Summary
Hier stellen wir ein mechanisches Dissoziationsprotokoll vor, um Makrophagen aus dem dorsalen Wurzelganglien für Phänotypisierung und funktionelle Analyse schnell zu isolieren.
Abstract
Es gibt wachsendes Interesse, die molekularen und zellulären Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und sensorischen Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien nach peripheren Nervenverletzungen zu untersuchen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich Makrophagen, sind dafür bekannt, auf eine Gewebeverletzung durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Neue Beweise haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonale Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen impliziert. Schnell phänotypisieren (oder "schnelle Isolierung von") die Reaktion von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen im Zusammenhang mit Nervenverletzungen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert. Die Proben werden durchweg auf Eis gehalten, um den zellulären Stress zu begrenzen. Dieses Protokoll ist im Vergleich zum standardenzymatischen Protokoll weit weniger zeitaufwändig und wurde routinemäßig für unsere fluorescence-aktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet.
Introduction
Es gibt inzwischen erhebliche Hinweise darauf, dass Immunzellen zu den neuropathischen Schmerzen nach der peripheren Nervenverletzung1,2beitragen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich reifer Makrophagen, sind dafür bekannt, auf Gewebeverletzungen und systemische Infektionen durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Parallel zur nervenverletzungsinduzierten Mikroglia-Aktivierung im Spinaldorsalhorn dehnen sich Makrophagen in den Dorsalwurzelganglien (DRG) auch nach einer Nervenverletzung deutlich aus3,4. Insbesondere gibt es wachsendes Interesse zu bestimmen, ob Makrophagen zur neuropathisigen Schmerzentwicklung nach peripheren Nervenverletzungen beitragen, indem sie mit sensorischen Neuronen in der DRG5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11. Darüber hinaus implizieren neuere Studien auch den Beitrag von DRG-Makrophagen bei der axonalen Reparatur nach Nervenverletzungen12,13. Eine weitere Studie legt ferner nahe, dass Makrophagensubpopulationen (d. h. CD11b+Ly6Chi und CD11b+Ly6CLow/- Zellen) eine andere Rolle bei der mechanischen Überempfindlichkeit14spielen können. Daher kann eine schnelle Phänotypisierung der Reaktion von DRG-Makrophagen im Zusammenhang mit Einer Nervenschädigung uns helfen, Neuroimmunfaktoren zu identifizieren, die zu neuropathische Schmerzen beitragen.
Üblicherweise umfasst das Protokoll zur Isolierung von Makrophagen in der DRG mehrere Schritte, einschließlich der enzymatischen Verdauung15,16. Die Technik ist oft zeitaufwändig und kann für groß angelegte Experimente teuer werden. Obwohl eine milde Verdauung mit Kollagenase Typ II (4 mg/ml) und Dispase Typ II (4,7 mg/ml) für 20 min zuvor15empfohlen wurde, ist es denkbar, dass Zellen nach der Exposition gegenüber diesem Enzym anfällig für Zellschäden oder Zelltod sind, was zu aufgeben. Darüber hinaus kann der Unterschied in der Qualität der Enzyme von Charge zu Charge die Effizienz dieses Prozesses weiter beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass Makrophagen, die der Enzymverdauung ausgesetzt sind, unerwünscht stimuliert werden und sich somit sehr vom In-vivo-Status unterscheiden können. Die Änderungen können das Ergebnis der funktionellen Studie möglicherweise erschweren.
Hier beschreiben wir ein enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung von DRG-Makrophagen bei 4 °C mittels mechanischer Dissoziation. Die Proben werden auf Eis gehalten, um zellulären Stress zu begrenzen. Infolgedessen bietet unser Ansatz einen Vorteil, um die Konsistenz der Isolierung aufrechtzuerhalten, und die isolierten Zellen sind vermutlich gesünder und weniger stimuliert. Wir stellen außerdem den Nachweis vor, die Qualität der isolierten Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zu validieren.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Francisco genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.
1. Sammeln Lenden wirbeln DRG von experimentellen Mäusen
- Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums (z.B. Percoll) vor, indem Sie 9 Volumen des Mediums mit 1 Volumen ca++/Mg++ -frei10x HBSS mischen. Halten Sie es auf Eis.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit 2,5% Avertin. Bestätigen Sie, dass das Tier durch die fehlende Reaktion auf die Hinterpfoten-Pinch vollständig beästhetisiert ist.
HINWEIS: Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet. - Durchdringen Sie die Maus transkardiniert mit 10 ml vorgekühlten 1x PBS.
- Legen Sie die Maus in die Supine-Position mit vier Pfoten mit dem Band in einer chemischen Rauchhaube gesichert. Heben Sie die Haut unter dem Rippenkäfig durch die Zange, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit chirurgischer Schere, um die Leber und Daschglas freizulegen.
- Verwenden Sie weiterhin eine Schere, um die Membran und den Rippenkäfig zu schneiden, öffnen Sie die Pleurahöhle, um das schlagende Herz freizulegen.
- Schneiden Sie schnell das rechte Vorhof-Anhängseln mit Irisschere. Sobald die Blutung festgestellt wurde, legen Sie eine 30 G Nadel in das hintere Ende der linken Herzkammer, und langsam injizieren 10 ml vorgekühlte 1x PBS, um das Tier zu durchdringen.
- Führen Sie dorsale Laminektomie15 auf der Maus an der anfälligen Position platziert.
HINWEIS: Wenn die Zellkultur geplant ist, sprühen Sie die Maus vor dem Einschnitt mit 70% Ethanol und verwenden Sie vorsterilisierte chirurgische Instrumente zur Zerlegung.- Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 11, um eine längsseitige tiefe Einschnitte von der Brustregion bis in die sakrale Region zu machen. Entfernen Sie die Haut durch die Schere, um die dorsale Muskelschicht freizulegen.
- Verwenden Sie Friedman-Pearson Rongeur, um das Bindegewebe und die Muskeln abzuschälen, bis die lumbosakralen Wirbelsäulenprozesse und bilateralen Querprozesse exponiert sind.
- Verwenden Sie eine Noyes Spring Scissor, um die rückenförmige Wirbelsäule vorsichtig zu öffnen, und wechseln Sie dann zu einem Friedman-Pearson Rongeur, um die Wirbelknochen zu entfernen, um das Rückenmark mit intakten Rückenmarksnerven freizulegen.
- Sezieren Sie ipsilaterale und kontralaterale Lendendramen DRG (L4/L5 DRG in unserer Studie) sorgfältig und legen Sie sie in 1 ml eiskalteca.++/Mg++-frei 1x HBSS in einem Dounce Gewebe homogenisierer. Jetzt sind die Gewebe bereit für Schritt 2.
HINWEIS: Trimmen Sie den Spinalnerv, der nach Möglichkeit an das DRG angeschlossen ist.
2. Isolieren Sie einzelne Zellen aus Mauslenden drG
- Homogenisieren Sie das DRG-Gewebe mit einem lockeren Stößel im Dounce Homogenisator 20-25 mal.
- Legen Sie ein steriles 70'm Nylon-Zellsieb in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Befeuchten Sie das Zellsieb mit 800 l eiskaltem 1x HBSS, und der Durchfluss wird im konischen Rohr gesammelt.
- Sammeln Sie die homogenisierte Gewebesuspension mit einer Pipette aus dem Homogenisator und passieren Sie das nasse 70-m-Nylon-Zellsieb in das 50 ml konische Rohr.
- Spülen Sie den Homogenisator zweimal mit 800 l eiskaltem 1x HBSS und dekantieren Sie dann mit Zellsieb in das gleiche 50 ml konische Rohr, um die Ausbeute zu erhöhen.
- 1,5 ml gleichgefragwürdiges equilibiertes eiskaltes isotonischer Dichtegradientenmedium (in Schritt 1.1) in ein steriles 5-ml-Polystyrol-FACS-Rohr geben.
- Übertragen Sie das Zellhomogenat aus dem 50 ml konischen Rohr (in Schritt 2.4) in das FACS-Rohr, mischen Sie gut mit dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren nach oben und unten. Fügen Sie eine zusätzliche 500 L von 1x HBSS hinzu, um die Oberseite zu versiegeln.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 800 x g für 20 min bei 4 °C.
- Den Überstand, der Myelin im Medium enthält, vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet am Boden des FACS-Rohrs zu stören.
- Setzen Sie die Zellen in PBS- oder FACS-Puffer, die 5% Fetales Rinderserum (FBS) für die FACS-Analyse enthalten, wieder aus.
HINWEIS: Mindestens 50.000 bis 100.000 Zellen werden von L4 /L5 DRG einer Maus erwartet.- Setzen Sie die mechanisch isolierten DRG-Zellen (L4/L5) in 100 l PBS mit 5% Fetalem Rinderserum wieder auf und inkubieren Sie dann mit dem CX3CR1-APC-Antikörper (1:2.000) im Dunkeln bei 4 °C für 1 h.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS einmal; Zentrifuge die Zellen 360 x g für 8 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie dann das Zellpellet in 300 l PBS für die FCAS-Analyse wieder aus. Wenn die Zellensortierung geplant ist, setzen Sie stattdessen die Zellen im FACS-Puffer wieder auf.
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Representative Results
Um die isolierten Zellen zu validieren, wählten wir zuerst die Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA) transgene Mäuse17. Diese Linie drückt ein medikamentös induzierbares FK506-bindendes Protein (FKBP)-Fas Selbstmordfusionsgen und grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) unter der Kontrolle des Promotors des CSF1-Rezeptors (CSF1R) aus, der sich sowohl in Makrophagen als auch in Mikroglia spezifisch äußert. Die systemische Injektion des FK-bindenden Proteindimeris, AP20187 (AP), induziert die Apoptose der Zellen, die das Transgen exexzieren. Die Expression von EGFP ermöglicht es uns auch, die Makrophagen in der DRG zu überwachen. Um Makrophagen bei den MAFIA-Mäusen zu abbauen, begannen wir unsere Studien mit 3 täglichen intraperitonealen Injektionen von AP (1 mg/kg). Nach der letzten Injektion wurden DRG zur Immunfärbung für GFP geschnitten. Wir verzeichneten einen signifikanten Verlust von GFP+ Zellen in der DRG der AP-behandelten Mäuse im Vergleich zu VEH-behandelten Mäusen (Abbildung 1A-B). In einem separaten Experiment haben wir dieses Protokoll verwendet, um die DRG-Makrophagen nach der Behandlung mechanisch zu dissoziieren. Die anschließende FACS-Analyse ergab eine erfolgreiche Erschöpfung derGFP-Hi-Population bei AP-behandelten Mäusen (Abbildung 1C-D) und zeigte die hohe Qualität isolierter Zellen.
Wir charakterisierten auch die isolierten DRG-Zellen von den Wildtyp-Mäusen. Mechanisch isolierte DRG-Zellen (L4/L5) wurden mit dem CX3CR1-APC-Antikörper der Maus gefärbt. Wir fanden heraus, dass 6% der DRG-Zellen CX3CR1+ Makrophagen waren (Abbildung 2A-B). Die Zelllebensfähigkeit wurde auch mit Propidium Iodid (Endkonzentration von 2,5 g/ml) bewertet, das an die intrazelluläre DNA der nicht lebensfähigen Zellen bindet, was zeigt, dass mehr als 80% der frisch isolierten DRG-Zellen lebensfähig waren (Abbildung 2C-D).
Abbildung 1: FACS-Analyse von Makrophagen in der DRG von MAFIA-Mäusen nach AP-Behandlung.
MAFIA-Mäuse erhielten 3 Tage vor der Analyse eine intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg AP20187 (AP) oder fahrzeug (VEH). (A, B) Repräsentative Immunfleckenbilder, die die AP-induzierte Erschöpfung von GFP+ (grünen) Makrophagen im L4/L5 DRG nach der3. AP-Behandlung zeigen. NF200 (blau) wurde verwendet, um myelinierte Neuronen zu kennzeichnen. Skalenstange:50 m. (C, D) Die prozentualen CSF1R-GFP-Hi-Zellen nach mechanischer Dissoziation des L4/5 DRG wurden durch FACS-Analyse bestimmt, und ein repräsentativer Datensatz aus drei unabhängigen Experimenten wird mit dem Prozentsatz der angegebenen Gated-Zellpopulation angezeigt. Das Ergebnis zeigt, dass 4% der gesamten isolierten Zellen aus der DRG von VEH-behandelten Tieren GFP-Hi-Makrophagen waren. Im Gegensatz dazu waren nur 0,4% der gesamten DRG-Zellen GFP-Hi-Makrophagen in AP-behandelter Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FACS-Charakterisierung von Makrophagen in der DRG der Wildtypmäuse.
(A, B) IpsilateralL4 und L5 DRG der naiven Wild-Typ-Maus wurden für die mechanische Dissoziation gepoolt. Die prozentigen CX3CR1+ Makrophagen wurden durch FACS-Analyse (A) gemessen. Die Gating für CX3CR1+ Zellen basierte auf der Hintergrundfluoreszenz in den Zellen, die mit APC-konjugiertem Isotyp-Kontrollantikörper (B) inkubiert wurden. (C, D) Die Zelllebensfähigkeit frisch isolierter DRG-Zellen wurde mit Propidium Iodid (PI)-Färbung bewertet. PI+ Zellen (C) wurden basierend auf der Hintergrundfluoreszenz in den unbefleckten Zellen (D) abgegrenzt. Ein repräsentativer Datensatz aus drei unabhängigen Experimenten wird mit dem Prozentsatz der angegebenen Gated-Zellpopulation angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier stellen wir eine neue Methode vor, um isolierte Makrophagen aus Maus-DRG effektiv anzureichern. Der konventionelle Ansatz, DRG-Immunzellen zu isolieren, erfordert eine enzymatische Verdauung15,18, die nun durch mechanische Homogenisierung in unserem Protokoll ersetzt wird, um unerwünschte Zellschäden zu begrenzen und die Ausbeute zu erhöhen. Daher ist das neue Protokoll weit weniger zeitaufwändig. Noch wichtiger ist, dass die Enzymverdauung die Makrophagen stimulieren und die molekulare Signatur verändern könnte. Im Gegensatz dazu begrenzt unser mechanischer Ansatz die zelluläre Belastung stark.
Mit Hilfe der FACS-Analyse charakterisierten wir die Makrophagen in den isolierten DRG-Zellen weiter und zeigten eine großartige zelluläre Erholung. Mehr als 80 % der isolierten DRG-Zellen im Rahmen dieses Protokolls erwiesen sich als lebensfähig (Abbildung 2D). Mindestens 50.000 bis 100.000 Zellen werden von L4 /L5 DRG einer Maus erwartet. Daher können wir mit Zuversicht schlussfolgern, dass die DRG-Zellen zur Kultur- oder RNA-Isolation weiter in Makrophagensubpopulationen14 sortiert werden können. Es gibt jedoch einige kritische Schritte, die sich auf den Ertrag auswirken können. Wird die unbefriedigende Zellausbeute festgestellt, so ist die unzureichende oder übermäßige Homogenisierung in Schritt 2.1 zu vermuten. Das Ausmaß des zelltoten Zelltodes, der mit PI (Abbildung 2) oder 7-AAD-Färbung bewertet wird, kann verwendet werden, um das Protokoll zu optimieren. Darüber hinaus kann die DRG-Sektion in Schritt 1.4 wiederholtes Üben für Anfänger erfordern.
Derzeit verwendet unser Labor dieses Protokoll hauptsächlich zum Studium der DRG-Makrophagen. Wahrscheinlich kann die Anwendung dieses Protokolls erweitert werden, um andere nicht-neuronale Zellen im DRG zu untersuchen, wie Satellitenzellen19und T-Zellen20. Weitere Studien sind notwendig, um die Wirksamkeit der Zellisolation zu bestätigen. Leider ist unsere aktuelle mechanische Dissoziationsmethode nicht ideal für die Isolierung von DRG sensorischen Neuronen, und die enzymatische Verdauung bleibt die effektivste Methode zur sensorischen Neuronenisolation15.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit diesem Manuskript.
Acknowledgments
Die Studie wurde unterstützt von: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); die UCSF-Abteilung für Anästhesie und Perioperative Versorgung (XY); und 1R01NS100801-01(GZ). Diese Studie wurde teilweise von der HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility durch ein Stipendium des NIH (P30CA082103) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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