Summary
Aquí presentamos un protocolo de disociación mecánica para aislar rápidamente los macrófagos del ganglio de la raíz dorsal para el fenotipado y el análisis funcional.
Abstract
Hay intereses crecientes para estudiar las interacciones moleculares y celulares entre las células inmunitarias y las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal después de la lesión del nervio periférico. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos, responden a una lesión tisular a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. La evidencia emergente ha implicado la contribución de los macrófagos de los ganglios de raíz dorsal al desarrollo del dolor neuropático y la reparación axonal en el contexto de la lesión nerviosa. Se desea fenoticante rápidamente (o "aislamiento rápido de") la respuesta de los macrófagos de ganglios de raíz dorsal en el contexto de una lesión nerviosa para identificar los factores neuroinmunes desconocidos. Aquí demostramos cómo nuestro laboratorio aísla rápida y eficazmente los macrófagos de los ganglios de la raíz dorsal utilizando un protocolo de disociación mecánica libre de enzimas. Las muestras se mantienen en hielo para limitar el estrés celular. Este protocolo consume mucho menos tiempo en comparación con el protocolo enzimático estándar y se ha utilizado rutinariamente para nuestro análisis de clasificación de células activado por fluorescencia.
Introduction
Ahora hay evidencia considerable de que las células inmunitarias contribuyen al dolor neuropático después de la lesión del nervio periférico1,2. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos maduros, responden a lesiones tisulares e infecciones sistémicas a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. Paralelamente a la activación de microglia inducida por una lesión nerviosa en el cuerno dorsal espinal, los macrófagos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) también se expanden significativamente después de la lesión nerviosa3,4. En particular, hay intereses crecientes para determinar si los macrófagos contribuyen al desarrollo del dolor neuropático después de la lesión del nervio periférico interactuando con las neuronas sensoriales en el DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Además, estudios recientes también implican la contribución de los macrófagos DRG en la reparación axonal después de una lesión nerviosa12,13. Otro estudio sugiere además que las subpoblaciones de macrófagos (es decir, CD11b+Ly6Chi y CD11b+Ly6Ccélulas bajas/-) pueden desempeñar un papel diferente en la hipersensibilidad mecánica14. Por lo tanto, el fenotipado rápidamente de la respuesta de los macrófagos DRG en el contexto de una lesión nerviosa puede ayudarnos a identificar factores neuroinmunes que contribuyen al dolor neuropático.
Convencionalmente, el protocolo para aislar los macrófagos en el DRG implica múltiples pasos incluyendo la digestión enzimática15,16. La técnica a menudo consume mucho tiempo y puede ser costosa para experimentos a gran escala. Aunque se recomendópreviamentela digestión leve con colagenasa tipo II (4 mg/ml) y dispasa tipo II (4,7 mg/ml) durante 20 min, es concebible que las células después de la exposición a esta enzima sean propensas a daños celulares o a la muerte celular, lo que puede conducir a un bajo Rendimiento. Además, la diferencia en la calidad de las enzimas de lote a lote puede afectar aún más la eficiencia de este proceso. Lo que es más importante, los macrófagos expuestos a la digestión enzimática pueden estimularse indeseablemente y, por lo tanto, pueden ser muy diferentes del estado in vivo. Los cambios pueden complicar potencialmente el resultado del estudio funcional.
Aquí describimos un protocolo libre de enzimas para aislar rápidamente los macrófagos DRG a 4 oC utilizando la disociación mecánica. Las muestras se mantienen en hielo para limitar el estrés celular. Como resultado, nuestro enfoque proporciona una ventaja para mantener la consistencia del aislamiento, y las células aisladas son presumiblemente más saludables y menos estimuladas. Además, presentamos la evidencia para validar la calidad de las células aisladas con análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Recoger DRG lumbar de ratones experimentales
- Antes de iniciar el experimento, prepare la solución de trabajo del medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll) mezclando 9 volúmenes del medio con 1 volumen de Ca++/Mg++-libre 10x HBSS. Mantenlo en hielo.
- Anestetiza el ratón con 2.5% Avertin. Confirme que el animal está completamente anestesiado por la falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
NOTA: Se utilizaron ratones macho sin edad y 6-8 semanas. - Perfumar el ratón transcardialmente con 10 mL de pS. pre-enfriado 1x PBS.
- Coloque el ratón en posición supina con cuatro patas aseguradas con la cinta dentro de una campana de humo químico. Levante la piel debajo de la caja torácica por los fórceps, y haga una pequeña incisión con tijeras quirúrgicas para exponer el hígado y el diafragma.
- Continúe usando tijeras para cortar el diafragma y la caja torácica, abra la cavidad pleural para exponer el corazón latiendo.
- Corta rápidamente el apéndice auricular derecho con tijeras de iris. Una vez observado el sangrado, inserte una aguja de 30 G en el extremo posterior del ventrículo izquierdo, e inyecte lentamente 10 ml de PBS preenfriado 1x para perfumar al animal.
- Realizar laminectomía dorsal15 en el ratón colocado en la posición propensa.
NOTA: Si se planifica el cultivo celular, rocíe el ratón con 70% de etanol antes de la incisión y utilice instrumentos quirúrgicos preesterilizados para la disección.- Utilice un bisturí talla 11 para hacer una incisión profunda lateral longitudinal desde la región torácica hasta la región sacro. Retire la piel por las tijeras para exponer la capa muscular dorsal.
- Utilice Friedman-Pearson Rongeur para despegar los tejidos y músculos conectivos hasta que los procesos de la columna vertebral lumbosacral y los procesos transversales bilaterales estén expuestos.
- Usa una Tijera de Resorte Noyes para abrir cuidadosamente la columna dorsal dorsal, luego cambia a un Rongeur Friedman-Pearson para remover los huesos vertebrales para exponer la médula espinal con los nervios espinales intactos unidos.
- Diseccionar cuidadosamente el DRG lumbar ipsilateral y contralateral (L4/L5 DRG en nuestro estudio) y colóquelo en 1 ml de hielo-frío Ca++/Mg++-libre 1x HBSS en un homogeneizador de tejido Dounce. Ahora los tejidos están listos para el paso 2.
NOTA: Si es posible, recorta el nervio espinal conectado al DRG.
2. Aísle las células individuales del DRG lumbar del ratón
- Homogeneizar el tejido DRG con un pestillo suelto en el homogeneizador Dounce 20-25 veces.
- Coloque un colador de celda de nylon estéril de 70 m en un tubo cónico estéril de 50 ml. Humedezca el colador celular con 800 ml de hielo frío 1x HBSS, y el flujo a través se recoge en el tubo cónico.
- Recoger la suspensión de tejido homogeneizado del homogeneizador utilizando una pipeta y pasar a través del tensor húmedo de células de nylon de 70 m en el tubo cónico de 50 ml.
- Enjuague el homogeneizador dos veces con 800 ml de hielo frío 1x HBSS y luego decanse en el mismo tubo cónico de 50 ml con colador celular para aumentar el rendimiento.
- Añadir 1,5 ml de medio de gradiente de densidad isotónica de hielo-hielo equilibrado (preparado en el paso 1.1) en un tubo estéril de 5 ml de poliestireno FACS.
- Transfiera el homogeneato celular desde el tubo cónico de 50 ml (en el paso 2.4) al tubo FACS, mezcle bien con el medio de gradiente de densidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Agregue 500 s l adicionales de 1 x HBSS para sellar la parte superior.
- Peletizar las células por centrifugación a 800 x g durante 20 min a 4oC.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante que contiene mielina en el medio sin alterar el pellet celular en la parte inferior del tubo FACS.
- Resuspender las células en PBS o tampón FACS que contienen 5% de suero bovino fetal (FBS) para el análisis de FACS.
NOTA: Se esperan al menos 50.000 a 100.000 celdas de L4 /L5 DRG de un ratón.- Resuspenda las células DRG aisladas mecánicamente (L4/L5) en 100 ml de PBS que contengan 5% de suero bovino fetal y luego incubar con el anticuerpo CX3CR1-APC (1:2.000) en la oscuridad a 4 oC durante 1 h.
- Lavar las células con 5 ml de PBS una vez; centrifugar las células 360 x g durante 8 min a 4 oC.
- Aspirar el sobrenadante, luego resuspender el pellet celular en 300 l de PBS para el análisis FCAS. Si se planifica la ordenación de celdas, vuelva a suspender las celdas en el búfer FACS en su lugar.
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Representative Results
Para validar las células aisladas, primero elegimos los ratones transgénicos Depoptosis Inducida por Macrófagos (MAFIA)17. Esta línea expresa un gen de fusión suicida FK506 inducible (FKBP)-Fas y proteína fluorescente verde (eGFP) bajo el control del promotor del receptor CSF1 (CSF1R), que se expresa específicamente tanto en macrófagos como en microglia. La inyección sistémica de dimerizador de proteínas de unión a FK, AP20187 (AP), induce la apoptosis de las células que expresan el transgén. La expresión de EGFP también nos permite monitorizar los macrófagos en el DRG. Para agotar los macrófagos en los ratones MAFIA, comenzamos nuestros estudios con 3 inyecciones intraperitoneales diarias de AP (1 mg/kg). Después de la última inyección, DRG se seccionó para inmunostaining para GFP. Registramos una pérdida significativa de células GFP+ en el DRG de los ratones tratados con AP en comparación con ratones tratados con VEH(Figura 1A-B). En un experimento separado, utilizamos este protocolo para disociar mecánicamente los macrófagos DRG después del tratamiento. El análisis posterior de FACS reveló un agotamiento exitoso de la población deHI de GFP en ratones tratados con AP(Figura 1C-D)y demostró la alta calidad de las células aisladas.
También caracterizamos las células DRG aisladas de los ratones de tipo salvaje. Las células DRG aisladas mecánicamente (L4/L5) se tiñieron con el anticuerpo CX3CR1-APC. Encontramos que el 6% de las células DRG eran CX3CR1+ macrófagos(Figura 2A-B). La viabilidad celular también se evaluó con Propidium Iodide (concentración final de 2,5 g/ml) que se une al ADN intracelular de las células no viables, revelando que más del 80% de las células DRG recién aisladas eran viables(Figura 2C-D).
Figura 1: Análisis FACS de macrófagos en el DRG de ratones MAFIA después del tratamiento con AP.
Los ratones MAFIA recibieron una inyección intraperitoneal diaria de 1 mg/kg de AP20187 (AP) o vehículo (VEH) durante 3 días antes del análisis. (A, B) Imágenes de inmunostaining representativas que muestran el agotamiento inducido por AP de macrófagos GFP+ (verde) en el DRG L4/L5 después del tratamiento3rd AP. NF200 (azul) se utilizó para etiquetar las neuronas mielinizadas. Barra de escala: 50 m. (C, D) El porcentaje de célulashi CSF1R-GFP después de la disociación mecánica del DRG L4/5 se determinó mediante el análisis FACS, y se muestra un conjunto de datos representativo de tres experimentos independientes con el porcentaje de la población de células cerradas indicado. El resultado muestra que el 4% del total de células aisladas del DRG del animal tratado con EFP fueron los macrófagos dealta FPG. Por el contrario, sólo el 0,4% del total de células DRG fueronhi macrófagos de GFP en el ratón tratado con AP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización FACS de macrófagos en el DRG de los ratones de tipo salvaje.
(A, B) Ipsilateral L4 y L5 DRG de ratón de tipo salvaje ingenuo fueron agrupados para la disociación mecánica. El porcentaje CX3CR1+ macrófagos se midió mediante el análisis FACS (A). El gating para CX3CR1+ células se basó en la fluorescencia de fondo en las células incubadas con anticuerpo de control de isotipo conjugado APC (B). (C, D) La viabilidad celular de las células DRG recién aisladas se evaluó con la tinción de propiduro y yodo (PI). LAS células PI+ (C) se encerradon sobre la base de la fluorescencia de fondo en las células no conservadas (D). Se muestra un conjunto de datos representativo de tres experimentos independientes con el porcentaje de la población de células cerradas indicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí introducimos un nuevo método para enriquecer eficazmente los macrófagos aislados del DRG de ratón. El enfoque convencional para aislar las células inmunitarias DRG requiere digestión enzimática15,18, que ahora se sustituye por la homogeneización mecánica en nuestro protocolo para limitar el daño celular no deseado y aumentar el rendimiento. Por lo tanto, el nuevo protocolo consume mucho menos tiempo. Más importante aún, la digestión enzimática podría estimular los macrófagos y cambiar la firma molecular. Por el contrario, nuestro enfoque mecánico limita en gran medida el estrés celular.
Usando el análisis FACS, caracterizamos aún más los macrófagos en las células DRG aisladas y demostramos una gran recuperación celular. Más del 80% de las células DRG aisladas bajo este protocolo se encontraron como viables(Figura 2D). Se esperan al menos 50.000 a 100.000 celdas de L4 /L5 DRG de un ratón. Por lo tanto, podemos concluir con confianza que las células DRG se pueden clasificar aún más en subpoblaciones de macrófagos14 para el cultivo o el aislamiento de ARN. Sin embargo, hay algunos pasos críticos que pueden afectar el rendimiento. Si se observa el rendimiento celular insatisfactorio, se debe sospechar la homogeneización insuficiente o excesiva en el paso 2.1. El grado de muerte celular evaluado con PI (Figura 2) o la tinción 7-AAD se puede utilizar para optimizar el protocolo. Además, la disección DRG en el paso 1.4 puede requerir práctica repetida para principiantes.
Actualmente, nuestro laboratorio utiliza principalmente este protocolo para estudiar los macrófagos DRG. Probablemente, la aplicación de este protocolo se puede ampliar para estudiar otras células no neuronales en el DRG, tales como células satélite19,y células T20. Se necesitan más estudios para confirmar la eficacia del aislamiento celular. Desafortunadamente, nuestro método de disociación mecánica actual no es ideal para el aislamiento de las neuronas sensoriales DRG, y la digestión enzimática sigue siendo el método más eficaz para el aislamiento sensorial de neuronas15.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia relacionados con este manuscrito.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); el Departamento de Anestesia y Cuidado Perioperatorio (XY) de la UCSF; y 1R01NS100801-01(GZ). Este estudio fue apoyado en parte por HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility a través de una subvención del NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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