Summary
Burada, fenotitipleme ve fonksiyonel analiz için dorsal kök ganglion'undaki makrofajları hızla izole etmek için mekanik bir ayrışma protokolü salıyoruz.
Abstract
Periferik sinir hasarı sonrası dorsal kök gangliyonunda bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri incelemek için artan ilgi alanları vardır. Makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına yanıt verebildiği bilinmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar sinir hasarı bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök gangliyon makrofajlar katkısı ima etmiştir. Hızla fenotipleme (veya "hızlı izolasyon") sinir yaralanması bağlamında dorsal kök ganglia makrofajlarının yanıtı bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için boyunca buz üzerinde tutulur. Bu protokol standart enzimatik protokole göre çok daha az zaman alır ve floresan tarafından aktive edilen Hücre Sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullanılmaktadır.
Introduction
Bağışıklık hücrelerinin periferik sinir hasarı sonrası nöropatik ağrıkatkıda önemli kanıtlar var1,2. Olgun makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına ve sistemik enfeksiyona yanıt verebildiği bilinmektedir. Spinal dorsal boynuz sinir yaralanması kaynaklı mikroglia aktivasyonu paralel, dorsal kök gangliyonu makrofajlar (DRG) ayrıca sinir yaralanması sonra önemli ölçüde genişletmek3,4. Özellikle, makrofajlar DRG duyusal nöronlar ile etkileşime girerek periferik sinir yaralanması sonrası nöropatik ağrı gelişimine katkıda olup olmadığını belirlemek için büyüyen ilgi vardır5,6,7, 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11. Ayrıca, son çalışmalar da sinir yaralanması12sonra aksonal onarım DRG makrofajların katkısı ima12 ,13. Başka bir çalışmada ayrıca makrofaj alt popülasyonlarının (cd11b+Ly6Chi ve CD11b+Ly6Cdüşük/- hücreler) mekanik aşırı duyarlılıkta farklı bir rol oynayabileceğini öne sürer14. Bu nedenle, sinir hasarı bağlamında DRG makrofajların yanıtını hızla fenotipleme bize nöropatik ağrıya katkıda nöroimmün faktörleri belirlemenize yardımcı olabilir.
Geleneksel olarak, DRG makrofajlar izole etmek için protokol enzimatik sindirim 15 ,16dahil olmak üzere birden fazla adım içerir. Teknik genellikle zaman alıcıdır ve büyük ölçekli deneyler için maliyetli olabilir. Kollajenaz tip II (4 mg/mL) ve dispase tip II (4.7 mg/mL) ile hafif sindirim daha önce tavsiye edilse de15dakika , bu enzime maruz kaldıktan sonra hücrelerin hücre hasarına veya hücre ölümüne yatkın olması akla yatkındır, bu da düşük hücre hasarına veya hücre ölümüne yol açabilir Verim. Buna ek olarak, seriden toplu ait enzimlerin kalitesindeki fark bu sürecin verimliliğini daha da etkileyebilir. Daha da önemlisi, enzim sindirimine maruz kalan makrofajlar istenmeyen bir şekilde uyarılabilir ve böylece in-vivo durumundan çok farklı olabilir. Değişiklikler, fonksiyonel çalışmanın sonucunu karmaşık hale getirebilir.
Burada 4 °C'de DRG makrofajlarını mekanik ayrışma kullanarak hızla izole etmek için enzimsiz bir protokol uyguluyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için buzüzerinde tutulur. Sonuç olarak, bizim yaklaşım izolasyon tutarlılığını korumak için bir avantaj sağlar, ve izole hücreler muhtemelen sağlıklı ve daha az uyarılmış. Ayrıca Floresan aktive Hücre Sıralama (FACS) analizi ile izole hücrelerin kalitesini doğrulamak için kanıt salıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Deneysel farelerden lomber DRG toplamak
- Deneye başlamadan önce, 9 ciltlik ortayı 1 birim Ca++ /Mg++-free 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin, Percoll) çalışma çözümünün hazırlanın. Buzda tut.
- % 2.5 Avertin ile fare anestezik. Hayvanın arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
NOT: 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı. - Fareyi 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS ile transkardiolarak aşındırın.
- Fareyi, bant la birlikte kimyasal bir duman kaputunun içine sabitlenmiş dört pençesi ile supine pozisyonuna yerleştirin. Forseps tarafından göğüs kafesi altında deri kaldırın ve karaciğer ve diyafram ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile küçük bir kesi yapmak.
- Diyafram ve göğüs kafesi kesmek için makas kullanmaya devam, atan kalp ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın.
- Hızlı bir şekilde iris makas ile sağ atriyal uzantını kesti. Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 G iğne yerleştirin ve hayvanA nüfuz etmek için yavaş yavaş 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS enjekte edin.
- Yatkın pozisyonda yerleştirilen fare üzerinde dorsal laminektomi15 gerçekleştirin.
NOT: Hücre kültürü planlanıyorsa, kesiden önce fareye %70 etanol püskürtün ve diseksiyon için önceden sterilize edilmiş cerrahi aletler kullanın.- Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar bir boylamsal lateral derin kesiler yapmak için bir boyut 11 neşter kullanın. Dorsal kas tabakası ortaya çıkarmak için makas ile cilt çıkarın.
- Lumbosacral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler ortaya çıkana kadar bağ dokuları ve kasları soymak için Friedman-Pearson Rongeur kullanın.
- Dikkatle dorsal spinal kolon açmak için bir Noyes Bahar Makas kullanın, sonra sağlam spinal sinirler bağlı omurilik ortaya çıkarmak için vertebral kemikleri kaldırmak için bir Friedman-Pearson Rongeur geçmek.
- İpsilateral ve kontralateral lomber DRG'yi (çalışmamızda L4/L5 DRG) dikkatlice inceleyin ve 1 mL buz gibi Ca++/Mg++-serbest 1x HBSS'ye yerleştirin. Şimdi dokular 2.
NOT: Mümkünse DRG'ye bağlı spinal siniri kırpın.
2. Fare lomber DRG tek hücreleri yalıtma
- Dounce homogenizer 20-25 kez gevşek bir pestisit ile DRG doku homojenize.
- Steril 70 m naylon hücreli süzgeci steril 50 mL konik tüpe yerleştirin. Hücre süzgecini 800 μL buz gibi 1x HBSS ile ıslayın ve akış konik tüpte toplanır.
- Homojenize doku süspansiyonundan bir pipet kullanarak alın ve ıslak 70 μm naylon hücresüzden 50 mL konik tüpe geçirin.
- Homogenizer'i 800 μL buz gibi 1x HBSS ile iki kez durulayın ve verimi artırmak için hücre süzgeci ile aynı 50 mL konik tüpe ayırın.
- Steril 5 mL polistiren FACS tüpüne 1,5 mL'lik dengelenmiş buz gibi izotonik yoğunluk gradyan ortamı (adım 1.1'de hazırlanmış) ekleyin.
- 50 mL konik tüpten (adım 2.4) homojen hücreyi FACS tüpüne aktarın, yukarı ve aşağı borular oluşturarak yoğunluk gradyan ortamıyla iyice karıştırın. Üst ünü kapatmak için 500 μL 1x HBSS ek bir ekleyin.
- 4 °C'de 20 dk için 800 x g'da santrifüj ile hücreleri pelet.
- FACS tüpünün altındaki hücre peletini rahatsız etmeden orta ortamda miyelin içeren süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- FACS analizi için %5 Fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS veya FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.
NOT: Bir farenin L4 /L5 DRG'sinden en az 50.000 ila 100.000 hücre beklenir.- %5 Fetal Sığır Serumu içeren 100 μL PBS'deki mekanik olarak izole edilmiş DRG hücrelerini (L4/L5) yeniden askıya alın ve daha sonra karanlıkta 4 °C'de α-fare CX3CR1-APC antikor (1:2,000) ile kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 5 mL PBS ile bir kez yıkayın; 4 °C'de 8 dk için 360 x g hücreleri santrifüj.
- Süpernatant aspire, sonra FCAS analizi için PBS 300 μL hücre pelet resuspend. Hücre sıralaması planlanıyorsa, bunun yerine FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzole hücreleri doğrulamak için, ilk Macrofaj Fas kaynaklı Apoptosis seçti (MAFIA) transgenik fareler17. Bu çizgi, özellikle makrofajlar ve mikroglia ile ifade edilen BOS1 reseptörünün (BOS1R) promotörü kontrolü altında ilaç lainebilir fk506 bağlayıcı protein (FKBP)-Fas intihar füzyon geni ve yeşil floresan proteini (eGFP) ifade eder. FK bağlayıcı protein dimerizer sistemik enjeksiyon, AP20187 (AP), transgeni ifade eden hücrelerin apoptosis indükler. EGFP ifadesi de bize DRG makrofajlar izlemek için izin verir. MAFIA farelerinde makrofajları tüketmek için, günlük 3 ap intraperitoneal enjeksiyon (1 mg/kg) ile çalışmaya başladık. Son enjeksiyondan sonra, DRG GFP için immünboyama için kesitli edildi. AP ile tedavi edilen farelerin DRG'sinde VEH ile tedavi edilen farelere göre gfp+ hücrelerinin önemli bir kaybı kaydedildi(Şekil 1A-B). Ayrı bir deneyde, bu protokolü tedaviden sonra DRG makrofajlarını mekanik olarak ayırmak için kullandık. Daha sonraki FACS analizi, AP ile tedavi edilen farelerde(Şekil 1C-D)GFPhi popülasyonunun başarılı bir şekilde tükendiğin saptandı ve yalıtılmış hücrelerin yüksek kalitesini gösterdi.
Ayrıca yabani farelerden izole DRG hücrelerini karakterize ettik. Mekanik olarak izole edilmiş DRG hücreleri (L4/L5) α-fare CX3CR1-APC antikorile boyandı. DRG hücrelerinin %6'sının CX3CR1+ makrofaj(Şekil 2A-B)olduğunu bulduk. Hücre canlılığı ayrıca, canlı olmayan hücrelerin hücre içi DNA'sına bağlanan Propidium Iyodür (2.5 g/ml nihai konsantrasyonu) ile değerlendirildi ve taze izole edilmiş DRG hücrelerinin %80'inden fazlasının canlı olduğunu ortaya çıkardı(Şekil 2C-D).
Şekil 1: AP tedavisinden sonra MAFIA farelerin DRG makrofajların FACS analizi.
MAFIA farelere analizden 3 gün önce günlük 1 mg/kg AP20187 (AP) veya araç (VEH) intraperitoneal enjeksiyon uymaktadır. (A, B) 3. AP tedavisinden sonra L4/L5 DRG'de GFP+ (yeşil) makrofajların AP kaynaklı tükenmesini gösteren temsili immünboyama görüntüleri. NF200 (mavi) miyelinatlı nöronları etiketlemek için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C, D) L4/5 DRG'nin mekanik ayrıştırılmasından sonra yüzde CSF1R-GFPhi hücreleri FACS analizi ile belirlendi ve üç bağımsız deneyden elde edilen temsili veri seti, belirtilen kapılı hücre popülasyonunun yüzdesi ile gösterilmiştir. Sonuç, VEH ile tedavi edilen hayvanların DRG'sinden toplam izole hücrelerin %4'ünün GFPhi makrofajlar olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, ap-tedavi fare toplam DRG hücrelerinin sadece% 0.4 GFPhi makrofajlar edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yabani farelerin DRG'sinde makrofajların FACS karakterizasyonu.
(A, B) Saf vahşi tip fareip l4 ve L5 DRG mekanik dissosilasyon için bir araya getirildi. Yüzde CX3CR1+ makrofajlar FACS analizi(A)ile ölçüldü. CX3CR1+ hücreleri için gating APC konjuge isotip kontrol antikor(B)ile kuluçka hücrelerinde arka plan floresan dayanmaktadır. (C, D) Yeni izole drg hücrelerinin hücre canlılığı Propidium Iodide (PI) boyama ile değerlendirildi. PI+ hücreleri(C)lekesiz hücrelerde arka plan floresan dayalı geçitli edildi(D). Üç bağımsız deneyden elde edilen temsili veri kümesi, belirtilen geçithücre popülasyonunun yüzdesi ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada etkili fare DRG izole makrofajlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanıtmak. DRG bağışıklık hücrelerini izole etmek için geleneksel yaklaşım enzimatik sindirim gerektirir15,18, şimdi istenmeyen hücre hasarı sınırlamak ve verimi artırmak için protokolümüzde mekanik homojenizasyon ile değiştirilir. Bu nedenle, yeni protokol çok daha az zaman alıcıdır. Daha da önemlisi, enzim sindirim makrofajlar uyarabilir ve moleküler imzayı değiştirmek. Buna karşılık, mekanik yaklaşımımız hücresel stresi büyük ölçüde sınırlar.
FACS analizini kullanarak, izole DRG hücrelerindeki makrofajları daha da karakterize ettik ve büyük bir hücresel iyileşme gösterdik. Bu protokol kapsamında izole edilmiş DRG hücrelerinin %80'inden fazlasının canlı olduğu bulunmuştur(Şekil 2D). Bir farenin L4 /L5 DRG'sinden en az 50.000 ila 100.000 hücre bekleniyor. Bu nedenle, DRG hücrelerinin kültür veya RNA izolasyonu için makrofaj alt popülasyonları14 olarak daha fazla sıralanabileceği sonucuna varabiliriz. Ancak, verimi etkileyebilecek birkaç kritik adım vardır. Yetersiz hücre verimi belirtilmişse, adım 2.1'deki yetersiz veya aşırı homojenizasyondan şüphelenilmelidir. Protokolü optimize etmek için PI (Şekil 2) veya 7-AAD boyama ile değerlendirilen hücre ölümünün boyutu kullanılabilir. Buna ek olarak, adım 1.4 DRG diseksiyon yeni başlayanlar için tekrarlanan uygulama gerektirebilir.
Şu anda, bizim laboratuvar ağırlıklı olarak DRG makrofajlar çalışma için bu protokolü kullanır. Büyük olasılıkla, Bu protokolün uygulanması DRG diğer nöronal olmayan hücreleri incelemek için genişletilebilir, uydu hücreleri gibi19, ve T hücreleri20. Hücre izolasyonunun etkinliğini doğrulamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Ne yazık ki, mevcut mekanik ayrışma yöntemi DRG duyusal nöronların izolasyon için ideal değildir, ve enzimatik sindirim duyusal nöron izolasyonu için en etkili yöntem olmaya devam etmektedir15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu el yazması ile ilgili hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Çalışma şu şekilde desteklenmiştir: Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı (XY); UCSF Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü (XY); ve 1R01NS100801-01(GZ). Bu çalışma kısmen HDFCCC Laboratuvar Hücre Analizi Paylaşılan Kaynaklar Tesisi tarafından NIH (P30CA082103) hibe si ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
