Summary
여기서 우리는 표현형 및 기능 분석을 위해 등쪽 뿌리 신경절에서 대식세포를 신속하게 분리하는 기계적 해리 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
말초 신경 손상 후 등쪽 뿌리 중추에서 면역 세포와 감각 뉴런 간의 분자 및 세포 상호 작용을 연구하는 관심사가 증가하고 있습니다. 대식세포를 포함한 말초 단낭세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상에 반응하는 것으로 알려져 있다. 새로운 증거는 신경 손상의 맥락에서 신경 병성 통증 개발 및 축색 수리에 등계 뿌리 신경절 대식세포의 기여를 연루하고있다. 급속하게 phenotyping (또는 "급속한 격리") 신경 상해의 맥락에서 등대 근 신경절 대식세포의 반응은 알려지지 않은 신경면역 요인을 확인하기 위하여 요구된다. 여기에서 우리는 우리의 실험실이 효소가 없는 기계적인 해리 프로토콜을 사용하여 등쪽 뿌리 중추에서 대식세포를 신속하고 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 견본은 세포 스트레스를 제한하기 위하여 얼음에 보관됩니다. 이 프로토콜은 표준 효소 프로토콜에 비해 훨씬 적은 시간 소모이며 형광 활성화 세포 선별 분석에 일상적으로 사용되어 왔습니다.
Introduction
면역 세포가 말초 신경 손상 다음 신경 병증 통증에 기여한다는 상당한 증거가 지금있다1,2. 성숙한 대식세포를 포함하는 말초 단핵세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상 및 전신 감염에 반응하는 것으로 알려져 있다. 척추 등쪽 경적에서 신경 손상 유발 미세글리아 활성화와 병행하면, 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 대식세포도 신경 손상 후 크게 확장된다3,4. 특히, DRG5,6, 7에서감각 뉴런과 상호 작용하여 말초 신경 손상 후 대식세포가 신경 병증 성 통증 발달에 기여하는지 여부를 결정하는 관심이 증가하고 있습니다. 8개 , 9개 , 10개 , 11. 또한, 최근 연구는 또한 신경 부상 후 축 축 수선에 DRG 대식세포의 기여를 연루12,13. 또 다른 연구는 대식세포 하위 집단(즉, CD11b+Ly6Chi 및 CD11b+Ly6C저/-세포)이 기계적 과민증14에서다른 역할을 할 수 있음을 시사한다. 따라서, 신경 손상의 맥락에서 DRG 대식세포의 반응을 급속하게 phenotyping하는 것은 우리가 신경 병성 고통에 기여하는 신경면역 요인을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.
종래, DRG에서 대식세포를 분리하는 프로토콜은 효소 소화15,16을포함하는 여러 단계를 포함한다. 이 기술은 종종 시간이 많이 걸리며 대규모 실험에 많은 비용이 들 수 있습니다. 콜라게나아제 타입 II(4 mg/mL)와 디스파스 타입 II(4.7 mg/mL)를 20분 동안 소화하는 가벼운 소화는 이전에15분동안 권장되었지만, 이 효소에 노출된 후 세포가 손상되거나 세포 사멸이 발생하기 쉽다고 생각할 수 있습니다. 항복. 또한, 배치에서 배치에 효소의 품질의 차이는 이 프로세스의 효율성에 더 영향을 미칠 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 효소 소화에 노출 된 대 식 세포 는 원치 않는 자극 될 수 있습니다 및 따라서 생체 내 상태에서 매우 다를 수 있습니다. 변경은 잠재적으로 기능적인 연구 결과의 결과를 복잡하게 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 기계적 해리를 사용하여 4 °C에서 DRG 대식세포를 신속하게 분리하는 효소없는 프로토콜을 설명합니다. 견본은 세포 응고를 제한하기 위하여 얼음에 보관됩니다. 결과적으로, 우리의 접근은 격리의 일관성을 유지하는 이점을 제공하고, 고립 된 세포는 아마도 건강하고 덜 자극된다. 우리는 또한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 가진 고립된 세포의 질을 검증하기 위하여 증거를 제출합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 캘리포니아 샌프란시스코 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 수행되었습니다.
1. 실험 마우스에서 요추 DRG를 수집
- 실험을 시작하기 전에, 9개의 매질을 Ca++ ++ ++-free10x HBSS와 혼합하여 밀도 그라데이션 배지(예를 들어, Percoll)의 작동 용액을 준비한다. 얼음에 보관하십시오.
- 2.5 % 아버틴으로 마우스를 마취. 뒷발 꼬집기에 대한 반응이 없어 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
참고: 6-8 주 세 남성과 여성 마우스 를 모두 사용했다. - 미리 냉각된 1x PBS의 10 mL로 마우스를 경피적으로 주입합니다.
- 화학 연기 후드 내부에 테이프로 고정 네 발로 supine 위치에 마우스를 배치합니다. 집게에 의해 늑골 케이지 아래피부를 들어 올리고 수술용 가위로 작은 절개를 하여 간과 횡격막을 노출시십시오.
- 다이어프램과 흉곽을 잘라 가위를 계속 사용하여 흉막 구멍을 열어 박동하는 심장을 노출시다.
- 조리개 가위로 오른쪽 심방 부속기를 빠르게 잘라냅니다. 출혈이 적시되면, 좌심실의 후부 끝에 30G 바늘을 삽입하고, 천천히 동물을 침투하기 위해 미리 냉각 된 1x PBS의 10 mL을 주입합니다.
- 경향이 있는 위치에 놓인 마우스에서 등도 하부절제술(15)을 수행한다.
참고: 세포 배양이 계획되면 절개 전에 70% 에탄올로 마우스를 살포하고 해부를 위해 사전 살균 수술 기구를 사용하십시오.- 크기 11 메스를 사용하여 흉부 부위에서 성골 부위까지 세로 측면 깊은 절개를 만듭니다. 등지 근육 층을 노출하는 가위로 피부를 제거합니다.
- 프리드먼-피어슨 롱게르를 사용하여 요추 척추 과정과 양측 횡방향 과정이 노출될 때까지 결합 조직과 근육을 벗겨냅니다.
- Noyes 스프링 가위를 사용하여 등등 척추를 조심스럽게 열고 프리드먼-피어슨 롱게르로 전환하여 척추 뼈를 제거하여 척추 신경이 부착된 척수를 노출시다.
- 조심스럽게 원소 측추및 반대측 요추 DRG (우리 연구에서 L4 / L5 DRG)를 해부하고 Dounce 조직 균질화에 얼음 차가운 Ca++ + +Mg++- 무료 1x HBSS 1 mL에 넣습니다. 이제 조직은 2 단계에 대한 준비가되어 있습니다.
참고: 가능하면 DRG에 부착된 척추 신경을 다듬습니다.
2. 마우스 요추 DRG에서 단일 세포를 분리
- Dounce 균질화기에서 느슨한 유봉으로 DRG 조직을 20-25 회 균질화하십시오.
- 멸균 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 멸균 50 mL 원점 튜브에 놓습니다. 800 μL의 얼음-차가운 1x HBSS로 세포 스트레이너를 적시고, 유동관통은 원추형 튜브에서 수집된다.
- 피펫을 이용하여 균질화된 조직 현탁액을 수집하고 습식 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 통과하여 50 mL 원엽 튜브로 통과한다.
- 균질화제를 800 μL의 얼음-차가운 1x HBSS로 두 번 헹구고 셀 스트레이너와 동일한 50 mL 원추형 튜브로 데천하여 수율을 높입니다.
- 멸균 된 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브에 평형 얼음 차가운 동위 원소 밀도 그라데이션 매체 (1.1 단계에서 제조)의 1.5 mL를 추가합니다.
- 50 mL 원엽 튜브 (단계 2.4)에서 세포 균질화를 FACS 튜브로 옮기고 상하 로 피펫팅하여 밀도 구배 매질과 잘 혼합하십시오. 1x HBSS의 500 μL을 추가하여 상단을 밀봉합니다.
- 4°C에서 20분 동안 800 x g에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛.
- FACS 튜브의 바닥에 있는 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지에 미엘린을 함유하는 상월체를 조심스럽게 흡인한다.
- FACS 분석을 위해 5% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 PBS 또는 FACS 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.
참고: 한 마우스의 L4/L5 DRG에서 최소 50,000~100,000개의 셀이 예상됩니다.- 기계적으로 단리된 DRG 세포(L4/L5)를 5% 태아 소 혈청을 함유하는 PBS의 100 μL에서 재중단한 다음, 1시간 동안 4°C에서 어둠 속에서 α-마우스 CX3CR1-APC 항체(1:2,000)로 배양한다.
- 한 번 PBS의 5 mL로 세포를 세척; 4 °C에서 8 분 동안 세포 360 x g를 원심 분리합니다.
- 상월체를 흡인한 다음 FCAS 분석을 위해 PBS의 300 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 정렬이 계획된 경우 대신 FACS 버퍼의 셀을 다시 일시 중단합니다.
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Representative Results
단리된 세포를 검증하기 위해, 우리는 먼저 대식세포 Fas-유도 세포자멸(MAFIA) 형질전환마우스(17)를선택했다. 이 라인은 약물 유도성 FK506 결합 단백질(FKBP)-Fas 자살 융합 유전자 및 녹색 형광 단백질(eGFP)을 CSF1 수용체(CSF1R)의 프로모터의 제어하에 표현하며, 이는 대식세포 및 마이크로글리아 모두에서 특이적 발현된다. FK 결합 단백질 이이머제의 전신 주사, AP20187 (AP), 이식유전자를 발현하는 세포의 세포사멸을 유도한다. EGFP의 발현은 또한 우리가 DRG에 있는 대식세포를 감시하는 것을 허용합니다. MAFIA 마우스의 대식세포 고갈을 위해, 우리는 AP (1 mg/kg)의 매일 복강 내 주사 3회로 연구를 시작했습니다. 마지막 주사 후, DRG는 GFP에 대한 면역 염색을 위해 단면화되었다. 우리는 VEH 처리 마우스에 비해 AP 처리 마우스의 DRG에서 GFP+ 세포의 상당한 손실을 기록했다(도 1A-B). 별도의 실험에서, 우리는 치료 후 DRG 대식세포를 기계적으로 해리하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 후속 FACS 분석은 AP 처리 마우스에서 GFPhi 집단의 성공적인 고갈을 밝혀냈다(도1C-D)단리된 세포의 높은 품질을 입증하였다.
우리는 또한 야생형 마우스로부터의 단리된 DRG 세포를 특징으로 한다. 기계적으로 단리된 DRG 세포(L4/L5)를 α-마우스 CX3CR1-APC 항체로 염색하였다. 우리는 DRG 세포의 6%가 CX3CR1+ 대식세포였다는 것을 발견했습니다(그림2A-B). 세포 생존력은 또한 생존하지 못하는 세포의 세포내 DNA에 결합하는 프로피듐 요오드화물(2.5 μg/ml의 최종 농도)으로 평가되었으며, 새로 분리된 DRG 세포의 80% 이상이 생존가능하다는 것을 밝혀냈습니다(그림2C-D).
도 1: AP 치료 후 마피아 마우스의 DRG에서 대식세포에 대한 FACS 분석.
MAFIA 마우스는 분석 전 3일 동안 AP20187(AP) 또는 비히클(VEH)의 1 mg/kg의 복강 내 주사를 매일 받았다. (A, B) 대표적인 면역염색 이미지는3rd AP 처리 후 L4/L5 DRG에서GFP+(녹색) 대식세포의 AP 유도 고갈을 예시하였다. NF200(파랑)은 골수성 뉴런에 라벨을 붙이도록 사용되었다. 스케일 바: 50 μm. (C, D) L4/5 DRG의 기계적 해리 후 CSF1R-GFPhi 세포 백분율은 FACS 분석에 의해 결정되었고, 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터 세트는 지시된 게이드 셀 집단의 백분율로 나타났다. 결과는 VEH 처리된 동물의 DRG로부터의 총 단리된 세포의 4%가 GFP하이 대식세포였다는 것을 보여준다. 대조적으로, 총 DRG 세포의 0.4%만이 AP 처리 마우스에서 GFPhi macrophages였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 야생형 마우스의 DRG에서 대식세포의 FACS 특성화.
(A, B) 순진한 야생형 마우스의 입시측측L4 및 L5 DRG를 기계적 해리를 위해 풀레이션시켰다. 백분율 CX3CR1+ 대식세포는 FACS분석(A)에의해 측정되었다. CX3CR1+ 세포에 대한 게이팅은 APC-컨쥬게이션된 이소형 조절항체(B)로배양된 세포에서의 배경 형광에 기초하였다. (C, D) 갓 단리된 DRG 세포의 세포 생존가능성을 프로피듐 요오드화물(PI) 염색으로 평가하였다. PI+세포(C)는 얼룩지지 않은 세포(D)에서 배경 형광에 기초하여가문을 하였다. 3개의 독립적인 실험에서 대표적인 데이터 세트는 표시된 게이드 셀 집단의 백분율로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서는 마우스 DRG에서 분리된 대식세포를 효과적으로 풍부하게 하는 새로운 방법을 소개합니다. DRG 면역 세포를 분리하는 기존의 접근법은 효소 소화15,18을필요로하며, 이는 이제 원치 않는 세포 손상을 제한하고 수율을 높이기 위해 프로토콜에서 기계적 균질화로 대체됩니다. 따라서 새 프로토콜은 훨씬 적은 시간 소모입니다. 더 중요 한 것은, 효소 소화 대 식 세포를 자극 하 고 분자 서명을 변경할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 기계적 접근 방식은 세포 스트레스를 크게 제한합니다.
FACS 분석을 사용하여, 우리는 더 단리된 DRG 세포에서 대식세포를 특성화하고 훌륭한 세포 회복을 입증하였다. 이 프로토콜하에서 단리된 DRG 세포의 80% 이상이 실행 가능한 것으로나타났다(도 2D). 적어도 50,000 ~ 100,000 개의 세포는 하나의 마우스의 L4 /L5 DRG로부터 예상된다. 그러므로, 우리는 DRG 세포가 배양 또는 RNA 격리를 위한 대식세포 하위 집단14로 더 분류될 수 있다는 것을 자신있게 결론을 내릴 수 있습니다. 그러나 수율에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 만족스럽지 못한 세포 수율이 주목되는 경우, 2.1단계에서 불충분하거나 과도한 균질화가 의심되어야 한다. PI(도 2)또는 7-AAD 염색으로 평가된 세포 사멸의 정도는 프로토콜을 최적화하는 데 활용될 수 있다. 또한, 1.4단계에서의 DRG 해부는 초보자를 위한 반복적인 연습이 필요할 수 있다.
현재, 우리의 실험실은 주로 DRG 대식세포 연구를 위해이 프로토콜을 사용합니다. 가능성이, 이 프로토콜의 적용은 위성세포(19)및 T세포(20)와같은 DRG에서 다른 비신경세포를 연구하기 위해 확장될 수 있다. 세포 격리의 효과 확인 하기 위해 추가 연구가 필요 하다. 불행히도, 현재의 기계적 해리 방법은 DRG 감각 뉴런의 분리에 이상적이지 않으며, 효소 소화는 감각 뉴런격리(15)에가장 효과적인 방법으로 남아 있다.
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Disclosures
저자는이 원고와 관련된 경쟁 적인 금전적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구에 의해 지원 되었다: 마 취 교육 및 연구에 대 한 재단 (XY); UCSF 마취 및 perioperative 배려의 부 (XY); 및 1R01NS100801-01(GZ). 이 연구는 NIH (P30CA082103)의 보조금을 통해 세포 분석 공유 자원 시설에 대한 HDFCCC 연구소에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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