Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה מכנית לבודד מקרופאגים במהירות מתוך גנגליון שורש השורש עבור פנוטיפים וניתוח פונקציונלי.
Abstract
ישנם אינטרסים הגדלים כדי ללמוד את האינטראקציות המולקולריות והסלולר בקרב תאים חיסוניים ונוירונים חושים בתוך גנגליה שורש הגוף לאחר פציעה עצבית היקפית. תאים מונציטוטיים היקפיים, כולל מקרופאגים, ידועים להגיב לפגיעה ברקמה באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cy,. ראיות מתעוררים יש מעורב את התרומה של מקרופאגים השורש הדו להתפתחות הכאב נוירופתי ותיקון סיבי בהקשר של פגיעה בעצב. פנוטיפים במהירות (או "בידוד מהיר של") התגובה של מקרופאגים השורש הדו בהקשר של פגיעה בעצב רצוי לזהות את הגורמים הנוירוחיסוניים לא ידוע. כאן אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו במהירות וביעילות מבודד מקרופאגים מהגנגוליה השורש הגבי באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה ללא אנזים מכני. הדגימות נשמרות על הקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי פרוטוקול זה הוא הרבה פחות זמן רב בהשוואה לפרוטוקול אנזימטי הסטנדרטי ושימש באופן שגרתי עבור ניתוח מיון התאים שלנו מסוג פלואורסצנטית.
Introduction
יש כעת ראיות רבות כי התאים החיסוניים תורמים לכאב נוירופתי בעקבות פציעת העצב ההיקפי1,2. תאים היקפיים, כולל מקרופאגים בוגרים, ידועים כתגובה לפגיעה ברקמות ולזיהום מערכתי באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cyטוקין. מקבילים נזק עצבי המושרה מיקרוגלייה הפעלה בקרן השדרה, מקרופאגים ב גרעינים שורש השורש (drg) גם להרחיבבאופן משמעותי לאחר פגיעהבעצב 3,4. במיוחד, ישנם האינטרסים גוברת כדי לקבוע אם המקרופאגים תורמים להתפתחות כאב נוירופתי לאחר פגיעה בעצב היקפי על ידי אינטראקציה עם נוירונים חושים ב drg5,6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה גם לסבך את התרומה של מקרופאגים drg בתיקון סיבי לאחר פציעה העצב12,13. עוד מחקר מציע כי מקרופאג תת אוכלוסיות (כלומר, CD11b+Ly6Chi CD11b+Ly6Cנמוך/ תאים) עשוי לשחק תפקיד אחר ברגישות יתר מכני14. לכן, פנוטיפים במהירות את התגובה של מקרופאגים DRG בהקשר של פגיעה בעצב עשוי לעזור לנו לזהות גורמים נוירוחיסוניים התורמים לכאבים נוירופתיים.
מקובל, הפרוטוקול לבודד מקרופאגים ב-drg כרוך בשלבים מרובים כולל עיכול אנזימטי15,16. הטכניקה היא לעתים קרובות זמן רב והוא יכול להיות יקר עבור ניסויים בקנה מידה גדול. למרות העיכול מתון עם קולגן הסוג השני (4 מ"ג/mL) ו dispase סוג II (4.7 mg/mL) עבור 20 דקות היה מומלץ בעבר15, זה אפשרי כי תאים לאחר החשיפה אנזים זה נוטים לנזק לתאים או מוות התא, אשר עשוי להוביל נמוך תשואה. בנוסף, ההפרש באיכות האנזימים מאצווה לאצווה עלול להשפיע עוד יותר על היעילות של תהליך זה. חשוב מכך, מקרופאגים שנחשפו לעיכול האנזים עשוי להיות גירוי בלתי צפוי, וכך יכול להיות מאוד שונה מהמצב in-vivo. השינויים עשויים לסבך את תוצאת המחקר הפונקציונלי.
כאן נתאר פרוטוקול ללא אנזים כדי לבודד במהירות DRG מקרופאגים ב-4 ° c באמצעות דיסוציאציה מכנית. הדגימות נשמרות בקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי כתוצאה מכך, הגישה שלנו מספקת יתרון כדי לשמור על עקביות של הבידוד, ואת התאים הבודדים הם ככל הנראה בריאים יותר מגורה פחות. אנחנו עוד להציג את הראיות כדי לאמת את האיכות של תאים מבודדים עם מיון המופעל באמצעות תאים פלואורסצנטית (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ונערכו על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. לאסוף DRG המותני מפני עכברים ניסיוניים
- לפני תחילת הניסוי, להכין את פתרון העבודה של בינוני הצפיפות מעבר הצבע (למשל, חלחול) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום עם 1 נפח של Ca+ +/Mg+ + +-10X לחינם hbss. . שמור על הקרח
- הדבר עם העכבר באמצעות 2.5% Avertin. ודא כי החיה מורדם לחלוטין על ידי חוסר תגובה הצביטה האחוריות.
הערה: שני העכברים זכר ונקבה בגילאי 6-8 שבועות שימשו. - מבשם העכבר ההמרה עם 10 מ ל של טרום מקורר 1x PBS.
- למקם את העכבר במצב פרקדן עם ארבע כפות רגליים מאובטח עם הקלטת בתוך מכסה כימית. הרם את העור מתחת לכלוב הצלעות על ידי מלקחיים, ובצע חתך קטן עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הכבד ואת הסרעפת.
- המשיכו להשתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת ואת כלוב הצלעות, פתחו את חלל הצפק כדי לחשוף את הלב הפועם.
- חותכים במהירות את התוספת. הימנית עם מספריים קשתית לאחר הדימום הוא ציין, הכנס מחט של 30 גרם לקצה האחורי של החדר השמאלי, ובאיטיות להזריק 10 מ ל לפני מקורר 1x PBS לבשם החיה.
- לבצע כריתת למינציה מלאה15 על העכבר ממוקם בתנוחה נוטה.
הערה: אם תרבות התא מתוכננת, לרסס את העכבר עם 70% אתנול לפני החיתוך ולהשתמש טרום מעוקר כלי ניתוח לניתוח.- השתמש בגודל 11 אזמל לעשות חתך אחד האורך לרוחב עמוק החל מאזור בית החזה מטה אל האזור הסאקרל. להסיר את העור על ידי המספריים כדי לחשוף את שכבת השריר.
- השתמשו בפרידמן-פירסון Rongeur כדי לקלף את רקמות החיבור והשרירים עד לחשיפת תהליכי השידרה והתהליכים הדו הדו-צדדיים.
- השתמש מספריים האביב Noyes כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה השמאלית, ואז לעבור לכיוון של פרידמן-פירסון Rongeur כדי להסיר את העצמות החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה עם עצבים שלמים השדרה מחוברת.
- בזהירות בנתח המותניים והצלעות מותניים המותני (L4/L5 DRG במחקר שלנו) ולמקם אותו 1 מ ל של קרח קר Ca+ +/Mg+ +-חינם 1X Hbss ב-dounce רקמת הומוגנגניזר. . עכשיו הרקמות מוכנות לשלב 2
הערה: קצץ את עצב העמוד השדרה המצורפת ל-DRG אם אפשר.
2. לבודד תאים בודדים מ-DRG המותני העכבר
- המגון את רקמת DRG עם מכתש רופף ב-20-25 פעמים.
- מקום סטרילי 70 יקרומטר תא ניילון מסננת בשפופרת סטרילי 50 mL. הרטוב מסננת התא עם 800 μL של קרח קר 1x HBSS, ואת הזרימה-through נאסף בצינור חרוט.
- לאסוף את ההשעיה רקמת הומוגניים מתוך הומוגניצר באמצעות פיפטה ולעבור דרך הרטוב 70 יקרומטר מסננת תא ניילון לתוך צינור הצינורית של 50 mL.
- לשטוף את ההומוגנידה פעמיים עם 800 μL של קרח קר 1x HBSS ולאחר מכן decant לתוך שפופרת באותו 50 mL עם מסננת תאים כדי להגדיל את התשואה.
- הוסף 1.5 מ ל של צפיפות הקרח בינונית-קר isotonic מעבר בינוני (מוכן בשלב 1.1) לתוך שפופרת סטרילי 5-mL פוליסטירן מוקצף.
- להעביר את התא המגון מצינור 50 mL (בשלב 2.4) לתוך צינור FACS, מערבבים היטב עם צפיפות מעבר הצבע בינוני על ידי ליטוף למעלה ולמטה. הוסף 500 μL נוספים של 1x HBSS כדי לחתום את החלק העליון.
- כדור התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.
- המכיל את המיאלין במדיום מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית בתחתית הצינורית
- השהה מחדש את התאים במאגר ה-PBS או ה-FACS המכיל 5% סרום של שור עוברי (FBS) לניתוח FACS.
הערה: לפחות 50,000 כדי 100,000 תאים צפויים מ L4/L5 DRG של עכבר אחד.- מחדש את התאים DRG מכני מכנית (L4/L5) ב 100 μL של PBS המכיל 5% סרום שור עוברי ולאחר מכן דגירה עם α-עכבר CX3CR1-APC נוגדן (1:2000) בחושך על 4 ° c עבור 1 h.
- שטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS פעם אחת; צנטריפוגה את התאים 360 x g עבור 8 דקות ב 4 ° c.
- ואז להשעות מחדש את הגלולה בתא 300 μL של PBS עבור ניתוח FCAS. אם מתוכנן מיון תאים, השהה מחדש את התאים במאגר ה-FACS במקום זאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את התאים הבודדים, בחרנו לראשונה את מקרופאג המושרה ואפופטוזיס (מאפיה) עכברים הטרנסגניים17. השורה הזאת מבטאת inducible סמים-FK506-מחייב חלבון (FKBP)-גן היתוך ההתאבדות בשיא הירוק חלבון (eGFP) תחת השליטה של היזם של CSF1 קולטן (CSF1R), אשר מבוטא במיוחד הן מקרופאגים והן microglia. הזרקה מערכתית של dimerizer חלבון מחייב, AP20187 (AP), מעורר ואפופטוזיס של התאים המבטאים את הטרנסגנטית. הביטוי של EGFP גם מאפשר לנו לפקח על מקרופאגים ב-DRG. כדי לרוקן מקרופאגים בעכברי המאפיה, התחלנו את הלימודים שלנו עם 3 זריקות הצפק יומי של AP (1 מ"ג/ק"ג). לאחר הזריקה האחרונה, DRG היו מנות עבור כתמים חיסוני עבור GFP. הקלטנו אובדן משמעותי שלהתאים gfp בתוך drg של עכברים שטופלו AP לעומת עכברים VEH מטופלים (איור 1א-ב). בניסוי נפרד, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לנתק מכנית את מקרופאגים DRG לאחר הטיפול. ניתוח FACS הבאים חשף דלדול מוצלח של אוכלוסיית GFPhi בעכברים שטופלו AP (איור 1C-D) והפגינו איכות גבוהה של תאים מבודדים.
אנחנו גם לאפיין את התאים DRG מבודדים מן העכברים סוג פראי. בידוד מכני תאים DRG (L4/L5) היו מוכתמים עם העכבר α-CX3CR1-APC נוגדן. מצאנו כי 6% מתאי DRG היו CX3CR1+ מקרופאגים (איור 2א-ב). הכדאיות התאית הוערך גם עם Propidium יודיד (הריכוז הסופי של 2.5 μg/ml) אשר נקשר ל-DNA תאיים של תאים שאינם קיימא, חשיפת כי יותר מ 80% של תאים DRG מבודדים טריים היו קיימא (איור 2C-D).
איור 1: ניתוח FACS של מקרופאגים ב DRG של עכברים המאפיה לאחר טיפול AP.
עכברים המאפיה קיבלו הזרקה יומית הצפק של 1 מ"ג/ק"ג של AP20187 (AP) או רכב (VEH) עבור 3 ימים לפני הניתוח. (א, ב) חיסוני הנציג תמונות מראה את הדלדול המושרה AP של GFP+ (ירוק) מקרופאגים ב L4/L5 drg לאחר הטיפול AP 3rd . NF200 (כחול) השתמשו כדי לתייג נוירונים מיאלואידית. סרגל קנה מידה: 50 μm. (ג, ד) את אחוז CSF1R-GFP התאים לאחר דיסוציאציה מכנית של L4/5 drg נקבע על ידי ניתוח facs, ואת הנתונים נציג מתוך שלושה ניסויים עצמאיים מוצג עם אחוז האוכלוסייה התא מגודרת המצוין. התוצאה מראה כי 4% התאים הבודדים הכולל מ DRG של VEH בעלי חיים היו GFPhi -מקרופאגים. לעומת זאת, רק 0.4% של התאים DRG סה היוGFP מקרופאגים בעכבר AP שטופלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האפיון של FACS של מקרופאגים ב-DRG של עכברים מסוג פראי.
(א, ב) Ipsilateral L4 ו L5 DRG של העכבר בסוג פראי נאיבי היו ממאגר עבור דיסוציאציה מכנית. The אחוז CX3CR1+ מקרופאגים נמדדו על ידי ניתוח facs (א). הCX3CR1+ תאים התבססה על הזריחה הרקע בתאים מודבטים עם מצושל APC בקרת איזוטיפ שליטה (ב). (ג, ד) הכדאיות התאית של תאים DRG מבודדים טריים הוערך עם Propidium יודיד (PI) כתמים. PI+ תאים (C) היו מגודרת על בסיס הרקע הזריחה בתאים הבלתי מוכתמים (D). הגדרת נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים מוצגת עם אחוז מאוכלוסיית התאים הסגורה המצוינת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה חדשה ביעילות להעשיר מקרופאגים מבודדים מ DRG העכבר. הגישה המקובלת לבודד התאים החיסוניים drg דורש עיכול אנזימטית15,18, אשר מוחלף כעת עם המגון מכני בפרוטוקול שלנו כדי להגביל את הנזק הסלולרי בלתי רצוי ולהגדיל את התשואה. לכן, הפרוטוקול החדש הוא הרבה פחות זמן רב. חשוב מכך, עיכול האנזים עלול לגרות את המקרופאגים ולשנות את החתימה המולקולרית. לעומת זאת, הגישה המכנית שלנו מגבילה מאוד את הלחץ התאי.
באמצעות ניתוח FACS, אנו עוד לאפיין את מקרופאגים בתאי DRG מבודדים והפגינו שחזור הסלולר הגדול. יותר מ 80% של תאים DRG מבודדים תחת פרוטוקול זה נמצאו להיות קיימא (איור 2D). לפחות 50,000 כדי 100,000 תאים צפויים מ L4/L5 DRG של עכבר אחד. לכן, אנחנו יכולים להסיק בביטחון כי תאי DRG ניתן למיין עוד לתוך מקרופאג תת אוכלוסיות14 עבור או תרבות או בידוד RNA. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים אשר עשויים להשפיע על התשואה. אם התשואה של התא שאינו מספק מצוין, יש לחשוד בחוסר מספיק או מוגזם בשלב 2.1. היקף מוות התאים המוערך עם PI (איור 2) או 7-עמ כתמים יכול להיות מנוצל כדי לייעל את הפרוטוקול. בנוסף, ניתוח DRG בשלב 1.4 עשוי לדרוש תרגול חוזר למתחילים.
כיום, המעבדה שלנו משתמשת בעיקר פרוטוקול זה ללימוד מקרופאגים DRG. סביר, היישום של פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי ללמוד תאים עצביים אחרים בתוך DRG, כגון תאי לווין19, ו T תאים20. מחקרים נוספים נחוצים כדי לאשר את האפקטיביות של בידוד התא. למרבה הצער, שיטת הדיסוציאציה המכנית הנוכחית שלנו אינה אידיאלית לבידוד של הנוירונים הסנסטיים של DRG, והעיכול האנזימטי נשאר השיטה האפקטיבית ביותר לבידוד חושי של תא החישה15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים הקשורים לכתב יד זה.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי: הקרן לחינוך הרדמה ומחקר (XY); המחלקה לטיפול בהרדמה מרבית (XY); ו-1R01NS100801-01 (GZ). מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי HDFCCC המעבדה לניתוח תא משאבים משותפים באמצעות מענק NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
