qui présentent la morphologie des colonies cellulaires en forme de boule de suspension.

Figure 1
Figure 1 : Obtenir des cellules souches cancéreuses à partir d’échantillons de tumeurs endométriales humaines (A) et de lignées de cellules cancéreuses du sein et gynécologiques (B). Les échantillons humains de tumeur sont fragmentés, enzymatiquement digérés et plaqués dans le milieu de culture de sphère dans les plats enduits poly-HEMA. Les lignées de cellules cancéreuses sont détachées, les suspensions cellulaires sont comptées et les cellules individuelles sont distribuées à faible densité dans des plaques enduites de poly-HEMA dans des conditions appropriées. Les sphères obtenues, lorsqu’elles sont placées dans des conditions de culture adhérentes, produisent des populations adhérentes dérivées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Capacité de formation de sphère, auto-renouvellement, et zone de projection de sphère

REMARQUE : La capacité de formation de sphère est la capacité d’une population de cellules tumorales à produire des sphères. L’auto-renouvellement est la capacité des cellules de sphère à produire de nouvelles colonies de cellules sphériques en suspension. La zone de projection de sphère est représentative de la zone occupée par la sphère et donc expressive de leur taille et du nombre de divisions cellulaires subies dans une certaine période de temps.

  1. Détermination de la capacité de formation de sphères
    1. Après l’achèvement du protocole de formation de sphère, recueillir les sphères dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 125 x g pendant 5 min.
    2. Jetez le SCM et suspendez délicatement la pastille dans un volume connu de supports frais. Dans le but de concentrer les sphères pour faciliter le comptage, suspendre les sphères dans un petit volume de médias. Veillez à ne pas déranger les sphères.
    3. Utilisez un hémocytomètre pour compter les sphères de plus de 40 m de diamètre. Alternativement, les sphères peuvent être comptées directement sur la plaque à l’aide d’un microscope équipé d’un graticule25 ou à l’aide d’un système automatisé26,27.
    4. Calculer le rapport de pourcentage des sphères obtenues par rapport au nombre de cellules initialement plaquées.
  2. Déterminer l’auto-renouvellement
    1. Après l’achèvement du protocole de formation de sphère, recueillir les sphères dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 125 x g pendant 5 min.
    2. Jetez la sphère de culture des médias et suspendez doucement la pastille dans trypsin-EDTA.
    3. Incuber jusqu’à 5 min à 37 oC.
    4. Ajouter le support d’inactivation enzymatique et la pipette de haut en bas pour assurer une suspension à cellule unique.
    5. À l’aide d’un hémocytomètre et de la méthode d’exclusion bleue trypan, compter les cellules viables dans la suspension.
    6. Initier le protocole de formation de sphère tel que décrit à la section 1.
    7. Après 8 jours, utilisez un hémocytomètre pour compter les sphères de plus de 40 m de diamètre.
    8. Calculer le rapport de pourcentage des sphères obtenues par rapport au nombre de cellules initialement plaquées.
  3. Détermination de la zone de projection de sphère
    1. Pour évaluer la zone occupée par les sphères, obtenir des images d’au moins 10 champs aléatoires par condition, dans un microscope inversé équipé d’un module d’acquisition d’images. Un grossissement de 100X à 400X est recommandé.
    2. Analyser les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie, tel que le logiciel ImageJ28, en dessinant des zones d’intérêt correspondant aux sphères et en mesurant sa zone en pixels.
    3. Calculer la zone de projection de sphère comme la zone moyenne des pixels mesurées.

4. Évaluation des marqueurs de cellules souches cancéreuses avec Cytométrie de flux

REMARQUE : CD44etCD24-/faible phénotype était constamment associé aux cellules souches du cancer du sein et gynécologiques. La procédure décrite peut être utilisée pour évaluer ceci et d’autres marqueurs de surface de cellules.

  1. Après l’achèvement du protocole de formation de sphère, recueillir les sphères dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 125 x g pendant 5 min.
  2. Jetez le SCM et suspendez délicatement la pastille dans trypsin-EDTA.
  3. Incuber jusqu’à 5 min à 37 oC.
  4. Ajouter le support d’inactivation enzymatique et la pipette de haut en bas pour assurer une suspension à cellule unique.
  5. Centrifugeuse à 125 x g pendant 5 min, jetez le supernatant et suspendez délicatement les cellules en PBS.
  6. Laisser reposer les cellules en suspension pendant 30 min pour assurer la récupération de la conformation de la membrane.
  7. À l’aide d’un hémocytomètre et de la méthode d’exclusion bleue trypan, compter les cellules dans la suspension.
  8. Ajuster le volume de suspension cellulaire à 106 cellules/500 l.
  9. Incuber avec les anticorps monoclonaux selon les instructions des fournisseurs (concentration, temps, température et lumière/obscurité) et considérer l’ensemble d’expériences représenté dans le tableau 2 ou les marqueurs donnés dans le tableau 1.
  10. Immédiatement après la coloration, effectuez l’analyse cytométrique de flux à l’aide d’un cytomètre de débit avec des modules de détection appropriés.
  11. Standardisez la configuration des cytomètres, suivant les protocoles établis par l’EuroFlow Consortium29.
  12. Installez des portes primaires en fonction de la diffusion vers l’avant et latérale à l’exclusion des débris et des cellules mortes. Ceci peut être amélioré par l’étiquetage concomitant avec l’annexin ecinvou v et les cellules négatives de gating.
  13. Définir des barrières de fluorescence en fonction des échantillons non tachés et la compensation d’un chevauchement spectral à l’aide de commandes tachées uniques.

5. Évaluation des marqueurs de cellules souches cancéreuses avec Western Blot

REMARQUE : En plus de l’activité d’ALDH1, l’expression élevée de ce marqueur a été uniformément associée aux cellules souches de cancer de sein etgynécologique13,14. La procédure décrite peut être utilisée pour évaluer ceci et d’autres marqueurs cellulaires.

  1. Après l’achèvement du protocole de formation de sphère, recueillir les sphères dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 125 x g pendant 5 min.
  2. Préparation de l’ensemble de la cellule lysates
    1. Placer les tubes de centrifugeuse sur la glace et jeter le supernatant sans perturber la pastille.
    2. Laver la pastille avec 1 ml de PBS froid et jeter par centrifugation.
    3. Suspendre la pastille dans un petit volume (200-500 l) de tampon de lyse RIPA30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1.50 mM pH 7.4, Triton-X100 1% vol./vol., sodium deoxyclic acid 0.5% wt./vol., sodium dodecyl sulfate 0.5% wt./vol.) complété avec cOmplete Mini et dithiothreitol 1 mM.
    4. Maintenir les échantillons froids (sur la glace), les soumettre au vortex et à la sonication avec une amplitude de 30%.
    5. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 14 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée fixée à 4 oC.
    6. Transférez les supernatants vers de nouveaux microtubes bien identifiés.
    7. Déterminer les concentrations protéiques à l’aide des tests BCA ou Bradford31.
    8. Si nécessaire, entreposer les échantillons à -80 oC jusqu’à ce qu’une analyse plus poussée de la tache occidentale soit effectuée.
  3. Effectuer la dénaturation de l’échantillon, l’électrophorèse, le transfert d’électrons et la détection des protéines selon les protocoles occidentaux standard de blotting, comme décrit32,33,34.

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Representative Results

Le protocole de formation de sphère permet d’obtenir des colonies sphériques en suspension à partir de plusieurs lignées cellulaires de l’endomètre et du cancer du sein (figure 2A) ou après une digestion enzymatique douce des tissus provenant d’échantillons de tumeurs humaines (Figure 2E). Dans les deux cas, quelques jours après le placage, des colonies sphériques monoclonales en suspension sont obtenues. Les sphères de l’endomètre et du cancer du sein donnent lieu à une monocouche cellulaire avec une morphologie similaire à la lignée cellulaire d’origine, 1 à 2 jours après le placage (Figure 2A).

La lignée distincte et les origines tissulaires peuvent être comparées par la capacité de formation de sphère, l’auto-renouvellement et la zone de projection. Les résultats représentatifs des lignées cellulaires du cancer du sein peuvent être observés dans les graphiques de la figure 2B-D. Les cellules MCF7 du cancer du sein monotone-positives de cancer du sein montrent la capacité de formation de sphère plus élevée, l’auto-renouvellement et la zone de projection que les cellules triple négatif de cancer du sein HCC180614. Pour les deux lignées cellulaires, un faible pourcentage des cellules plaquées (moins de 3 %) a été en mesure de produire des sphères mettant l’accent sur les cellules souches cancéreuses comme une population minoritaire dans l’hétérogénéité des cellules tumorales. L’auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses a été breveté par une valeur significativement différente de l’auto-renouvellement de la sphère des lignées cellulaires représentées. La zone de projection de sphère, comme mesure approximative de la dimension des sphères, est en corrélation avec le nombre de cycles mitotiques et affiche des intervalles de temps différents pour les deux lignées.

Tandis que seulement une petite proportion de cellules est capable de former des tumorspheres in vitro et de conserver la capacité d’auto-renouvellement portant des propriétés de cellules souches, plusieurs marqueurs ont été associés à ce phénotype.

Le protocole de cytométrie de débit présenté permet des approches expérimentales polyvalentes, en tenant compte des antigènes de surface (voir tableau 1). Les résultats représentatifs, présentés à la figure 3A-B, concernent les marqueurs membranaires CD44/CD24 et CD133 qui ont été proposés comme correspondant à un phénotype plus cancéreux ressemblant à une cellule souche. L’analyse des sphères obtenues à partir des lignées cellulaires Endométrial RL95-2 et ECC-1 a permis d’identifier quatre populations (figure 3A). Les sphères obtenues à partir de l’endomètre RL95-2 comprenaient un CD44élevé/CD24- population trois fois plus grande que la lignée cellulaire parentale35. Dans le cas des sphères ECC-1, le CD44élevé/CD24- correspond à la population majeure, qui est également CD133 positif, tandis que le CD44faible/CD24-, CD44faible/CD24- / CD24 - /CD24- ont négative ou faible CD133 expression.

L’évaluation des marqueurs de surface et intracellulaires peut également être effectuée par tache occidentale après la récolte douce de sphère et la préparation soigneuse d’échantillon de protéine. La figure 3C montre les résultats typiques du changement d’ALDH, un marqueur dont l’activité accrue ou l’expression augmentée de protéine est associée au phénotype13de cellules souchescancéreuses,14 sur des sphères et des cellules adhérentes dérivées concernant la ligne de cellules eCC1 de l’endomètre.

Figure 2
Figure 2 : Cellules de l’endomètre et du cancer du sein, sphères et populations adhérentes dérivées. (A) . Images représentatives des lignées cellulaires cancéreuses de l’endomètre (RL95-2 et ECC-1) et du sein (MCF7 et HCC1806), des sphères respectives de l’endomètre (ES1) et du sein (MS1) et des populations adhérentes dérivées (G1). Des images représentatives des lignées de cellules cancéreuses RL95-2, ECC-1, MCF7 et HCC1806 ont été obtenues à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 50 m). Des images représentatives de ES1 RL95-2 et ES1 ECC-1 ont été obtenues à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 50 m). Des images représentatives de MS1 MCF7 et MS1 HCC1806 ont été obtenues à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 100 m). Des images représentatives de G1 RL95-2 et G1 ECC-1 ont été obtenues à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 50 m). Des images représentatives de G1 MCF7 et G1 HCC1806 ont été obtenues à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 100 m). (B-D) . Capacité de formation de sphère, auto-renouvellement et zone de projection de sphère des sphères de cancer du sein MCF7 et HCC1806. (E) . Images représentatives des sphères obtenues des échantillons humains de tumeur endométriale. Ces images ont été capturées à un grossissement de 200x (barre d’échelle de 50 m). Une partie de ce chiffre a été modifiée à partir d’une publication précédente avec la permission de l’éditeur14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation combinée des marqueurs des cellules souches cancéreuses dans les cellules cancéreuses de l’endomètre. (A) . Parcelles représentatives de l’étiquetage CD44/CD24 de la lignée cellulaire RL95-2 et des cellules de sphère RL95-2. (B) . Histogrammes représentatifs de l’étiquetage CD133 des cellules de sphère (ES1) obtenus à partir des lignées cellulaires RL95-2 et ECC-1. La densité représente une mesure du nombre de cellules. CD44-/CD24-, CD44faible/CD24-, CD44faible/CD24- et CD44-/CD24- populations sont peintes en vert, rose, bleu et jaune, respectivement. C. Expression d’ALDH dans la lignée cellulaire DC-1, les sphères (ES1), et la population adhérente dérivée (G1). L’immunoblot représente l’expression ALDH et actine pour les conditions expérimentales respectives. L’expression d’ALDH a été évaluée avec l’anticorps ALDH1/2, qui détecte les isoformes ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 et ALDH2 de souris, de rat et d’origine humaine. Une partie de ce chiffre a été modifiée à partir de publications précédentes avec la permission des éditeurs13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Liste des marqueurs de cellules souches gynécologiques et du cancer du sein.

Marqueur Origine des cellules souches Références
CD24 (en) Cancer de l’ovaire 60
CD29 (en) Cancer du sein 61
CD44 (en) Cancer de l’ovaire 62,63
CD44/CD24-/faible Cancer du sein 13,5,3,64
CD44/CD24-/faible/ESA Cancer du sein 65
CD44/ALDH1 Cancer du sein 66
CD44/CD24-/faible/ABCG2 Cancer du sein 67
CD44/CD24-/faible/ALDH1 Cancer du sein 43,68,69
CD44/CD24-/faible/EpCAM Cancer du sein 5
CD44/CD24-/faible/SSEA-3 Cancer du sein 70
CD44/CD49f/CD133/2 Cancer du sein 71
CD44/CD133/ALDH1 Cancer du sein 69
CD44/CD117 Cancer de l’ovaire 7
CD44/MyD88 Cancer de l’ovaire 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Cancer de l’ovaire 74,75 ans
CD44/CD24/Epcam Cancer de l’ovaire 76,77
CD44/CD24- Cancer de l’ovaire 78,79
CD44/CD166 Cancer de l’ovaire 80
CD44/CD24 Cancer du col de l’utérus 81
CD49f Cancer du sein 4
Cancer du col de l’utérus 82
CD117 ou c-Kit Cancer de l’endomètre 83
Cancer de l’ovaire 62,84
CD133 (en) Cancer du sein 4,85
Cancer de l’ovaire 62,86
Cancer de l’endomètre 13,87,88,89
Cancer du col de l’utérus 82
CD133salut/CXCR4salut/ALDH1salut Cancer du sein 90
CD133/ALDH1 Cancer du sein 91
Cancer de l’ovaire 60,92
CD133/CXCR4 Cancer de l’endomètre 93
ABCG2 (en anglais) Cancer du sein 65
Cancer du col de l’utérus 82,81
ALDH-1 Annonces Cancer du sein 4
Cancer de l’endomètre 94,95
Cancer du col de l’utérus 82
CXCR4 ou CD184 Cancer du sein 96
EpCAM/CD49f Cancer du sein 97
EpCAMsalut/PROCRsalut/SSEA-3 Cancer du sein 70
GD2/GD3/GD3Ssalut Cancer du sein 98
ITGA6 (EN) Cancer du sein 4
PROCR (PROCR) Cancer du sein 43

REMARQUE : Ce tableau fournit une liste des épitopes de surface exprimés par diverses cellules souches gynécologiques et de cancer du sein ; la plupart de ces marqueurs sont également exprimés par une gamme d’autres tissus. Cette liste ne vise pas à inclure tous les marqueurs signalés.

Tableau 2 : Liste des tubes à inclure dans une expérience typique de cytométrie du débit pour évaluer le phénotype CD24/CD44. Le tableau montre un ensemble minimal de tubes d’échantillon requis pour une expérience de co-coloration, y compris les contrôles nécessaires.

Tube Condition Antigène-fluorophore
1 Cellules non tachées Aucun
2 CD44 teinté unique CD44-PE
3 CD24 teinté unique CD24-APC
4 CD44/CD24 doublement taché CD44-PE et CD24-APC

REMARQUE : Cette expérience peut être effectuée en ajoutant l’annexine V-FICT au tube 4 et en ajoutant le tube de commande respectif afin de la barrière des cellules négatives d’annexe V et d’exclure les cellules éventuelles dans l’apoptose.

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Discussion

Ce protocole détaille une approche pour obtenir des tumorspheres des lignées de cellules cancéreuses et des échantillons humains primaires. Les tumorsphères sont enrichies dans une sous-population avec des propriétés de cellules souches36. Cet enrichissement au SCC dépend de la viabilité dans un environnement sans ancrage alors que les cellules différenciées dépendent de l’adhérence à un substrat37. Comme le placage primaire des cellules tumorales dans un environnement à faible adhérence qui impose une suspension n’assure pas l’enrichissement du SCC en soi, nous fournissons des stratégies pour évaluer l’auto-renouvellement (capacité de formation de sphère et auto-renouvellement), la capacité de différenciation (populations adhérentes dérivées) et le phénotype du SCC (avec cytométrie du débit et/ou tache occidentale). Les cellules souches cancéreuses peuvent être identifiées au moyen de plusieurs marqueurs phénotypiques largement décrits (voir le tableau 1).

Comme les cultures primaires de tumeur humaine sont souvent difficiles à établir et à maintenir dans la culture, le protocole de sphère-formation pourrait fournir un outil pour manipuler ces échantillons. La procédure de digestion enzymatique a suggéré fourni des suspensions unicellulaires des échantillons de tissu endométrial38. Le protocole de formation de sphères fournit un nombre important de SCC, qui sont difficiles à obtenir par d’autres moyens. Le modèle tridimensionnel pourrait être plus efficace pour imiter la situation in vivo, à savoir le microenvironnement physiologique et l’hétérogénéité tumorale, que les cultures cellulaires monocouches conventionnelles.

La certitude au sujet de l’origine monoclonal des tumorspheres est une étape critique de ce protocole. La réduction de l’agrégation, qui a tendance à se produire dans les cultures de suspension, et une optimisation complète des densités d’ensemencement pour distribuer les suspensions unicellulaires sont cruciales24. D’autres auteurs ont suggéré le placage d’une seule cellule par puits39,40. Pour éviter cette procédure laborieuse, nous avons surmonté ce problème en veillant à ce qu’une suspension unicellulaire soit plaquée en basse densité dans un milieu enrichi de méthylcellulose. En raison de sa rétention d’eau et de la viscosité améliorant les propriétés23, la méthylcellulose fournit un milieu semi-solide qui évite la migration et l’agrégation, assurant la monoclonité des sphères obtenues21. Le nombre de jours en culture est un autre aspect qui dépend de l’optimisation, car le nombre de jours nécessaires pour obtenir des sphères avec des diamètres supérieurs à 40 m dépend de chaque type de cellule doublant le temps24. Le milieu faible ou sans sérum est une autre caractéristique du protocole, car le milieu contenant du FBS est pertinent pour la croissance cellulaire différenciée dans les conditions adhérentes41, comme dans les lignées cellulaires parentales et dans les cellules adhérentes dérivées. Le protocole dépend du maintien d’une concentration régulière des facteurs de croissance spécifiques. La signalisation du FEM joue un rôle important dans le maintien des voies de la pluripotence tandis que le bFGF agit comme un mitogène contribuant à la génération de sphères42,43.

Le protocole de formation de sphères, associé à des techniques appropriées, fournit les moyens d’élargir, d’isoler et d’évaluer des populations spécifiques de CSC21. Plusieurs auteurs ont souligné son utilité dans l’évaluation de l’expression du gène des cellules souches44,45,46,47 et la tige dans les tumeurs47,48, pour étudier la transition épithéliale-mésenchymale44,49 et tumorigenesis45,48, pour évaluer l’effet des nouvelles thérapies21,50 et la résistance aux médicaments44, 51, et d’établir des cultures à partir d’échantillons primaires21,45,46. Cependant, il est important de garder à l’esprit qu’il s’agit d’une expérience sensible, très dépendante de conditions de culture adéquates. En outre, les sphères présentent l’hétérogénéité cellulaire due à la division asymétrique du SCC52 et ne représentent pas un bon modèle de la complexité de la formation et de l’entretien des cellules souches cancéreuses dans la niche in vivo46.

Outre le protocole de formation de sphères, d’autres essais fonctionnels ont été utilisés pour la détection du SCC. La tumorigénicité in vivo implique l’inoculation de faibles nombres cellulaires chez les souris immunodéprimées pour obtenir des tumeurs36,53. Cela dépend de la disponibilité de conditions appropriées pour effectuer des études sur les animaux, et en raison du microenvironnement non spécifique aux espèces, le rétablissement des cellules vivantes pourrait être difficile. Une colonie formant l’essai d’unité, évaluant la capacité de cellules pour produire des colonies après qu’elles soient plaquées à la basse densité52,fournit le nombre bas de cellules. La population latérale dépend du tri des cellules activées par la fluorescence (FACS) pour isoler un groupe de cellules ayant la capacité d’extrumer la tache Hoescht 33342. Cette méthode sensible repose sur l’expression de la protéine de cassette de liaison ATP (ABC) transporteurs, responsable de l’efflux médicament54. Néanmoins, la population secondaire est associée à certains inconvénients, à savoir la non-spécificité de certains phénotypes de CSC et les caractéristiques du colorant, qui est toxique et largement influencée par des conditions expérimentales (température, concentration)54,55. ALDEFLUOR est un autre essai basé sur la cytométrie de flux pour l’identification des cellules avec l’activité intracellulaire d’ALDH. Le principal problème est le manque de reproductibilité entre les études qui semblent être fortement influencées par les conditions culturelles54.

Le protocole de formation de sphères est souvent combiné à une analyse phénotypique, comme nous l’avons proposé ici, en mettant l’accent sur l’utilité de méthodes complémentaires pour identifier le CSC13,14. Nous avons recommandé l’enrichissement du SCC par l’intermédiaire du protocole de formation de sphère et une confirmation plus poussée de la tige par l’évaluation des marqueurs biochimiques par cytométrie de flux et tache occidentale. Les études de cytométrie de flux ont identifié des populations hétérogènes dans les sphères. En fait, il y a un enrichissement dans CSC dans les études montrées, représentées dans ce protocole par les cellulesbasses cD44 élevées/CD24. En raison de l’auto-renouvellement asymétrique du SCC24,d’autres phénotypes cellulaires ont également été identifiés. Dans le cas de CD133, les résultats représentatifs ont montré que la population avec une tige plus élevée était positive dans le cas de la lignée cellulaire ECC-1, mais négative dans les sphères RL95-2. Cela indique le manque de spécificité de certains marqueurs du SCC décrits, qui ne sont pas propres à ces cellules et peuvent varier en fonction de la plasticité du phénotype, et à l’importance d’utiliser une combinaison de stratégies pour confirmer la tige.

Western blot est une méthodologie alternative qui pourrait être utile dans certains cas. Par exemple, alors que l’activité ALDH est largement utilisée, il est maintenant connu que plusieurs isoformes contribuent à la métabolisation ALDEFLUOR54. Ainsi, des méthodes spécifiques d’antigène-anticorps pourraient être plus fiables et nous avons déjà montré l’association entre l’expression de protéine d’ALDH et la tige13,14.

La capacité de formation de sphères, l’auto-renouvellement et les populations adhérentes dérivées représentent la capacité du SCC de diviser indéfiniment et de produire une descendance différenciée, ce qui se traduit cliniquement par des événements tels que la rechute, la métastisation et la résistance au traitement9. La résistance aux médicaments dans le SCC peut s’expliquer par la surexpression des protéines membranaires multirésistantes (MDR), l’expression ALDH impliquée dans les mécanismes de désintoxication, les mécanismes de réparation de l’ADN, la protection contre les espèces réactives d’oxygène et la résistance à l’apoptose56. Le SCC a la capacité d’être tranquille en raison de sa plasticité, ce qui est devenu un mécanisme de résistance aux médicaments. Cette population peut être épargnée de la chimio et de la radiothérapie en raison du cycle cellulaire arrêté cellules différenciées57. Les sphères sont une population de tumeur avec la résistance rapportée aux drogues cytostatiques employées dans le traitement conventionnel et ont également été un foyer pour la combinaison avec les thérapies ciblées54,58,59. La sensibilité des sphères peut être testée pour les cytostatiques utilisés dans les cancers du sein et de l’endomètre. En outre, l’isolement de CSC d’un échantillon de tumeur peut être une plate-forme pour l’application clinique de la thérapie spécifique à chaque tumeur, prédisant la résistance et la maladie récurrente conséquente.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par la Société portugaise de gynécologie par le Prix de recherche 2016 et par CIMAGO. Cnc. L’IBILI est soutenue par la Fondation pour la science et la technologie, Portugal (UID/NEU/04539/2013), et cofinancée par FEDER-COMPETE (POCI-01-01-0145-FEDER-007440). La Banque de tumeurs de l’Hôpital et du Centre Universitaire de Coimbra (CHUC), agréée par le Comité d’éthique de la santé du CHUC et par la Commission nationale portugaise de protection des données, a été la source d’échantillons d’endomètre de patients suivis au Service de gynécologie de l’établissement. Figure 1 a été produite à l’aide de Servier Medical Art, disponible à partir de www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

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