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Cancer Research

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo de esta metodología es identificar células madre cancerosas (CSC) en líneas celulares cancerosas y muestras de tumores humanos primarios con el protocolo de formación de esferas, de manera robusta, utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica con citometría de flujo y occidental Blot.

Abstract

Las células madre cancerosas (CSC) son una pequeña población con auto-renovación y plasticidad que son responsables de la tumorigenesis, la resistencia al tratamiento y la enfermedad recurrente. Esta población se puede identificar por marcadores de superficie, actividad enzimática y un perfil funcional. Estos enfoques per se son limitados, debido a la heterogeneidad fenotípica y la plasticidad CSC. Aquí, actualizamos el protocolo de formación de esferas para obtener esferas CSC a partir de cánceres mamarios y ginecológicos, evaluando las propiedades funcionales, los marcadores CSC y la expresión de proteínas. Las esferas se obtienen con sembrado de una sola célula a baja densidad en cultivo de suspensión, utilizando un medio semisólido de metilcelulosa para evitar la migración y los agregados. Este protocolo rentable se puede utilizar en líneas celulares de cáncer, pero también en tumores primarios. El cultivo tridimensional de suspensión no adherente que se cree que imita el microambiente tumoral, particularmente el nicho CSC, se complementa con factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento básico de fibroblastos para garantizar la señalización de CSC. Con el objetivo de una identificación sólida de la CSC, proponemos un enfoque complementario, que combine la evaluación funcional y fenotípica. La capacidad de formación de esferas, la autorenovación y el área de proyección de esferas establecen propiedades funcionales de CSC. Además, la caracterización comprende la evaluación de la citometría de flujo de los marcadores, representada por CD44+/CD24- y CD133, y Western blot, considerando ALDH. El protocolo presentado también fue optimizado para muestras de tumores primarios, después de un procedimiento de digestión de muestra, útil para la investigación traslacional.

Introduction

Las poblaciones de cáncer son heterogéneas, con células que presentan diferentes morfologías, proliferación y capacidad de invasión, debido a la expresión génica diferencial. Entre estas células, existe una población minoritaria denominada células madre cancerosas (CSC)1, que tienen la capacidad de auto-renovación, recapitulando la heterogeneidad del nicho tumoral primario y produciendo progenitores aberrantes diferenciadores que no responden adecuadamente a los controles homeostáticos2. Las propiedades de CSC se pueden traducir directamente en la práctica clínica, dada la asociación con eventos, como la tumorogenicidad o la resistencia a la quimioterapia3. La identificación de la CSC puede conducir al desarrollo de terapias dirigidas que pueden incluir bloqueo de marcadores superficiales, promoción de la diferenciación de CSC, bloqueo de los componentes de la vía de señalización de CSC, destrucción de nichos y mecanismos epigenéticos4.

El aislamiento de CSC se ha realizado en líneas de células y en muestras de tumores primarios5,6,7,8. El perfil funcional descrito para CSC incluye la capacidad clonogénica, la población lateral y la formación de tumorosfera9. El fenotipobajo CD44alto/CD24 se ha asociado consistentemente con la CSC mamaria, que ha demostrado ser tumorigénico in vivo y ya se ha asociado con la transición epitelial a mesenquimal5,10. La alta actividad de ALDH también se ha asociado con la talloy y la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en varios tipos de tumores sólidos11. La expresión ALDH se ha asociado con la resistencia a la quimioterapia y al fenotipo CSC in vitro12,13,14,15,16. Varios otros marcadores se han vinculado a propiedades CSC en diferentes tipos de tumores, como CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 y otros, como se describe en la Tabla 1.

Las tumoresferas consisten en un modelo tridimensional para el estudio y la expansión de la CSC. En este modelo, las suspensiones celulares de las líneas celulares y de muestras de sangre o tumores se cultivan en un medio complementado con factores de crecimiento, a saber, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), sin suero bovino fetal y en condiciones no adherentes17. La inhibición de la adhesión celular resulta en la muerte por anoikis de células diferenciadas18. Las esferas se derivan del crecimiento clonal de una célula aislada. Para ello, las celdas se distribuyen a baja densidad para evitar la fusión de celdas y la agregación19. Otra estrategia incluye el uso de metilcelulosa semisólida20.

El protocolo de formación de esferas ganó popularidad en el aislamiento y expansión de CSC, debido al tiempo y costo y razones técnicas, rentables y reproducibles21,22. A pesar de algunas reservas sobre la extensión de la cual la formación de esferas refleja CSC, existe una propensión a que las células madre crezcan en condiciones no adherentes con el fenotipo característico, que se asemeja al microambiente nativo21. Ninguno de los métodos disponibles para el aislamiento de la CSC de los tumores sólidos tiene una eficiencia completa, lo que pone de relieve la importancia de desarrollar marcadores o combinaciones más específicas de metodologías y marcadores.

En este protocolo, detallamos el aislamiento de CSC con el protocolo de formación de esferas, con el principio de crecimiento de una sola célula en condiciones no adherentes y la capacidad de producir un fenotipo diferenciado. En la Figura 1se representa una representación esquemática de este procedimiento. También describimos la caracterización con marcadores de superficie y expresión ALDH para CSC, tanto para líneas de células tumorales mamarias como ginecológicas y muestras de tumores primarios.

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Protocol

Este protocolo se realizó cumpliendo con las directrices éticas del Banco de Tumores del Hospital y Centro Universitario de Coimbra (CHUC), y fue aprobado por el Comité de ética de salud de la CHUC y por la Comisión Nacional de Protección de Datos de Portugal.

1. Protocolo de formación de esferas y poblaciones adherentes derivadas de cultivos celulares continuos

NOTA: Realice todos los procedimientos bajo estrictas condiciones estériles.

  1. Preparación de matraces o placas de cultivo de suspensión no adherentes cubriendo la superficie de crecimiento con poli(2-hidroxietilo-metacrilato (poli-HEMA)
    1. Preparar una solución de 15 mg/ml agitando poly-HEMA en etanol absoluto a 65 oC. Recubrir matraces de cultivo celular con 50 l/cm2.
    2. Dejar secar a 37oC en un horno de secado. Si es necesario, envuelva los platos y guárdelos a temperatura ambiente.
  2. Preparación de los medios de cultivo de la esfera (SCM)
    1. Preparar una solución del 2% de metilcelulosa en agua ultrapura y esterilizar en el autoclave. La metilcelulosa tiende a ser más fácil de solubilizar por enfriamiento; por lo tanto, disperse el polvo en agua a 80 oC y revuelva hasta que se enfríe23.
    2. Preparar una solución dos veces concentrada de SCM (solución de stock). SCM solución de trabajo contiene DMEM-F12, complementado con 100 mM putrescine, 1% insulina, transferrina, selenio y 1% solución antibiótica-antimicótica (10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina y 25 g/ml de anfotericina B).
    3. Para preparar el SCM, mezcle volúmenes iguales de la solución de stock de SCM con la solución del 2% de metilcelulosa.
    4. Complete el medio inmediatamente antes de su uso añadiendo 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EFG) y factor de crecimiento de fibroblastobásico básico de 10 ng/ml (bFGF).
    5. Si se utilizan líneas celulares más fastidiosas, complementar el medio con 0.4% albúmina sérica bovina, que podría ser una ventaja.
  3. Comience con un matraz de cáncer de mama MCF7 o HCC1806 o células cancerosas de endometrio ECC-1 o RL95-2 (u otra línea celular cancerosa de elección) con una confluencia del 80% al 90%.
  4. Deseche los medios de cultivo celular, lave con solución salina tamponada de fosfato (PBS) y separe las células con trippsina-EDTA (1 a 2 ml para un matraz de cultivo de75 cm 2 células).
  5. Añadir medios de cultivo celular (2 a 4 ml para un matraz de cultivo celular de 75 cm2) y centrífuga a 200 x g durante 5 min para desechar enzimas.
  6. Suspenda el pellet en un volumen conocido de medios de cultivo celular y pipetas hacia arriba y hacia abajo para asegurar una suspensión de una sola célula. Para ello, se puede utilizar un colador de células de 40 m.
  7. Cuente las células en el hemocitómetro y calcule la concentración celular de la suspensión celular. Aproveche este paso para asegurar la observación de una suspensión de una sola célula. El recuento cuidadoso de células es esencial para cuantificar con precisión los efectos de los tratamientos.
  8. Suspenda la cantidad determinada de suspensión celular en medio completo de SCM y transfiera a platos recubiertos con poli-HEMA. Como valor de referencia para la densidad de sembrado, considere entre 500 y 2000 celdas/cm2.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente la optimización de la densidad de sembrado y el tiempo de cultivo de cada línea celular24.
  9. Incubar a 37oC y 5%CO2 durante 2 días sin perturbar las placas.
  10. Restablezca la concentración de factores de crecimiento añadiendo EFG de 10 ng/ml y bFGF de 10 ng/ml al medio de cultivo celular. Repita este paso cada dos días.
  11. Incubar a 37oC y 5%co2 hasta 5 días después del enchapado (esto puede variar de 3 a 12 días según la línea celular) para obtener esferas, que presentan la morfología de las colonias celulares en forma de bola de suspensión.
  12. Utilice o recoja las esferas, mediante pipeteo, para los experimentos.
  13. Para obtener poblaciones adherentes derivadas, coloque las esferas en condiciones de cultivo estándar, respectivamente de la línea celular utilizada. 1 a 2 días después, es posible observar una monocapa de células que crecen alrededor de las esferas adherentes, que presenta una morfología similar a la línea de origen celular.

2. Protocolo de formación de esferas a partir de muestras de tumores humanos

NOTA: El uso de muestras humanas con fines de investigación debe cumplir con la legislación de cada país y ser aprobado por el Comité de ética de las Instituciones involucradas.

  1. Preparar los medios de transporte que contengan DMEM/F12, complementados con suero bovino fetal al 10% (FBS) y solución antibiótica antibiótica antibiótica (10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina y 25 g/ml de anfotericina B).
  2. Preparar los medios de digestión que contengan DMEM/F12, complementados con 10% FBS, 1% solución antibiótica antimicótica, 1 mg/ml de colagenasa tipo IV y 100 g/ml de DNAse I.
  3. Preparar los medios de inactivación enzimáticos que contengan DMEM/F12, complementados con 10% de FBS y 1% de solución antibiótica-antimicótica (10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina y 25 g/ml de anfotericina B).
  4. Prepare el SCM como se describe en la sección 1.2.
  5. Obtener la muestra durante el estudio macroscópico de la pieza operativa tan pronto como sea posible después de la extracción quirúrgica.
  6. Coloque las muestras en medios de transporte y transfieralas al laboratorio para realizar su procesamiento. El procesamiento de muestras debe comenzar dentro de 1 h después de la recopilación para mejorar la tasa de éxito del procedimiento. Tenga cuidado en la recolección de muestras. Manipule las muestras con cuidado. Evite el uso de zonas necróticas o cauterizadas.
  7. Debajo de la cámara de flujo estéril, transfiera la muestra a un plato y corte en trozos más pequeños (alrededor de 1 mm3) con un bisturí.
  8. Incubar el tejido humano en un tubo con medios de digestión en una coctelera giratoria de hasta 180 min, a 37oC. Identifique este tubo como Tubo A.
  9. Reemplace la solución enzimática cada 15 minutos.
    1. Recoger los medios de digestión (sin extraer ningún fragmento de tejido) y transferirlo a través de un colador celular de 40 m a un nuevo tubo medio lleno de medios de inactivación enzimáticos. Mantenga este tubo a temperatura ambiente e identifíquelo como Tubo B.
    2. Añadir nuevos medios de digestión al tubo A y devolverlo a la coctelera giratoria a 37 oC.
    3. En cada colección, compruebe la viabilidad de la celda utilizando el método de exclusión azul trypan.
    4. Repita este procedimiento durante 180 min o hasta que el recuento de células sea significativamente menor.
  10. Incubar los fragmentos de tejido en el tubo A en una segunda solución de digestión que contenga partes iguales de accutase y trippsina-EDTA, agitando durante 10 min a 37 oC.
  11. Agregue el medio de inactivación de enzimas al tubo A y filtre el contenido a través de un colador de células de 40 m en el tubo B.
  12. Centrifugar la suspensión celular en el tubo B a 200 x g durante 10 min.
  13. Suspenda el pellet en SCM y compruebe la concentración celular utilizando un hemocitómetro.
  14. Suspenda la cantidad determinada de suspensión celular en SCM y transfiera a platos recubiertos con poli-HEMA (ver paso 1.1) con una densidad de semilla de 4000 celdas/cm2.
  15. Incubar a 37oC y 5%CO2 durante 2 días sin perturbar las placas.
  16. Restablezca la concentración de factores de crecimiento añadiendo EFG de 10 ng/ml y bFGF de 10 ng/ml al medio de cultivo celular.
    NOTA: Debe hacerlo cada dos días.
  17. Incubar a 37oC y 5%co2 hasta 5 días después del enchapado (esto puede variar hasta 12 días) para obtener esferas, que presentan la morfología de las colonias celulares en forma de bola de suspensión.

Figure 1
Figura 1: Obtención de células madre cancerosas de muestras de tumores endometriales humanos (A) y líneas celulares de cáncer de mama y ginecológico (B). Las muestras de tumores humanos se fragmentan, digieren enzimáticamente y se enmarcan en esfera que cultuculen medio en platos recubiertos de poli-HEMA. Las líneas celulares cancerosas se separan, se cuentan las suspensiones celulares y las células individuales se distribuyen a baja densidad en placas recubiertas de poli-HEMA en condiciones adecuadas. Las esferas obtenidas, cuando se colocan bajo condiciones de cultivo adherentes, producen poblaciones adherentes derivadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Capacidad de formación de esferas, auto-renovación y área de proyección de esferas

NOTA: La capacidad de formación de esferas es la capacidad de una población de células tumorales para producir esferas. La autorenovación es la capacidad de las células esferas para producir nuevas colonias de células esféricas en suspensión. El área de proyección de la esfera es representativa del área ocupada por la esfera y por lo tanto expresiva de su tamaño y el número de divisiones celulares experimentadas en un cierto período de tiempo.

  1. Determinación de la capacidad de formación de esferas
    1. Después de completar el protocolo de formación de esferas, recoger las esferas en un tubo de centrífuga y centrífuga a 125 x g durante 5 min.
    2. Deseche el SCM y suspenda suavemente el pellet en un volumen conocido de medios frescos. Con el objetivo de concentrar las esferas para facilitar el conteo, suspenda las esferas en un pequeño volumen de medios. Tenga cuidado de no molestar a las esferas.
    3. Utilice un hemocitómetro para contar las esferas con más de 40 m de diámetro. Alternativamente, las esferas se pueden contar directamente en la placa mediante el uso de un microscopio equipado con una retícula25 o utilizando un sistema automatizado26,27.
    4. Calcular la proporción porcentual de esferas obtenidas frente al número de celdas inicialmente chapadas.
  2. Determinación de la autorenovación
    1. Después de completar el protocolo de formación de esferas, recoger las esferas en un tubo de centrífuga y centrífuga a 125 x g durante 5 min.
    2. Deseche los medios de cultivo de la esfera y suspenda suavemente el pellet en trippsin-EDTA.
    3. Incubar hasta 5 min a 37oC.
    4. Agregue medios de inactivación enzimática y pipetas hacia arriba y hacia abajo para asegurar una suspensión de una sola célula.
    5. Usando un hemocitómetro y el método de exclusión azul trypan, cuente las células viables en la suspensión.
    6. Inicie el protocolo de formación de esferas como se describe en la sección 1.
    7. Después de 8 días, utilice un hemocitómetro para contar las esferas con más de 40 m de diámetro.
    8. Calcular la proporción porcentual de esferas obtenidas frente al número de celdas inicialmente chapadas.
  3. Determinación del área de proyección de la esfera
    1. Para evaluar el área ocupada por las esferas, obtener imágenes de al menos 10 campos aleatorios por condición, en un microscopio invertido equipado con un módulo de adquisición de imágenes. Se recomienda un aumento de 100X a 400X.
    2. Analizar imágenes utilizando software de imágenes, como el software ImageJ28,dibujando áreas de interés correspondientes a las esferas y midiendo su área en píxeles.
    3. Calcule el área de proyección de esfera como el área media de píxeles medida.

4. Evaluación del marcador de células madre del cáncer con citometría de flujo

NOTA: CD44+/CD24-/fenotipo bajo se asoció constantemente con células madre de cáncer de mama y ginecológico. El procedimiento descrito se puede utilizar para evaluar este y otros marcadores de superficie celular.

  1. Después de completar el protocolo de formación de esferas, recoger las esferas en un tubo de centrífuga y centrífuga a 125 x g durante 5 min.
  2. Deseche el SCM y suspenda suavemente el pellet en trippsin-EDTA.
  3. Incubar hasta 5 min a 37oC.
  4. Agregue medios de inactivación enzimática y pipetas hacia arriba y hacia abajo para asegurar una suspensión de una sola célula.
  5. Centrifugar a 125 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y suspender suavemente las células en PBS.
  6. Deje que las células descansen en suspensión durante 30 minutos para asegurar la recuperación de la conformación de la membrana.
  7. Usando un hemocitómetro y el método de exclusión azul trypan, cuente las células en la suspensión.
  8. Ajuste el volumen de la suspensión celular a 106 celdas/500 l.
  9. Incubar con los anticuerpos monoclonales de acuerdo con las instrucciones de los proveedores (concentración, tiempo, temperatura y luz/oscuridad) y teniendo en cuenta el conjunto de experimentos representado en el Cuadro 2 o los marcadores indicados en el Cuadro 1.
  10. Inmediatamente después de la tinción, realice el análisis citométrico de flujo utilizando un catómetro de flujo con módulos de detección adecuados.
  11. Estandarizar la configuración del citómetro, siguiendo los protocolos establecidos por el EuroFlow Consortium29.
  12. Configure las puertas primarias en función de la dispersión hacia adelante y lateral, excluyendo los desechos y las células muertas. Esto puede mejorarse mediante el etiquetado concomitante con células anexionantes V y células negativas de gating.
  13. Establezca puertas de fluorescencia basadas en las muestras no retenidas y compensación para una superposición espectral utilizando controles de tinta individuales.

5. Evaluación del marcador de células madre del cáncer con Western Blot

NOTA: Además de la actividad DE ALDH1, la alta expresión de este marcador se asoció constantemente con las células madre de cáncer de mama y ginecológico13,14. El procedimiento descrito se puede utilizar para evaluar este y otros marcadores de celda.

  1. Después de completar el protocolo de formación de esferas, recoger las esferas en un tubo de centrífuga y centrífuga a 125 x g durante 5 min.
  2. Preparación de los líticos de células enteras
    1. Coloque los tubos de centrífuga sobre hielo y deseche el sobrenadante sin interrumpir el pellet.
    2. Lavar el pellet con 1 ml de PBS frío y desechar por centrifugación.
    3. Suspenda el pellet en un pequeño volumen (200-500 l) de tampón de lisis RIPA30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7,4, Triton-X100 1% vol./vol., ácido desoxicólico de sodio 0,5% wt./vol., dodecyl sulfato sódico 0,5% wt./vol.) complementado con cOmplete Mini y ditiothreitol 1 mM.
    4. Manteniendo las muestras frías (sobre hielo), enviarlas al vórtice y sonicación con una amplitud del 30%.
    5. Centrifugar las muestras durante 15 min a 14.000 x g en una centrífuga refrigerada establecida en 4oC.
    6. Transfiera los sobrenatantes a microtubos nuevos y debidamente identificados.
    7. Determinar las concentraciones de proteínas utilizando los ensayos BCA o Bradford31.
    8. Si es necesario, almacene las muestras a -80 oC hasta que se pueda analizar la mancha occidental.
  3. Realizar la desnaturalización de la muestra, electroforesis, transferencia de electrones y detección de proteínas de acuerdo con los protocolos de hinchamiento occidentales estándar, como se describe32,33,34.

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Representative Results

El protocolo de formación de esferas permite obtener colonias esféricas en suspensión de varias líneas celulares de cáncer de mama y endometriales (Figura 2A) o después de una suave digestión enzimática del tejido a partir de muestras de tumores humanos(Figura 2E). En ambos casos, pocos días después del enchapado, se obtienen colonias esféricas monoclonales en suspensión. Tanto las esferas del endometrio como las de cáncer de mama dan lugar a una monocapa celular con una morfología similar a la línea de origen celular, de 1 a 2 días después del revestimiento(Figura 2A).

El linaje y los orígenes de tejidos distintos se pueden comparar con la capacidad de formación de esferas, la autorenovación y el área de proyección. Los resultados representativos de las líneas celulares de cáncer de mama se pueden observar en los gráficos de la Figura 2B-D. Las células del cáncer de mama MCF7, receptor-positivo del receptor hormonal, muestran una mayor capacidad de formación de esferas, auto-renovación y área de proyección que las células de cáncer de mama triple negativo HCC180614. Para ambas líneas celulares, un pequeño porcentaje de las células chapadas (menos del 3%) fue capaz de producir esferas que enfatizan las células madre cancerosas como una población minoritaria dentro de la heterogeneidad de células tumorales. La autorenovación de las células madre cancerosas fue patentada por un valor significativamente diferente de la auto-renovación de la esfera de las líneas celulares representadas. El área de proyección de esferas, como medida aproximada de la dimensión de las esferas, se correlaciona con el número de ciclos mitoticos y muestra diferentes intervalos de tiempo para ambos linajes.

Mientras que sólo una pequeña proporción de células es capaz de formar tumoresferas in vitro y conservar la capacidad de auto-renovación que transporta propiedades de células madre, varios marcadores se asociaron con este fenotipo.

El protocolo de citometría de flujo presentado permite enfoques experimentales versátiles, teniendo en cuenta los antígenos superficiales (ver Tabla 1). Los resultados representativos, mostrados en la Figura 3A-B,se refieren a los marcadores de membrana CD44/CD24 y CD133 que se han propuesto como correspondientes a un fenotipo similar a una célula madre más cancerígena. El análisis de las esferas obtenidas a partir de líneas celulares endometriales RL95-2 y ECC-1 permitió identificar cuatro poblaciones(Figura 3A). Las esferas obtenidas del endometrial RL95-2 comprendieron un CD44alto/CD24- población tres veces mayor que la línea de células parentales35. En el caso de las esferas ECC-1, el CD44alto/CD24- corresponde a la población principal, que también es CD133 positivo, mientras que el CD44bajo/CD24-, CD44bajo/CD24+ y CD44-/CD24+ tienen expresión CD133 negativa o baja.

La evaluación de los marcadores de superficie e intracelular también puede ser realizada por la mancha occidental después de la recolección suave de la esfera y la preparación cuidadosa de la muestra de proteína. La Figura 3C muestra los resultados típicos del cambio de ALDH, un marcador cuya mayor actividad o expresión de proteína aumentada está asociada con el fenotipo13de células madre cancerosas,14 en esferas y células adherentes derivadas con respecto a la línea de origen celular endometrial ECC1.

Figure 2
Figura 2: Células de cáncer de mama, esferas y poblaciones adherentes derivadas. (A) . Imágenes representativas de líneas celulares cancerosas de endometrio (RL95-2 y ECC-1) y de mama (MCF7 y HCC1806), esferas de endometrio (ES1) y mama (MS1) y poblaciones adherentes derivadas (G1). Se obtuvieron imágenes representativas de las líneas celulares cancerosas RL95-2, ECC-1, MCF7 y HCC1806 con un aumento de 200x (barra de escala a 50 m). Se obtuvieron imágenes representativas de ES1 RL95-2 y ES1 ECC-1 con un aumento de 200x (barra de escala de 50 m). Se obtuvieron imágenes representativas de MS1 MCF7 y MS1 HCC1806 con un aumento de 200x (barra de escala de 100 m). Se obtuvieron imágenes representativas de G1 RL95-2 y G1 ECC-1 con un aumento de 200x (barra de escala de 50 m). Se obtuvieron imágenes representativas de G1 MCF7 y G1 HCC1806 con un aumento de 200x (barra de escala de 100 m). (B-D) . Capacidad de formación de esferas, auto-renovación y área de proyección de esferas de esferas de cáncer de mama MCF7 y HCC1806. (E) . Imágenes representativas de esferas obtenidas a partir de muestras de tumores endometriales humanos. Estas imágenes fueron capturadas con un aumento de 200x (barra de escala a 50 m). Parte de esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior con el permiso del editor14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación combinada de marcadores de células madre cancerosas en células cancerosas de endometrio. (A) . Parcelas representativas del etiquetado CD44/CD24 de la línea celular RL95-2 y de las células de la esfera RL95-2. (B) . Histogramas representativos del etiquetado CD133 de células esferas (ES1) obtenidos de líneas celulares RL95-2 y ECC-1. La densidad representa una medida del recuento de celdas. CD44+/CD24-, CD44bajo/CD24-, CD44bajo/CD24 y CD44-/CD24+ las poblaciones se pintan en verde, rosa, azul y amarillo, respectivamente. C. Expresión ALDH en línea celular ECC-1, esferas (ES1) y población adherente derivada (G1). El inmunoblot representa la ALDH y la expresión de actina para las respectivas condiciones experimentales. La expresión ALDH se evaluó con el anticuerpo ALDH1/2, que detecta las isoformas ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 y ALDH2 de origen ratón, rata y humano. Parte de esta cifra ha sido modificada de publicaciones anteriores con el permiso de los editores13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de marcadores de células madre de cáncer ginecológico y de mama.

Marcador Origen de las células madre Referencias
CD24 Cáncer de ovario 60
CD29 Cáncer de mama 61
CD44 Cáncer de ovario 62,63
CD44/CD24-/bajo Cáncer de mama 13,5,3,64
CD44+/CD24-/bajo/ESA Cáncer de mama 65
CD44/ALDH1+/hi Cáncer de mama 66
CD44/CD24-/low/ABCG2 Cáncer de mama 67
CD44/CD24-/bajo/ALDH1 Cáncer de mama 43,68,69
CD44/CD24-/bajo/EpCAM Cáncer de mama 5
CD44/CD24-/bajo/SSEA-3 Cáncer de mama 70
CD44/CD49f/CD133/2 Cáncer de mama 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Cáncer de mama 69
CD44/CD117 Cáncer de ovario 7
CD44/MyD88 Cáncer de ovario 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Cáncer de ovario 74,75
CD44/CD24/Epcam Cáncer de ovario 76,77
CD44/CD24- Cáncer de ovario 78,79
CD44/CD166 Cáncer de ovario 80
CD44/CD24 Cáncer de cuello uterino 81
CD49f Cáncer de mama 4
Cáncer de cuello uterino 82
CD117 o c-Kit Cáncer de endometrio 83
Cáncer de ovario 62,84
CD133 Cáncer de mama 4,85
Cáncer de ovario 62,86
Cáncer de endometrio 13,87,88,89
Cáncer de cuello uterino 82
CD133hi/CXCR4hi/ALDH1hi Cáncer de mama 90
CD133/ALDH1 Cáncer de mama 91
Cáncer de ovario 60,92
CD133/CXCR4 Cáncer de endometrio 93
ABCG2 Cáncer de mama 65
Cáncer de cuello uterino 82,81
ALDH-1 Cáncer de mama 4
Cáncer de endometrio 94,95
Cáncer de cuello uterino 82
CXCR4 o CD184 Cáncer de mama 96
EpCAM/CD49f Cáncer de mama 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Cáncer de mama 70
GD2/GD3/GD3Shi Cáncer de mama 98
ITGA6 Cáncer de mama 4
PROCR Cáncer de mama 43

NOTA: Esta tabla proporciona una lista de epítopos superficiales expresados por varias células madre ginecológicas y de cáncer de mama; la mayoría de estos marcadores también se expresan por una serie de otros tejidos. Esta lista no tiene como objetivo incluir todos los marcadores notificados.

Tabla 2: Lista de tubos que se incluirán en un experimento típico de citometría de flujo para evaluar el fenotipo CD24/CD44. La tabla muestra un conjunto mínimo de tubos de muestra necesarios para un experimento de co-tinción, incluidos los controles necesarios.

Tubo Condición Antígeno-fluoróforo
1 Células no manchadas Ninguno
2 CD44 teñido único CD44-PE
3 CD24 teñido único CD24-APC
4 CD44/CD24 de doble mancha CD44-PE y CD24-APC

NOTA: Este experimento se puede realizar añadiendo annexin V-FICT al tubo 4 y agregando el tubo de control respectivo para comigar las células negativas de la anexión V y excluir las células eventuales en la apoptosis.

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Discussion

Este protocolo detalla un enfoque para obtener tumoresferas a partir de líneas celulares cancerosas y muestras humanas primarias. Las tumorferas se enriquecen en una subpoblación con propiedades similares a células madre36. Este enriquecimiento en CSC depende de la viabilidad en un entorno libre de anclaje, mientras que las células diferenciadas dependen de la adhesión a un sustrato37. Como el revestimiento primario de células tumorales en un entorno de baja adherencia que impone suspensión no garantiza el enriquecimiento en CSC per se, proporcionamos estrategias para evaluar la auto-renovación (capacidad de formación de esferas y auto-renovación), capacidad de diferenciación (poblaciones derivadas adherentes) y fenotipo de CSC (con citometría de flujo y/o mancha occidental). Las células madre cancerosas se pueden identificar a través de varios marcadores fenotípicos ampliamente descritos (ver Tabla 1).

Como los cultivos primarios de tumores humanos a menudo son difíciles de establecer y mantener en cultivo, el protocolo de formación de esferas podría proporcionar una herramienta para manejar estas muestras. El procedimiento de digestión enzimática sugerido proporcionó suspensiones de una sola célula a partir de muestras de tejido endometrial38. El protocolo de formación de esferas proporciona un número significativo de CSC, que son difíciles de obtener por otros medios. El modelo tridimensional podría ser más eficiente para imitar la situación in vivo, a saber, el microambiente fisiológico y la heterogeneidad tumoral, que los cultivos celulares monocapa convencionales.

La certeza sobre el origen monoclonal de las tumoresferas es un paso crítico de este protocolo. Minimizar la agregación, que tiende a ocurrir en cultivos de suspensión, y una optimización completa de las densidades de sembrado para distribuir suspensiones de una sola célula son cruciales24. Otros autores sugirieron el enchapado de una sola célula por pozo39,40. Para evitar este laborioso procedimiento, superamos este problema asegurando que una suspensión de una sola célula esté chapada en baja densidad en un medio enriquecido con metilcelulosa. Debido a sus propiedades de retención de agua y viscosidad23,la metilcelulosa proporciona un medio semisólido que evita la migración y la agregación, asegurando la monoclonalidad de las esferas obtenidas21. El número de días en el cultivo es otro aspecto que depende de la optimización, ya que el número de días necesarios para obtener esferas con diámetros superiores a 40 m depende de cada tipo de celda que duplique el tiempo24. El medio bajo o libre de suero es otra característica del protocolo, ya que el medio que contiene FBS es relevante para el crecimiento celular diferenciado en condiciones adherentes41,como en las líneas celulares parentales y en las células adherentes derivadas. El protocolo depende del mantenimiento de una concentración constante de los factores de crecimiento específicos. La señalización EGF desempeña un papel importante en el mantenimiento de las vías de pluripotencia, mientras que el bFGF actúa como un mitógeno que contribuye a la generación de esferas42,43.

El protocolo de formación de esferas, asociado con técnicas adecuadas, proporciona los medios para ampliar, aislar y evaluar poblaciones específicas de CSC21. Varios autores han señalado su utilidad en la evaluación de la expresión génica de células madre44,45,46,47 y la talloentoría en tumores47,48, para estudiar la transición epitelial-mesenquimal44,49 y la tumorigenesis45,48, para evaluar el efecto de las nuevas terapias21,50 y resistencia a fármacos44, 51, y establecer cultivos a partir de las muestras primarias21,45,46. Sin embargo, es importante tener en cuenta que se trata de un experimento sensible, altamente dependiente de condiciones de cultivo adecuadas. Además, las esferas presentan heterogeneidad celular debido a la división asimétricaCSC 52 y no representan un buen modelo de la complejidad de la formación y mantenimiento de células madre cancerosas en el nicho in vivo46.

Además del protocolo de formación de esferas, se han utilizado otros ensayos funcionales para la detección de CSC. La tumorigenidad in vivo implica la inoculación de números de células bajas en ratones inmunocomprometidos para obtener tumores36,53. Esto depende de la disponibilidad de condiciones adecuadas para realizar estudios en animales, y debido al microambiente no específico de la especie, la recuperación de las células vivas podría ser un desafío. Un ensayo de unidad formadoras de colonias, que evalúa la capacidad celular para generar colonias después de que están chapadas a baja densidad52,proporciona números de células bajos. La población lateral depende de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar un grupo de células con la capacidad de extruir la mancha Hoescht 33342. Este método sensible se basa en la expresión de transportadores de proteína de casete de unión ATP (ABC), responsables de la eflujo defármacos 54. Sin embargo, la población lateral se asocia con algunas desventajas, a saber, la no especificidad de algunos fenotipos de CSC y las características del tinte, que es tóxico y está influenciado en gran medida por las condiciones experimentales (temperatura, concentración)54,55. ALDEFLUOR es otro ensayo basado en citometría de flujo para la identificación de células con actividad alDH intracelular. El problema principal es la falta de reproducibilidad entre estudios que parecen estar muy influenciados por las condiciones de cultivo54.

El protocolo de formación de esferas se combina a menudo con el análisis fenotípico, como propusimos aquí, haciendo hincapié en la utilidad de métodos complementarios para identificar CSC13,14. Recomendamos el enriquecimiento de CSC a través del protocolo de formación de esferas y una mayor confirmación de la talloría a través de la evaluación de marcadores bioquímicos por citometría de flujo y mancha occidental. Los estudios de citometría de flujo identificaron poblaciones heterogéneas dentro de las esferas. De hecho, hay un enriquecimiento en CSC en los estudios mostrados, representados en este protocolo por las célulasbajas CD44high/CD24. Debido a la autorenovación asimétrica de CSC24,también se identificaron otros fenotipos celulares. En el caso de CD133, los resultados representativos mostraron que la población con mayor tallo era positiva en el caso de la línea celular ECC-1, pero negativa en esferas RL95-2. Esto apunta a la falta de especificidad de algunos marcadores CSC descritos, que no son exclusivos de estas células y pueden variar con la plasticidad del fenotipo, y a la importancia de utilizar una combinación de estrategias para confirmar la talla.

Western blot es una metodología alternativa que podría ser útil en ciertos casos. Por ejemplo, mientras que la actividad ALDH se utiliza ampliamente, ahora se sabe que múltiples isoformas contribuyen a la metabolización al -DEFLUOR54. Por lo tanto, métodos específicos de antígeno-anticuerpo podrían ser más fiables y ya mostramos la asociación entre la expresión de proteína ALDH y la talloncia13,14.

La capacidad de formación de esferas, la autorenovación y las poblaciones adherentes derivadas representan la capacidad de la CSC para dividir indefinidamente y producir una progenie diferenciada, que se traduce clínicamente en eventos como la recaída, la metastización y la resistencia al tratamiento9. La resistencia a los fármacos en CSC puede explicarse por la sobreexpresión de las proteínas de membrana de resistencia multifármaco (MDR), la expresión ALDH implicada en los mecanismos de desintoxicación, los mecanismos de reparación del ADN, la protección contra las especies reactivas de oxígeno y la resistencia a la apoptosis56. CSC tiene la capacidad de estar en reposo debido a su plasticidad y esto ha surgido como un mecanismo de resistencia a los fármacos. Esta población se puede salvar de la quimioterapia y la radioterapia debido al ciclo celular arrestado células diferenciadas57. Las esferas son una población tumoral con resistencia reportada a los fármacos citostáticos utilizados en el tratamiento convencional y también han sido un foco para la combinación con terapias dirigidas54,58,59. La sensibilidad de las esferas se puede analizar para detectar citostáticos utilizados en cánceres de mama y endometrial. Además, el aislamiento de CSC de una muestra de tumor puede ser una plataforma para la aplicación clínica de la terapia específica para cada tumor, prediciendo resistencia y consecuente enfermedad recurrente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por la Sociedad Portuguesa de Ginecología a través del Premio de Investigación 2016 y por CIMAGO. Cnc. IBILI cuenta con el apoyo de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología, Portugal (UID/NEU/04539/2013), y cofinanciado por FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). El Banco de Tumores del Hospital y Centro Universitario de Coimbra (CHUC), aprobado por el Comité de ética de la Salud de la CHUC y por la Comisión Nacional de Protección de Datos de Portugal, fue la fuente de muestras endometriales de pacientes seguidas en el Servicio de Ginecología de la institución. La Figura 1 fue producida usando Servier Medical Art, disponible en www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

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