Summary
यहाँ हम phenotyping और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पृष्ठीय जड़ गुच्छिका से मैक्रोफेज को तेजी से अलग करने के लिए एक यांत्रिक वियोजन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
परिधीय तंत्रिका चोट के बाद पृष्ठीय जड़ Ganglia में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और संवेदी न्यूरॉन्स के बीच आणविक और सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए हितों बढ़ रहे हैं. परिधीय मोनोसाइटिक कोशिकाओं, मैक्रोफेज सहित, phagocytosis के माध्यम से एक ऊतक की चोट का जवाब करने के लिए जाना जाता है, प्रतिजन प्रस्तुति, और साइटोकिन रिलीज. उभरते सबूत तंत्रिका चोट के संदर्भ में neuropathic दर्द के विकास और axonal मरम्मत करने के लिए पृष्ठीय जड़ Ganglia मैक्रोफेज के योगदान को फंसाया है. तेजी से phenotyping (या "की तीव्र अलगाव") तंत्रिका चोट के संदर्भ में पृष्ठीय जड़ ganglia मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया अज्ञात neuroimmune कारकों की पहचान करने के लिए वांछित है. यहाँ हम प्रदर्शित कैसे हमारी प्रयोगशाला तेजी से और प्रभावी ढंग से एक एंजाइम मुक्त यांत्रिक वियोजन प्रोटोकॉल का उपयोग कर पृष्ठीय जड़ Ganglia से मैक्रोफेज अलग. नमूने सेलुलर तनाव को सीमित करने के लिए भर में बर्फ पर रखा जाता है. यह प्रोटोकॉल मानक एंजाइमी प्रोटोकॉल की तुलना में अभी तक कम समय लेने वाला है और नियमित रूप से हमारे फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Introduction
अब इस बात के काफी प्रमाण हैं कि परिधीय तंत्रिका की चोट1,2के बाद प्रतिरक्षा कोशिकाएं तंत्रिकारोग दर्द में योगदान करती हैं . परिपक्व मैक्रोफेज सहित परिधीय मोनोसाइटिक कोशिकाओं, phagocytosis, प्रतिजन प्रस्तुति, और साइटोकिन रिलीज के माध्यम से ऊतक चोट और प्रणालीगत संक्रमण का जवाब करने के लिए जाना जाता है। रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका चोट प्रेरित माइक्रोग्लिया सक्रियण के समानांतर, पृष्ठीय जड़ गैंगेलिया (डीआरजी) में मैक्रोफेज भी तंत्रिका चोट3,4के बाद काफी विस्तार करते हैं। विशेष रूप से, वहाँ बढ़ रहे हितों को निर्धारित करने के लिए अगर मैक्रोफेज DRG5,6,7में संवेदी न्यूरॉन्स के साथ बातचीत से परिधीय तंत्रिका चोट के बाद neuropathic दर्द के विकास के लिए योगदान कर रहे हैं, 8 , 9 , 10 , 11इसके अलावा , हाल के अध्ययनों से तंत्रिका की चोट12,13के बाद एक्सोनल मरम्मत में डी आर जी मैक्रोफेज के योगदान को भी शामिल किया गया है . एक अन्य अध्ययन से यह भी पता चलता है कि मैक्रोफेज उपजनसंख्या (यानी, CD11b+Ly6Chi और CD11b+Ly6Cकम/ इसलिए, तंत्रिका चोट के संदर्भ में डीआरजी मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया को तेजी से फीनोटाइपिंग करने से हमें न्यूरोम्यून्योरन कारकों की पहचान करने में मदद मिल सकती है जो न्यूरोपैथिक दर्द में योगदान देते हैं।
पारंपरिक रूप से, डीआरजी में मैक्रोफेज को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल में एंजाइमी पाचन15,16सहित कई कदम शामिल हैं . तकनीक अक्सर समय लगता है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए महंगा हो सकता है. हालांकि कोलैनाज़ प्रकार द्वितीय (4 mg/mL) और dispase प्रकार द्वितीय (4.7 mg/mL) के लिए हल्के पाचन पहले की सिफारिश की थी15, यह माना जाता है कि इस एंजाइम के लिए जोखिम के बाद कोशिकाओं को नुकसान या सेल मौत के लिए प्रवण हैं, जो कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं उपज. इसके अलावा, बैच से बैच के लिए एंजाइमों की गुणवत्ता में अंतर आगे इस प्रक्रिया की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, एंजाइम पाचन के संपर्क में मैक्रोफेज undesirably प्रेरित किया जा सकता है और इस तरह में-vivo स्थिति से बहुत अलग हो सकता है. परिवर्तन संभावित कार्यात्मक अध्ययन के परिणाम जटिल हो सकता है.
यहाँ हम यांत्रिक वियोजन का उपयोग करते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर DRG मैक्रोफेज को तेजी से अलग करने के लिए एक एंजाइम मुक्त प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। नमूनों को सेलुलर तनाव को सीमित करने के लिए बर्फ पर रखा जाता है। एक परिणाम के रूप में, हमारे दृष्टिकोण अलगाव की स्थिरता बनाए रखने के लिए एक लाभ प्रदान करता है, और अलग कोशिकाओं संभवतः स्वस्थ और कम प्रेरित कर रहे हैं. हम आगे फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) विश्लेषण के साथ अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए सबूत पेश करते हैं।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुसार आयोजित किया गया.
1. प्रयोगात्मक चूहों से काठ का डी जी लीजिए
- प्रयोग शुरू करने से पहले, का़+/Mg+-मुक्त 10x HBSS के 1 वॉल्यूम के साथ माध्यम के 9 संस्करणों को मिलाकर घनत्व प्रवणता माध्यम (उदा., पर्कॉल) के कार्य समाधान तैयार करें। इसे बर्फ पर रखें।
- 2.5% Avertin के साथ माउस Anesthetize. पुष्टि करें कि पशु पूरी तरह से पिछले पंजा चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी से एनेस्थेटाइज किया गया है।
नोट:6-8 सप्ताह आयु वर्ग के पुरुष और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया गया. - पहले से ठंडा 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ माउस transcardially perfuse.
- एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर टेप के साथ सुरक्षित चार पंजे के साथ सुपाच्य स्थिति में माउस रखें। संदंश द्वारा रिब पिंजरे के नीचे त्वचा को उठाएं, और यकृत और डायाफ्राम को बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाएं।
- डायाफ्राम और रिब पिंजरे में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करने के लिए जारी रखें, धड़कन दिल का पर्दाफाश करने के लिए फुफ्फुस गुहा खोलने के लिए।
- जल्दी से आईरिस कैंची के साथ सही एट्रियल परिशिष्ट में कटौती। एक बार खून बह रहा है नोट किया है, बाएं वेंट्रिकल के पीछे के अंत में एक 30 जी सुई डालने, और धीरे धीरे पूर्व ठंडा 1x पीबीएस के 10 एमएल सुई जानवर perfuse.
- प्रवण स्थिति पर रखा माउस पर पृष्ठीय laminectomy15 प्रदर्शन.
नोट: यदि सेल संस्कृति की योजना बनाई है, चीरा से पहले 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे और विच्छेदन के लिए पूर्व बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करें.- एक आकार 11 स्केलपेल का उपयोग करने के लिए एक अनुदैर्घ्य पार्श्व गहरे चीरों वक्ष क्षेत्र से नीचे त्रिक क्षेत्र के लिए शुरू करने के लिए. पृष्ठीय मांसपेशी परत का पर्दाफाश करने के लिए कैंची द्वारा त्वचा निकालें.
- जब तक लम्बोसैकरल रीढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं और द्विपक्षीय अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं को उजागर नहीं किया जाता है, तब तक कनेक्टिव ऊतकों और मांसपेशियों को छीलने के लिए फ्राइडमैन-पियरसन रोंगूर का उपयोग करें।
- पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी को सावधानी से खोलने के लिए एक नोयस स्प्रिंग कैंची का उपयोग करें, फिर रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए फ्रेडमैन-पियरसन रोंगूर पर स्विच करें ताकि रीढ़ की हड्डी को अक्षुण्ण रीढ़ की नसों के साथ रीढ़ की हड्डी को बेनकाब किया जा सके।
- ध्यान से ipsilateral और contralateral काठ का डीआरजी (L4/L5 DRG हमारे अध्ययन में) विच्छेदन और यह बर्फ ठंडा Ca के 1 एमएल में जगह+/ Mg+ + +-मुक्त 1x HBSS एक डंस ऊतक homogenizer में. अब ऊतक चरण 2 के लिए तैयार हैं।
नोट: यदि संभव हो तो डीआरजी से जुड़ी रीढ़ की हड्डी की तंत्रिका को ट्रिम करें।
2. माउस काठ का डी जी से एकल कोशिकाओं को अलग करें
- DRG ऊतक को डेंक homogenizer में एक ढीला मूसल के साथ 20-25 बार homogenize.
- एक बाँझ 50 एमएल शंकु नली में एक बाँझ 70 डिग्री m नायलॉन सेल छलनी रखें। सेल छलनी को 800 डिग्री सेल्सियस बर्फ-कोल्ड 1x एचबीएस के साथ गीला करें, और प्रवाह-थ्रू कोनिकल ट्यूब में एकत्र किया जाता है।
- एक पिपेट का उपयोग कर homogenizer से homogenized ऊतक निलंबन ले लीजिए और 50 एमएल शंकु ट्यूब में गीला 70 डिग्री m नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से गुजरती हैं।
- समंजक को 800 डिग्री सेल्सियस बर्फ-कोल्ड 1x एचबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें और फिर उपज बढ़ाने के लिए सेल छलनी के साथ एक ही 50 एमएल शंकु ट्यूब में decant करें।
- एक बाँझ 5-एमएल पॉलीस्टाइरीन FACS ट्यूब में 1.5 एमएल समिलकारी बर्फ-ठंडा आइसोटोनिक घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम (चरण 1-1 में तैयार) जोड़ें।
- 50 एमएल शंकु नली (चरण 2-4) से एफएएफएस ट्यूब में सेल समरूपता को स्थानांतरित करें, ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा घनत्व प्रवणता माध्यम के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। शीर्ष सील करने के लिए 1x HBSS के एक अतिरिक्त 500 जेडएल जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली।
- एफएसीएस ट्यूब के तल पर सेल गोली को परेशान किए बिना माध्यम में माइलिन युक्त सुपरनेंट को सावधानी से प्रेरित करें।
- पीबीएस या FACS बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) FACS विश्लेषण के लिए युक्त.
नोट: कम से कम 50,000 से 100,000 कोशिकाओं से एक माउस के L4 /- यंत्रवत् पृथक डीआरजी कोशिकाओं (एल 4/एल 5) को पीबीएस के 100 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें जिसमें 5% भ्रूण बोवाइन सीरम होता है और फिर $-माउस CX3CR1-APC एंटीबॉडी (1:2,000) के साथ अंधेरे में 1 h के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- एक बार पीबीएस के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं; कोशिकाओं को अपकेंद्रण 360 x ग्राम के लिए 8 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- supernatant प्रेरित, तो FCAS विश्लेषण के लिए पीबीएस के 300 डिग्री एल में सेल गोली resuspend. यदि कक्ष सॉर्टिंग की योजना बनाई है, तो इसके बजाय FACS बफ़र में कक्षों को पुन: निलंबित करें।
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Representative Results
अलग कोशिकाओं को मान्य करने के लिए, हम पहले Macrophage फास-प्रेरित Apoptosis (MAFIA) ट्रांसजेनिक चूहों17चुना है। इस लाइन एक दवा inducible FK506 बाध्यकारी प्रोटीन (FKBP)-फास आत्महत्या संलयन जीन और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) CSF1 रिसेप्टर (CSF1R) के प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त करता है, जो विशेष रूप से दोनों मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया में व्यक्त किया जाता है. एफके बाध्यकारी प्रोटीन dimerizer, AP20187 (एपी) के प्रणालीगत इंजेक्शन, ट्रांसजीन व्यक्त कोशिकाओं के apoptosis लाती है. EGFP की अभिव्यक्ति भी हमें DRG में मैक्रोफेज की निगरानी करने की अनुमति देता है. MAFIA चूहों में मैक्रोफेज को कम करने के लिए, हमने एपी (1 मिलीग्राम/किलोग्राम) के 3 दैनिक इंट्रापर्टोनल इंजेक्शन के साथ अपनी पढ़ाई शुरू की। पिछले इंजेक्शन के बाद, DRG GFP के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के लिए काट दिया गया. हम VEH इलाज चूहों की तुलना में एपी का इलाज चूहों के DRG में GFP+ कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण नुकसान दर्ज की गई (चित्र 1ए बी). एक अलग प्रयोग में, हमने उपचार के बाद डीआरजी मैक्रोफेज को यंत्रवत् रूप से अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया। बाद में FACS विश्लेषण एपी में GFPहाय आबादी के एक सफल कमी से पता चला चूहों का इलाज (चित्र 1सी -डी) और अलग कोशिकाओं की उच्च गुणवत्ता का प्रदर्शन किया.
हम भी जंगली प्रकार चूहों से अलग DRG कोशिकाओं की विशेषता. यंत्रवत् पृथक डीआरजी कोशिकाओं (L4/L5) के साथ दाग थे -माउस CX3CR1-APC एंटीबॉडी. हमने पाया कि डीआरजी कोशिकाओं का 6% CX3CR1+ मैक्रोफेज थे (चित्र 2ए-बी)। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन प्रोपिडियम आयोडाइड (2.5 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता) के साथ भी किया गया था जो अव्यवहार्य कोशिकाओं के इंट्रासेल्यूलर डीएनए को बांधता है, जिससे पता चलता है कि 80% से अधिक ताजा पृथक डीआरजी कोशिकाएं व्यवहार्य थीं (चित्र 2सी-डी)।
चित्र 1: एपी उपचार के बाद MAFIA चूहों के DRG में मैक्रोफेज का FACS विश्लेषण.
MAFIA चूहों के विश्लेषण से पहले 3 दिनों के लिए AP20187 (एपी) या वाहन (VEH) के 1 मिलीग्राम/ (ए, बी) 3rd एपी उपचार के बाद L4/L5 DRG में जीएफपी+ (हरा) मैक्रोफेज के एपी प्रेरित कमी दिखा प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेनिंग छवियों। NF200 (नीला) myelinated न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्केल बार:50 डिग्री मी. (सी, डी) L4/5 DRG के यांत्रिक वियोजन के बाद प्रतिशत CSF1R-GFPहाय कोशिकाओं FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, और एक प्रतिनिधि डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से सेट gated सेल जनसंख्या के प्रतिशत के साथ दिखाया गया है संकेत दिया. परिणाम से पता चलता है कि VEH इलाज पशु के DRG से कुल अलग कोशिकाओं के 4% GFPहाय मैक्रोफेज थे. इसके विपरीत, कुल DRG कोशिकाओं का केवल 0.4% एपी में GFPहाय मैक्रोफेज थे इलाज माउस. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: जंगली प्रकार चूहों के डीआरजी में मैक्रोफेज की FACS विशेषता।
(ए, बी) Ipsilateral L4 और L5 DRG के भोले जंगली प्रकार माउस यांत्रिक वियोजन के लिए जमा थे. प्रतिशत CX3CR1+ मैक्रोफेज एफएसीएस विश्लेषण (ए) द्वारा मापा गया था। CX3CR1+ कोशिकाओं के लिए gating APC-संयोजित समप्रकार नियंत्रण एंटीबॉडी (बी) के साथ incubated कोशिकाओं में पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट पर आधारित था. (सी, डी) ताजा पृथक डीआरजी कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला के साथ किया गया था। पीआई+ कोशिकाओं (सी) को बेदाग कोशिकाओं (डी) में पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के आधार पर गेट किया गया था . तीन स्वतंत्र प्रयोगों से सेट एक प्रतिनिधि डेटा गेटेड सेल जनसंख्या के प्रतिशत के साथ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ हम प्रभावी ढंग से माउस DRG से अलग मैक्रोफेज को समृद्ध करने के लिए एक नई विधि परिचय. DRG प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एंजाइमी पाचन की आवश्यकता15,18, जो अब अवांछित सेल क्षति को सीमित करने और उपज में वृद्धि करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल में यांत्रिक homogenization के साथ बदल दिया है. इसलिए, नए प्रोटोकॉल अभी तक कम समय लगता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, एंजाइम पाचन मैक्रोफेज को उत्तेजित कर सकता है और आणविक हस्ताक्षर को बदल सकता है। इसके विपरीत, हमारे यांत्रिक दृष्टिकोण बहुत सेलुलर तनाव को सीमित करता है.
FACS विश्लेषण का उपयोग करना, हम आगे अलग DRG कोशिकाओं में मैक्रोफेज विशेषता और एक महान सेलुलर वसूली का प्रदर्शन किया. इस प्रोटोकॉल के अंतर्गत 80% से अधिक पृथक डीआरजी कोशिकाएं व्यवहार्य पाई गई (चित्र 2डी) . कम से कम 50,000 से 100,000 कोशिकाओं L4 /L5 एक माउस के DRG से उम्मीद कर रहे हैं. इसलिए, हम विश्वास के साथ निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि डीआरजी कोशिकाओं को आगे संस्कृति या आरएनए अलगाव के लिए14 मैक्रोफेज subpopulations में हल किया जा सकता है. हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो उपज को प्रभावित कर सकते हैं। यदि असंतुष्ट सेल की उपज को नोट किया जाता है, तो चरण 2.1 में अपर्याप्त या अत्यधिक समरूपता संदिग्ध होनी चाहिए। पीआई (चित्र 2) या 7-एडी एएडी अभिरंजन के साथ मूल्यांकन सेल मृत्यु की सीमा प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए उपयोग की जा सकती है। इसके अलावा, चरण 1.4 में DRG विच्छेदन शुरुआती के लिए दोहराया अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है.
वर्तमान में, हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से DRG मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है. संभावना है कि इस प्रोटोकॉल के प्रयोग का विस्तार डीआरजी में अन्य गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं, जैसे उपग्रह कोशिकाओं, और टी कोशिकाओं20का अध्ययन करने के लिए किया जा सकताहै। आगे के अध्ययन सेल अलगाव की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं. दुर्भाग्य से, हमारे वर्तमान यांत्रिक वियोजन विधि DRG संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए आदर्श नहीं है, और एंजाइमी पाचन संवेदी न्यूरॉन अलगाव के लिए सबसे प्रभावी तरीका बनी हुई है15.
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Disclosures
लेखक इस पांडुलिपि से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं।
Acknowledgments
अध्ययन द्वारा समर्थित किया गया था: संज्ञाहरण शिक्षा और अनुसंधान के लिए फाउंडेशन (XY); संज्ञाहरण और पेरिऑपरेटिव केयर (XY) के UCSF विभाग; और 1R01NS100801-01(जीजेड).। इस अध्ययन के भाग में NIH (P30CA082103) से एक अनुदान के माध्यम से सेल विश्लेषण साझा संसाधन सुविधा के लिए HDFCCC प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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