Summary
이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.
Abstract
염색질 도메인의 조직 과 구조는 개별 세포 계에 고유합니다. 그들의 잘못된 조절은 세포 정체성 및 / 또는 질병에 있는 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 엄청난 노력에도 불구하고 염색질 도메인의 형성과 전파에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다. 크로마틴 도메인은 안정된 상태 조건 하에서 연구되어 왔으며, 이는 설립 기간 동안 초기 사건을 따르는 데 도움이되지 않습니다. 여기에서는 염색질 도메인을 유도적으로 재구성하고 시간의 함수로 재형성을 따르는 방법을 제시합니다. 비록, 먼저 PRC2 매개 억압 크로마틴 도메인 형성의 경우에 적용, 그것은 쉽게 다른 염색질 도메인에 적응 될 수 있었다. 유전체학 및 이미징 기술과 이 방법의 수정 및/또는 조합은 크로마틴 도메인의 설립을 매우 자세하게 연구하는 귀중한 도구를 제공할 것입니다. 우리는 이 방법이 염색질 도메인이 어떻게 형성되고 상호 작용하는지에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으킬 것이라고 믿습니다.
Introduction
진핵 게놈은 고도로 조직되고 염색질 접근성에 있는 변경은유전자 전사 1을 직접 통제합니다. 게놈은 전사 활동 및 복제 타이밍2,3와상관 관계가 있는 염색질 도메인의 명백한 모형을 포함합니다. 이러한 염색질 도메인은 몇 킬로베이스(kb)에서 100kb 이상까지 의 크기 범위이며 뚜렷한 히스톤변형 4의 농축을 특징으로 한다. 핵심 질문은 이러한 도메인이 어떻게 형성되고 어떻게 전파되는가하는 것입니다.
가장 잘 특징지어진 염색질 도메인 중 하나는 폴리콤 억압 복합체 2(PRC2)의 활성을 통해 육성된다. PRC2는단백질5,6의폴리콤 그룹(PcG)의 서브세트로 구성된 다중 소단위 복합체로, 히스톤 H3(H3K27me1/me2/me3)의 리신 27의 모노, 디-및트리메틸화를 촉매한다. 9,10. H3K27me2/me3는 억압적인 염색질 상태와 관련이 있지만 H3K27me1의 기능은불분명합니다 6,11. 중화민의 핵심 구성 요소 중 하나인 배아 외배엽 발달(EED)은, 그 방향족 케이지를 통해 PRC2 촉매, H3K27me3의 최종 생성물인 PrC212,13의알로스테릭 자극을 초래한다. PRC2 효소 활동은 특정 혈통에 대한 금기 특정 발달 유전자의 부적절한 발현으로 개발 중 세포 정체성을 보존하는데 매우 중요하며, 5, 6에 해가 될 것입니다. . 따라서, PRC2가 포유류에서 억압적인 염색질 도메인의 형성을 촉진하는 메커니즘을 해명하는 것은 세포 정체성을 이해하는 데 근본적으로 중요합니다.
PRC2 매개 염색질 도메인을 포함하여 염색질 도메인 형성을 조사하기 위해 고안된 모든 과거 실험 시스템은 염색질 도메인 형성의 전개 이벤트를 추적할 수 없는 정상 상태 조건하에서 수행되었습니다. 셀. 여기에서는 염색질 도메인의 초기 모집 및 전파를 모니터링하는 유도성 셀룰러 시스템을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 특히, 우리는 H3K27me2/3를 구성하는 PRC2 매개 억압성 염색질 도메인의 형성을 추적하는 데 중점을 둡니다. 염색질 도메인 형성의 기계적 세부 사항을 캡처할 수 있는 이 시스템은 H2AK119ub 또는 H3K9me을 포함하는 널리 연구된 도메인과 같은 다른 염색질 도메인을 통합하도록 적응될 수 있습니다. 유전체학 및 이미징 기술과 결합하여, 이 접근법은 염색질 생물학에 있는 각종, 중요한 질문을 성공적으로 해결하는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Protocol
유도성 EED 구조 MES 생성
1. 세포 배양
- 피더 프리 C57BL/6 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 사용하여 안정적으로 통합된 CreERT2 이식유전자를 보유하며, 이는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)의 투여 시 핵으로 전이할 수 있다 13.
- 기존의 ESC 배지14,15에서mESCs를 성장시키고, 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK 억제제 PD0325901 및 3 μM GSK3 억제제 CHIR99021로 보충하였다. 기존의 ESC 배지의 경우, 15% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.1 mM 2-메르카포에탄올을 함유한 녹아웃 DMEM을 사용하십시오.
- 미CS 배양에 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅된 플레이트를 사용하십시오.
2. 클론 EED 녹아웃 (KO) mES의 생성
- 설계 가이드 RNA(gRNAs)는 벤치클링 16의 CRISPR 설계 도구를 사용하여 MES에서 EED의 내인성 사본의 엑슨10및 엑슨 11을 삭제합니다. EED-KO-gRNA-1은 엑손 10의 바로 상류인트론을 표적으로 하고 EED-KO-gRNA-2는 엑손 11의 바로 하류인트론을 표적으로 한다. 이러한 gRNAs의 동시 응용 프로그램은 비 동종 끝 접합 (NHEJ)에 의해 엑슨 10과 엑슨 11 을 모두 삭제합니다.
- pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458)에 gRNAs를 복제 하는 Ran 외의 지침을 사용 하 여, 201317.
- 6웰 플레이트 포맷으로, 각 EED-KO-gRNA-1 및 EED-KO-gRNA-2(재료 표참조)의 1 mg을 가진 2 x 105 mESCs를 제조사의 지시에 따라 트랜스펙션 시약을 사용한다. 변환 후 24시간 동안 미디어를 변경합니다.
- 형질전환 2일 후, 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 사용하여 GFP 양성 세포를 분리한다. 형질감염 효율은 약 10-30%까지 다양할 것으로 예상됩니다. 도금을 위한 충분한 GFP 양성 세포를 포착하기 위하여 약 5 x 105 셀을 분류합니다.
- 분리된 GFP 양성 mESCs를 콜로니 피킹을 위해 0.1% 젤라틴(플레이트당 10-20 x10 3세포)으로 미리 코팅한 15cm 플레이트에 플레이트.
- 단일 식민지가 보일 때까지 약 1 주일 동안 ESC 배지에서 세포를 성장시다. 2일마다 미디어를 변경합니다.
- 20 μL 마이크로파이펫 팁을 사용하여 최소 48개의 콜로니를 선택하십시오. 마이크로파이펫 팁을 흡족히 취하면서 식민지를 긁어냅니다. 식민지를 단일 세포로 분해하지 마십시오. 콜로니를 아쿠타아제 함유(20 mL) 96 웰 플레이트로 옮니다.
- 모든 세포가 해리 될 때까지 37 °C에서 10 분 동안 식민지를 배양.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 200mL의 ESC 용지를 추가합니다.
- 잘 혼합하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 두 개의 별도의 96 웰 플레이트로 세포를 플레이트.
- 96개의 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 지질형 시핑을 하고 다른 플레이트는 헤비노티핑이 끝날 때까지 계속 자라고 있습니다. DNA 추출 솔루션을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 96 웰 플레이트에서 DNA를 추출합니다.
- 삭제된 부위에 걸쳐 제조업체의 지시에 따라 타크 DNA 폴리머라제와 함께 GE노태핑 PCR을 수행하는 Gnt_EED-KO-up 및 Gnt_EED-KO_down을사용하여 야노피 핑 프라이머를 사용하십시오.
참고 : DNA 폴리머라제의 다른 유형은 유전 형질 티핑에도 사용할 수 있지만, Taq DNA 폴리머 라제는 PCR 반응이 색 반응 버퍼를 사용할 때 겔에 직접로드 될 수 있기 때문에 편리함을 제공합니다.- 야생형(WT) 케이스에 비해 동형 체증을 가진 세포에서 분자량이 낮은 DNA 생성물 관찰.
참고 : PRC2 null 세포를 생성하려면 핵심 PRC2 13의 필수 하위 단위인 EED를 불안정하게하고 저하시키기 위해 엑소10 및 11의 동형접합 체 삭제가 필요합니다. CRISPR 타겟팅 효율은 약 10%입니다.
- 야생형(WT) 케이스에 비해 동형 체증을 가진 세포에서 분자량이 낮은 DNA 생성물 관찰.
- EED 엑손 10 및 11의 결실과 Sanger 시퀀싱 및 웨스턴 블로팅에 의한 EED 단백질의 손실을 각각 검증합니다.
- H3K27me2/me3 및 EED에 대한 항체를 사용하여 ChIP-seq에 의한 EED KO 세포의 크로마틴에서 EED 및 H3K27me2/me3의 고갈을 확인합니다. ChIP-seq 실험에 대해 Oksuz et al., 201715에 제공된 프로토콜을 사용하십시오.
3. EED 녹아웃 mES를 엔지니어링하여 Cre-ERT2 기반 유도성 EED 발현을 수용
- 벤치링16의 CRISPR 설계 툴을 사용하여 EED의 엑손 9에 이어 인트론 내 컷을 도입하는 gRNA(EED-gRNA-유도성)를 설계한다(재료표 참조).
- pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458)에 gRNAs를 복제 하는 Ran 외의 지침을 사용 하 여, 201317.
- AED cDNA 서열을 포함하는 공여자 템플릿 DNA를 설계한 후 9 및 C-말단 플래그-HA 태그 상류T2A-GFP 서열, 모두 내인성 유전자 서열에 대하여 역방향이다.
- 이종 역 loxP 사이트(lox66 및 lox71)18사이에 중첩된 스플라이스 수용자 및 폴리아데닐레이션 서열로 카세트를 측면.
- 각 끝에서 적어도 500 bp의 상동성 무기를 포함합니다. gBlock 유전자 조각의 2 세그먼트로 기증자 템플릿을 분할 (참조 gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" 및 gBlock-2-케이지 돌연변이 "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") PCR 블런트 벡터는 제조업체의 지시에 따라 깁슨 복제를 사용하여.
참고 : gblock-2는 H3K27me312와의상호 작용에 중요한 EED의 케이지 내에 방향족 잔류물 (Y365)을 포함합니다. gBlock-2-Wt는 야생 형 잔류물을 포함하고 있는 반면, gblock-2-케이지 돌연변이체는 H3K27me3에 결합할 수 없는 EED(Y365A)의 케이지 돌연변이를 함유하고 있습니다. 유도성 WT EED 구조는 i-WT-r 및 유도가능한 케이지 돌연변이 EED 구조가 편의를 위해 i-MT-r로 표시됨에 따라 표기된다.
- 6웰 플레이트 포맷에서, 트랜스펙트 2 x 105 mESCs와 gRNA(EED-gRNA-유도성) 및 기증기 템플릿 1 mg(i-WT-r 또는 i-MT-r)은 파CS를 사용하여 트랜스펙션 시약을 사용하고 GFP 양성 세포를 분리한다.
- 2.3-2.11 단계를 수행하여 성공적인 타겟팅을 위해 지질 형질 이윤을 내포할 준비가 된 개별 식민지를 분리합니다.
- 삽입 된 카세트에 걸쳐 Taq DNA 폴리머를 사용하여 유전자 형이 나는 PCR을 수행 유도-유전자형 FW-1 및 인덕티블_유전자형-REV-1을사용하여 유전자 형이 나는 프라이머를 사용합니다.
참고: CRISPR의 타겟팅 효율은 약 10%입니다.- Inducible_Genotype-FW-2 및 Inducible_Genotype-REV-2 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 카세트의 올바른 통합을 확인합니다.
참고 : 카세트의 동면 구체 통합은 EED의 효율적인 구조를 달성하는 데 필요합니다. 동형 결합을 가진 세포는 짧은 제품을 생성할 WT EED에 비해 단 하나 큰 DNA 생성을 생성할 것이라는 점에 유의하십시오.
- Inducible_Genotype-FW-2 및 Inducible_Genotype-REV-2 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 카세트의 올바른 통합을 확인합니다.
- Sanger 시퀀싱으로 카세트의 통합을 확인합니다.
- 4-OHT 투여 시, 카세트의 뒤집기 및 EED 및 기타 PRC2 핵심 구성 요소(예: EZH2 및 SUZ12)의 발현을 서양 블로팅에 의해 확인한다.
- 유세포분석으로 T2A-GFP의 발현과 플립 비율을 확인합니다. GFP의 표현은 카세트의 뒤집기와 EED의 표현을 나타냅니다.
4. 염색질에 대한 PRC2 활성의 핵 형성 및 확산에 따른
- i-WT-r 및 i-MT-r mESC가 유세포 측정에 의한 GFP의 누설 발현이 없는지 확인한다. GFP의 누설 발현의 경우, 실험을 시작하기 전에 FACS에 의해 GFP 음성 세포를 분리한다.
- i-WT-r 및 i-MT-r mESCs를 5개의 15cm 플레이트(플레이트당 5x 10 6셀)로 확장합니다.
- 0.5 mM 4-OHT를 0h, 12 h, 24 h, 36 h 및 8일(조건당 15 cm 플레이트)에 투여하여 WT 또는 케이지 돌연변이체 EED의 발현을 유도한다. 12시간 이상 치료에 대해 12시간 후에 미디어를 변경합니다. GFP를 사용하여 FACS에 의해 성공적으로 재결합된 세포를 분리하였다. 모든 조건이 한 번에 수집되도록 치료 시간을 조정하십시오.
- H3K27me2, H3K27me3에 대한 ChIP-seq를 수행하여 WT 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발현에 반응하여 염색질에 대한 측두엽 증착을 조사한다. 2017년15월15일 옥수즈 외에 상세히 설명된 라이브러리 준비를 포함한 ChIP-seq 프로토콜을 사용한다.
- 각 샘플에서 스파이크 인 컨트롤을 사용하여 서로 다른 시간 점19간의 정량적 비교를 허용합니다.
- 스파이크 인 제어를 위해, 드로소필라 멜라노가스터 (mESC 유래 크로마틴에 대한 1:50 비율)뿐만 아니라 드로우필라 특이적 H2Av 항체 (드로소필라 크로마틴 4 μg 당 H2Av 항체의 1 μL)를 사용하십시오. 각 샘플에 대한 제조업체의 지침)을 참조하십시오.
- 2017년15월15일 옥수즈 외에 상세히 기재된 프로토콜을 이용하여 미CS에서 와 유사한 방식으로 드로소필라로부터 염색질을 준비한다.
- 기본 매개변수20을사용하여 Bowtie 2를 사용하여 ChIP-seq에서 mm10 게놈에 대한 시퀀스를 매핑합니다.
- 마우스 ChIP-seq 읽기를 표준화하여 초파리 읽기 카운트21. 다음 공식을 사용하여 스파이크 인 정규화 계수를 계산합니다: 1 x 106/고유 Drosophila 읽기 개수. 실험당 약 1 x 106Drosophila 읽기 횟수와 20 x 106 마우스 읽기 횟수를 예상합니다.
- 입력 샘플을 시퀀싱할 때 드로소필라 크로마틴을 포함하지 마십시오.
- bedtools에서 게놈 콥 도구를 사용하여 bam 파일을 침대 그래프22로변환합니다. 다음으로, USCS23,24에서 bedGraphToBig 도구를 사용하여 침대 그래프를 bigwig 파일로 변환합니다. 다음 스크립트를 참조하십시오.
gen="mm10 게놈에 대한 경로"
chr="mm10 염색체 크기에 대한 경로"
inp_bam="입력 밤 파일에 대한 경로 "
곱하기="스파이크 인 정규화 계수 계산"
베드툴 게놈콥 -bg-스케일 $multiply -ibam $inp_bam-g $gen > output.bedGraph
정렬 -k1,1 -k2,2n 출력.bedGraph > output_sorted.bedGraph
베드그래프토빅위그 출력_정렬.베드그래프 $chr output.bw - USCS 게놈브라우저(24)에bigwig 파일을 업로드하여 ChIP-seq 읽기 밀도를 시각화합니다.
5. MESC 핵에서 H3K27me3 초점의 출현 및 성장을 모니터링
- 플레이트 1x 104 mESCs를 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅된 8웰 챔버 슬라이드로 넣습니다.
- 다음날, 표시된 시간 포인트(0h, 12h, 24 h 및 36h)에 대해 EED를 발현하는 세포를 수집하기 위해 연속적인 4-OHT(0.5 mM) 유도를 수행시작한다. 12시간 이상 치료를 위해 12시간 후에 미디어를 변경합니다.
- 실온(RT)에서 인산염 완충식식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드로 mES를 10분 동안 고정합니다.
- 30 분 동안 RT에서 PBS / 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.
- 30 분 동안 RT에서 PBS / 5 % 당나귀 혈청 / 0.1 % 트리톤 X-100 (차단 버퍼)로 세포를 차단하십시오.
- H3K27me3 1차 항체를 차단 완충액에서 1:500으로 희석하고 세포에 첨가한다.
- 4 °C에서 하룻밤 기본 항체로 세포를 배양.
- 다음날, PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 3번의 세차서를 수행합니다.
- 차단 완충액에서 이차 항체(Alexa fluor 595)를 1:1000 희석하고 세포상에 첨가한다.
- 알렉사 플루어와 공액된 이차 항체가 빛에 민감하기 때문에 다음 단계에서 어두운 곳에서 모든 배양을 수행한다.
- RT에서 2 시간 동안 이차 항체를 배양합니다.
- PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 3번의 세안을 수행합니다.
- DAPI(1 mg/mL)를 PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 1:4000으로 희석하고 세포에 첨가합니다.
- RT에서 10 분 동안 DAPI로 세포를 배양하십시오.
- 아쿠아 마운트로 셀을 장착합니다.
- 63배 배율로 공초점 현미경으로 세포를 이미지화합니다.
- ImageJ, 피지25의분포를 사용하여 이미지를 처리하고 의사 색을 칠합니다.
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Representative Results
조건부 구조 시스템의 일반적인 계획
도 1은 내인성 EED 궤적으로부터 발현되는 WT 또는 케이지 돌연변이체(Y365A) EED를 사용하여 EED KO 세포를 조건부로 구출하는 표적화 방식을 나타낸다. 안정성과 효소 활성에 필수적인 PRC2의 핵심 하위 단위인 EED를 노크한 후, EED의 엑손 9에 이어인트론 내의 카세트가 도입된다(그림 1). 카세트는 내인성 유전자 서열에 대하여 역방향에서 EED의 나머지 3' cDNA 서열로 구성된다. 카세트는 이종역 loxP 사이트(lox66 및 lox71)18에의해 측면에 있다. 세포는 H3K27me2/3의 완전한 손실이 관찰될 때까지 전파됩니다. 4-OHT를 첨가하여 Cre 재조합 발현이 활성화되면, 카세트는 스플라이스 수락서 서열을 사용하여 카세트 내로 접합되도록카세트를 반전시(도 1). 이 시스템을 통해 EED KO 세포는 이제 C-말단 Flag-HA 태그를 가진 EED의 WT 또는 케이지 돌연변이 버전에 의해 구조될 수 있다. 다운스트림 T2A-GFP는 성공적인 반전 이벤트를 겪는 셀에 대해 선택할 수 있는 마커를 제공합니다. 폴리A 신호는 다운스트림 서열의 전사를 방지합니다. 이 시스템을 통해 PRC2 모집의 역학과 H3K27me 도메인의 형성을 따를 수 있습니다.
중화권 H3K27me2/3의 시간적 증착 추적
PRC2 매개 염색질 도메인 확립의 시간적 역학을 따르기 위해, EED의 WT 또는 케이지 돌연변이 버전은 4-OHT 처리시 EED KO 세포의 배경에서 재발현된다(그림2A,B). H3K27me2/3 마크의 증착을 따르기 위해, H3K27me2/me3의 ChIP-seq는 표시된 시간 지점에 대해 WT 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발현 후에 수행된다. H3K27me3의 출현은 "핵 생성 부위"(도2C)로 표시된 이산 영역에서 WT EED 발현 후 12시간에서 관찰된 다음, 24h13에의해 초기 핵 생성 부위로부터 멀리 떨어진 영역에서 관찰된다. 결국, H3K27me3의 분포는 WT EED 발현 후 36시간에서 WT 부모 세포에서 볼 수 있는 수준과 거의 근접합니다. H3K27me3의 일시적으로 확립 된 다운 스트림 사이트는 "확산 사이트"13이라고합니다. 이 시스템은 또한 H3K27me3 증착 (그림2C,D)보다 앞에 나타나는 H3K27me2의 시간 증착을 추적할 수 있습니다. 마지막으로, 케이지 돌연변이 체의 재발현은 WT EED에 대해 상이한 역학을 나타낸다(도2C,D). 이 경우, H3K27me3의 증착은 매우 비효율적이며 대신 H3K27me2는 핵 형성 부위에 명백하고 집중되어 케이지 돌연변이 EED가 주변 영역으로 변형을 확산할 수 없음을 나타냅니다.
H3K27me3 초점의 출현과 그 성장은 현미경 검사법 (그림2E)13에의해 가시화 될 수 있습니다. WT EED 발현의 유도 전에, H3K27me3 염색은 명백하지 않다. 그러나, WT EED 발현의 12시간 H3K27me3 초점 형성의 증거를 나타낸다. 이러한 초점은 24시간까지 수및 크기에서 증가하고, 결국 WT EED 발현의 36시간까지 핵의 큰 영역으로 퍼진다. 이 시스템은 ChIP-seq 및 면역형광에 의해 모니터링되는 바와 같이 PRC2 매개 염색질 도메인의 de novo 형성의 증거를 제공한다 (도2C-E)13.
그림 1 : WT 또는 케이지 mt EED(Y365A)로 EED KO mES를 조건부로 구출하기 위한 타겟팅방식. 엑슨 10 및 11의 삭제는 EED의 불안정화 및 저하및 H3K27me2/me3의 글로벌 손실을 야기한다. 엑손 9와 10 사이의 인트론내 카세트는 지시된 바와 같이 역방향으로 삽입된다. 4-OHT의 첨가는 내인성 엑손 9 스플라이스가 카세트의 케이지 돌연변이체 또는 야생형 cDNA 내로 스플라이스되도록 카세트를 반전시켜 WT 또는 케이지 돌연변이 체의 유도가능한 재발현을 허용한다. 이 수치는 Oksuz 외, 201813에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 유도성 EED 구조 시스템(i-WT-r 및 i-MT-r)의 검증 및 대표 응용 프로그램. (a). i-WT-r 및 i-MT-r 시스템은 표시된 시점에서 WT(i-WT-r) 또는 케이지 돌연변이체(i-MT-r) EED의 발현을 유도하기 위해 4-OHT 처리 후 전체 추출물에 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검증된다. (B). 반전된 카세트의 성공적인 플립을 나타내는 T2A-GFP의 발현 효율을 확인하기 위한 i-WT-r 세포전(0h) 및 후(36시간) 4-OHT 처리에서 GFP의 유동 세포분석 분석. (C, D). ChIP-seq는 WT의 Emx1유전자 근처 또는 i-WT-r 또는 i-MT-r 세포에서 H3K27me3(C) 및 H3K27me2(D)에 대해 4-OHT 처리의 지시된 시간에 대해 추적한다. 히스톤 마크의 증착을 위한 초기 및 지연 된 사이트가 표시됩니다. (E). I-WT-r mESCs에서 WT EED 발현을 구출한 후 0, 12, 24 및 36시간에서 H3K27me3 항체를 이용한 면역형광. 36 h에서 염색은 낮은 노출에서 표시됩니다. 가장 오른쪽 패널은 빨간색 화살표로 레이블이 지정된 셀의 확대된 이미지입니다. 이 수치는 Oksuz 외, 201813에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
주어진 염색질 도메인의 형성 도중 기계론적인 세부사항을 이해하는 쪽으로 강력한 접근은, 먼저 도메인을 중단하고 세포 내의 진행 중인 그것의 재건을 추적하는 것입니다. 이 프로세스는 재구성 중에 언제든지 일시 중지되어 진행 중인 이벤트를 자세히 분석할 수 있습니다. 염색질 도메인에 대한 이전 연구는 정상 상태 조건(예: 야생형 및 유전자 녹아웃 비교)에서 수행되었기 때문에 이러한 이벤트를 해결할 수 없었습니다. 여기에서는, 우리는 세포에 있는 PRC2 중재한 억압도메인의 모집 그리고 퍼짐에 의해 강조된 것과 같이 염색질 도메인의 동적 형성을 평가하는 체계를 개략적으로 설명합니다.
이 유도 가능한 시스템에 대한 가장 중요한 단계는 세포에서 각각의 삭제 후 원하는 단백질 (또는 RNA)을 다시 발현하기 위해 DNA 구성물의 정확한 설계입니다. 다운스트림 응용 에 따라 다양한 돌연변이, 태그 및 형광 마커가 이러한 구문 내에서 도입될 수 있습니다. 예를 들어, GFP 직전에 자가 절개 된 T2A 펩티드를 사용하여 관심있는 단백질과 분리하는 대신, 다양한 형광 융합 단백질이 고해상도 이미징 및 / 또는 단일 입자 추적 실험을 위해 생성 될 수 있습니다. 살아있는 세포에 있는 염색질 도메인 대형의 초기 사건을 감시합니다.
이 방법은 염색질 도메인의 형성에 대한 통찰력을 제공하기 위해 여러 가지 방법으로 수정 될 수 있지만 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, Cre-ERT2 유전자를 수용하는 세포주가 필요하다. 둘째, 4-OHT 처리 후의 시간을 결정하기 위해 최적화가 필요하다. 셋째, 이 시스템은 염색질 도메인의 해체 동안 의 사건을 모니터링하도록 되돌릴 수 없다. Degron 기반 방법은 여기에 설명된방법 26,27에대한 대안으로 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 단백질의 가역적이고 신속한 분해를 가능하게 하지만, 일반적으로 보조 또는 쉴드26,27과같은 단백질 불안정화를 위해 값비싼 분자가 필요하다. 또한 이러한 탈지 기반 방법에는 한계가 있습니다. 그(것)들은 그것의 분해 후에 단백질의 WT 버전을 재발현하기 위하여만 이용될 수 있었습니다. 대조적으로, 본원에 기재된 시스템은 WT 대응이외에 관심 있는 단백질의 돌연변이 버전의 조건부 발현을 허용한다. 여기에 설명된 방법과 이러한 탈지 시스템을 결합하는 것은 염색질 도메인의 형성을 가역적으로 조절하는 강력한 수단이 될 것이다. 염색질 도메인의 형성을 따르기 위한 대안적인 방법은 염색질로부터 정의된 염색질 변형을 고갈시키고 그 후 수정의 de novo 침착을 따르도록 억제제를 세척하기 위해 특정 억제제의 사용을 수반한다. 예를 들어, EZH2 억제제 및 후속 세척을 사용한 치료는 H3K27me 도메인28의재형성을 추적하는 데 사용된다. 그러나, EZH2 억제제는 H3K27me을 완전히 고갈시키는 데 효과적이지 않으며, 심지어 치료 후 7일도 효과적이지 않다. 이 경우 기존 H3K27me의 존재는 PRC212를모집하고 활성화할 수 있어 결과의 해석이 복잡해질 수 있습니다. 또한, 많은 염색질 도메인에 대한 특이적이고 강력한 억제제의 부재로 인해 억제제 및 세척 전략의 사용이 제한된다.
이 방법의 세포 시스템에 적용 가능성 이외에, 그것은 유도 성 돌연변이를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다/동물에서 원하는 단백질에 태깅. 경우에 따라, 단백질을 돌연변이 또는 태그를 삽입 개발 하는 동안 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 이 치사성을 우회하고 조직 특정 Cre-ERT2 마우스 긴장과 결합해서 단백질의 돌연변이/태깅의 시간적 및 공간 통제를 제공합니다. 실험의 이 모형은 특정 조직 및/또는 발달의 특정 단계에서 돌연변이의 효력을 결정하기 위하여 귀중할 것입니다. 중요한 것은, 카세트 내의 리포터를 통해 성공적인 재결합을 겪는 세포의 격리를 허용한다. 이것은 주어진 단백질을 위한 조직 특정 상호 작용을 격리하기 위하여 특정 조직에서 친화도 정제와 같은 생화확적인 분석을 용이하게 합니다. 이 시스템은 주어진 셀룰러 프로세스의 동적 변화를 모니터링하기 위해 준비 될 수 있으며, 따라서 크로마틴 도메인 형성을 추적에 국한되지 않습니다.
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Disclosures
D.R.은 별자리 제약 및 풀크럼 치료제의 공동 창립자입니다. 저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
엘 발레스 박사, 디 오자타 박사, 에이치 무 박사님에게 원고 개정에 감사드립니다. D.R. 연구소는 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 보건원 (R01CA199652 및 R01NS100897)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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