Summary
该方法旨在跟踪细胞系中PRC2介导染色质域的形成，该方法可适用于许多其他系统。
Abstract
染色质域的组织和结构是单个细胞谱系所独有的。他们的管制不当可能导致细胞身份和/或疾病的损失。尽管作出了巨大努力，我们对染色质域的形成和传播的理解仍然有限。色质领域已在稳定状态条件下进行了研究，这不利于在建立过程中跟踪初始事件。在这里，我们提出了一种方法，以诱导地重建染色质域，并遵循其重新形成作为时间的函数。虽然，首先适用于PRC2介导的压制染色质域形成的情况，它可以很容易地适应其他染色质领域。该方法的修改和/或与基因组学和成像技术的结合，将为详细研究染色质域的建立提供宝贵的工具。我们相信，这种方法将彻底改变我们对染色质域如何形成和相互作用的理解。
Introduction
真核基因组组织性很强，染色质可及性的变化直接控制着基因转录1。基因组包含不同类型的染色质域，与转录活动和复制时间2，3相关。这些染色质域的大小范围从几个千碱（kb）到超过100kb，其特点是在独特的组蛋白修饰4中富集。核心问题是：这些域是如何形成的，如何传播？
一个最具特征的染色质域是通过 Polycomb 压制性复合体 2 （PRC2） 的活动培育的。PRC2 是一种多亚单位复合体，由蛋白质5、6 的 Polycomb 组 （PcG） 的子集组成，并催化组蛋白 H3 （H3K27me1/me2/me3）7、8 、 9，10.H3K27me2/me3与抑制性染色质状态有关，但H3K27me1的功能不清楚6，11。PRC2的核心部件之一，胚胎外阴体发育（EED），通过其芳香笼与PRC2催化的最终产物H3K27me3结合，这一特性导致PRC212，13的异体刺激。PRC2酶活性对于在发育过程中保持细胞特性至关重要，因为某些发育基因的不当表达，即特定血统的禁忌，将有害于5，6.因此，解开PRC2促进哺乳动物形成抑制性染色质域的机制，对于理解细胞特性至关重要。
所有过去旨在研究染色质域形成的实验系统，包括PRC2介导染色质域，都是在稳定状态条件下进行的，这些系统无法跟踪染色质域形成在细胞。在这里，我们提出了一个详细的协议，以生成一个诱导的细胞系统，监测染色质域的初始招募和传播。具体来说，我们专注于跟踪由H3K27me2/3组成的PRC2介导的压质染色质域的形成。该系统可以捕获染色质域形成的机械细节，可以调整以纳入其他染色质域，如广泛研究的域包括H2AK119ub或H3K9me。结合基因组学和成像技术，这种方法有可能成功地解决染色质生物学中的各种关键问题。
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Protocol
产生诱导式EED救援mESC
1. 细胞培养
- 使用无进纸的C57BL/6小鼠胚胎干细胞（mESCs），具有稳定集成的CreERT2转基因，在给给4-羟基塔莫西芬（4-OHT）13时可转移到细胞核。
- 在传统的ESC介质14、15中生长mESC，辅以1000U/mL LIF、1μM ERK抑制剂PD0325901和3μM GSK3抑制剂CHIR99021。对于传统的ESC介质，使用含有15%胎儿牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1X青霉素/链霉素和0.1 mM 2-汞的敲除DMEM。
- 使用涂有 0.1% 明胶溶液的板，用于培养 mESC。
2. 克隆 EED 敲除 （KO） mESC 的生成
- 设计指南RNA （gRNA） 删除 Exon 10 和 Exon 11 的内源副本 EED 在 mESC 使用 CRISPR 设计工具在 Benchling16。EED-KO-gRNA-1瞄准了外子10上游的内创，EED-KO-gRNA-2瞄准了紧邻Exon 11下游的内创。这些gRNA的同步应用通过非同源端连接（NHEJ）同时删除Exon 10和Exon 11。
- 使用 Ran 等人中的说明将 gRNA 克隆到 pSpCas9（BB）-2A-GFP （PX458） 中，201317.
- 在 6 孔板格式中，转染 2 x 105 mESC，每个 EED-KO-gRNA-1 和 EED-KO-gRNA-2（参见材料表）使用转染试剂，按照制造商的说明进行转染。转染后 24 小时更换介质。
- 转染两天后，使用荧光激活细胞分拣（FACS）分离GFP阳性细胞。预计转染效率在 10-30% 左右变化。对5 x 105个细胞进行分类，以捕获足够的GFP阳性细胞进行电镀。
- 将分离的 GFP 阳性 mESCs 板板放入 15 厘米板中，预涂有 0.1% 明胶（每板 10-20 x103细胞），用于菌落采摘。
- 在ESC培养基中生长细胞约一周，直到单个菌落可见。每 2 天更改一次媒体。
- 使用 20 μL 微移液器尖端选择至少 48 个菌落。刮过菌落，同时吸入微管头。不要将菌落分解成单个细胞。将菌落转移到含丙酶（20 mL）96孔板中。
- 在37°C下孵育菌落10分钟，直到所有细胞分离。
- 使用多通道移液器将 200 mL 的 ESC 介质添加到每个井中。
- 使用多通道移液器将电池混合成两个独立的 96 孔板。
- 使用96孔板之一进行基因分型，并保持另一个生长，直到基因分型结束。使用 DNA 提取溶液按照制造商的说明从 96 孔板中提取 DNA。
- 使用基因分型引物Gnt_EED-KO-up和Gnt_EED-KO_down，它跨越已删除的位点，按照制造商的说明使用 Taq DNA 聚合酶执行基因分型 PCR。
注：其他类型的DNA聚合酶也可用于基因分型，然而，Taq DNA聚合酶提供了方便，因为PCR反应可以直接加载在凝胶上，当其彩色反应缓冲液。- 观察与野生型 （WT） 病例相关的同源缺失细胞中分子量较低的 DNA 产物。
注：要生成PRC2空细胞，必须同源删除外大子10和11，以稳定和降解EED，这是核心PRC213的一个基本亚单位。CRISPR 定位效率约为 10%。
- 观察与野生型 （WT） 病例相关的同源缺失细胞中分子量较低的 DNA 产物。
- 分别验证EED外大子10和11的缺失以及Sanger测序和西印的EED蛋白损失。
- 使用针对H3K27me2/me3和EED的抗体，通过ChIP-seq确认EED和H3K27me2/me3从EED KO细胞中的染色质中消耗。使用Oksuz等人给出的协议，201715用于ChIP-seq实验。
3. 设计 EED 挖空 mESC 以包含基于可诱导 EED 表达式的 Cre-ERT2
- 设计 gRNA（EED-gRNA 诱导），使用 Benchling16中的 CRISPR 设计工具在 EED 的 exon 9 之后引入内创体中的切口（参见材料表）。
- 使用 Ran 等人中的说明将 gRNA 克隆到 pSpCas9（BB）-2A-GFP （PX458） 中，201317.
- 设计一个供体模板DNA，该DNA包括外源9之后的EED cDNA序列和T2A-GFP序列上游的C端标志-HA标记，所有DNA都相对于内源性基因序列相反。
- 带拼接接受器和聚体化序列的盒式磁带嵌套在异态倒置 loxP 位点（lox66 和 lox71）18之间。
- 从两端至少包括500 bp的同源臂。将供体模板分成2个片段（参见gBlock-1，gBlock-2-WT"https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI"和gBlock-2-cage突变体"https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM"），并将其组装成使用吉布森克隆的PCR模糊载体遵循制造商的说明。
注：gblock-2在EED的笼子里含有芳香残留物（Y365），对于与H3K27me312的相互作用非常重要。gBlock-2-Wt 含有野生型残留物，而 gblock-2-笼突变体包含 EED （Y365A） 的笼子突变物，无法与 H3K27me3 结合。诱导 WT EED 救援表示为i-WT-r，为方便起见，诱导笼突变 EED 救援表示为i-MT-r。
- 在6孔板格式中，转染2 x 105 mESCs与1毫克的gRNA（EED-gRNA诱导）和1毫克的捐赠模板（i-WT-r或i-MT-r）使用转染试剂，并使用FACS分离GFP阳性细胞。
- 按照步骤 2.3-2.11 隔离单个菌落，准备进行基因分型，以便成功定位。
- 使用基因分型引物诱导_基因型-FW-1和诱导-基因型-REV-1，跨越插入的盒式，并使用Taq DNA聚合酶执行基因分型PCR。
注：CRISPR 的目标效率约为 10%。- 使用诱导-基因型-FW-2和诱导-基因型-REV-2引种（位于同源臂外）确认PCR正确集成盒式磁带。
注：为了有效地拯救EED，需要将盒式磁带的同源整合。请注意，与WT EED相比，具有同源整合的细胞将产生单个大型DNA产物，而WT EED将产生短产品。
- 使用诱导-基因型-FW-2和诱导-基因型-REV-2引种（位于同源臂外）确认PCR正确集成盒式磁带。
- 通过桑格测序确认盒式磁带的集成。
- 通过西方印迹在 4-OHT 管理下确认盒式磁带的翻转以及 EED 和其他 PRC2 核心组件（例如 EZH2 和 SUZ12）的表达。
- 确认T2A-GFP的表达和流量细胞仪翻转百分比。请注意，GFP 的表达式表示翻转盒式磁带和 EED 的表达式。
4. PRC2活性在染色质上的成核和扩散后
- 确认 i-WT-r 和 i-MT-r mESC 没有流式细胞测量的 GFP 泄漏表达。在GFP表达泄漏的情况下，在开始实验之前，通过FACS分离GFP阴性细胞。
- 将 i-WT-r 和 i-MT-r mESC 扩展为五个 15 厘米板（每板 5x 106个细胞）。
- 通过0.5 mM 4-OHT在0小时、12小时、24小时、36小时和8天（每个条件下一个15厘米板）中诱导WT或笼突变EED的表达。在12小时后更换介质，治疗时间超过12小时。调整处理时间，以便一次收集所有条件。
- 对 H3K27me2、H3K27me3 执行 ChIP-seq，以调查其与染色质的暂时沉积，以响应 WT 或笼突变 EED 的重新表达。使用ChIP-seq协议，包括库准备详细在Oksuz等人，201715。
- 在每个样本中使用尖峰控制，以允许不同时间点19之间的定量比较。
- 对于尖峰控制，使用来自果蝇黑色素的染色质（与 mESC 衍生的染色质的 1：50 比例）以及果蝇特异性 H2Av 抗体（根据每个样品中的制造商说明）。
- 使用Oksuz等人（Oksuz等人）中详述的协议，以类似于mESCs的染色质制备来自果蝇的染色质，2017年15。
- 使用默认参数20将 ChIP-seq 的序列映射到 mm10 基因组，使用 Bowtie 2。
- 将鼠标 ChIP-seq 读取到尖峰-果蝇读取计数21。使用以下公式计算峰值归一化因子：1 x 106/唯一果蝇读取计数。每个实验预计获得大约 1 x 106果蝇读取计数和 20 x 106鼠标读取计数。
- 在测序输入样品时，不要包括果蝇染色质。
- 使用基因组cov工具从床具转换巴姆文件到床图22。接下来，使用从USCS23，24的床图到大维格工具转换床机文件。请参阅以下脚本：
基因="到mm10基因组的路径"
chr="到 mm10 染色体尺寸的路径"
inp_bam="输入巴姆文件的路径"
乘法="计算峰值归一化因子"
床具基因组cov-bg -规模$multiply-ibam $inp_bam-g $gen > 输出。
排序 -k1，1 -k2，2n 输出.床图形 > 输出_排序。
床图图比威格输出_排序.床图$chroutput.bw - 通过上传 USCS 基因组浏览器24上的大维文件，可视化 ChIP-seq 读取密度。
5. 监测MESCs核中H3K27me3病毒的产生和生长情况
- 板 1x 104 mESC 进入 8 孔腔室滑动预涂 0.1% 明胶。
- 第二天，开始执行连续的4-OHT（0.5 mM）感应，以收集表示指定时间点的细胞（0小时、12小时、24小时和36小时）。在 12 小时后更换介质，治疗时间超过 12 小时。
- 在室温 （RT） 下将 4% 的甲醛固定在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，将 mESCs 固定 10 分钟。
- 在RT处用PBS/0.25%Triton X-100渗透细胞30分钟。
- 用PBS/5%驴血清/0.1%Triton X-100（阻塞缓冲液）在RT处阻断细胞30分钟。
- 稀释H3K27me3原抗体1：500在阻塞缓冲液中，并添加到细胞中。
- 在4°C下用原抗体孵育细胞过夜。
- 第二天，使用 PBS/0.1% Triton X-100 进行 3 次处理。
- 稀释二级抗体（Alexa荧光595）1：1000在阻塞缓冲液中，并添加到细胞中。
- 由于与 Alexa Fluor 结合的二级抗体对光敏感，则按照以下步骤在黑暗中执行所有孵育。
- 在RT孵育二次抗体2小时。
- 使用 PBS/0.1% Triton X-100 执行 3 次处理。
- 稀释DAPI （1毫克/升） 1：4000 与PBS/0.1% Triton X-100，并添加到细胞中。
- 在RT用DAPI孵育细胞10分钟。
- 使用 Aqua 安装安装单元格。
- 以 63 倍放大倍率使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。
- 使用 ImageJ 的分布处理和伪彩色图像，斐济25。
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Representative Results
有条件救助制度的一般方案
图1显示了有条件地用WT或笼突变体（Y365A）EED从内源EED位点表达的EED KO细胞的靶向方案。在敲除对稳定性和酶活性至关重要的PRC2核心子单元EED后，引入EED外延9之后的内联磁带（图1）。该盒体由EED的剩余3'cDNA序列组成，与内源性基因序列相反。 盒内由异体倒置的 loxP 位点（lox66 和 lox71）18。细胞传播，直到观察到H3K27me2/3的完全损失。在通过添加 4-OHT 激活 Cre 重组酶表达时，盒带倒置，使外大号 9 使用接头接受器序列拼接到盒中（图 1）。有了这个系统，EED KO细胞现在可以通过WT或笼子突变版本的EED来挽救，这两个版本都有一个C端标志-HA标记。下游 T2A-GFP 为经历成功反转事件的细胞提供了一个标记。聚A信号可防止下游序列转录。有了这个系统，现在就可以跟踪PRC2招募的动力学和H3K27me域的形成。
跟踪PRC2介导H3K27me2/3的时空沉积
为了跟踪PRC2介导染色质域建立的时间动力学，在EED KO细胞的背景中，在EED KO细胞的背景下重新表达WT或笼突变版本EED（图2A，B）。为了跟踪H3K27me2/3标记的沉积，在指定时间点重新表达WT或笼突变EED后，将执行H3K27me2/me3的ChIP-seq。H3K27me3的出现是在WT EED表达式后12小时在称为"成核位点"的离散区域（图2C），然后在距离初始核化位点24小时13点远的区域观察到的。最终，H3K27me3的分布接近WT EED表达后36小时WT父母细胞中的水平。暂时建立的H3K27me3下游站点被称为"传播站点"13。该系统还可以跟踪H3K27me2的时间沉积，这似乎是在H3K27me3沉积之前（图2C，D）。最后，对笼突变EED的重新表达表现出与WT EED不同的动力学（图2C，D）。在这种情况下，H3K27me3的沉积效率很低，相反，H3K27me2变得明显，更集中在成核位点，这表明笼突变EED无法将修改扩散到邻近区域。
H3K27me3的产生及其生长也可以通过显微镜（图2E）13来可视化。在WT EED表达诱导之前，H3K27me3染色不明显。然而，12 h WT EED表达式显示了H3K27me3正组形成的证据。这些正点在数量和大小上增加24小时，并最终扩散到细胞核的较大区域，达到36小时的WT EED表达式。该系统为由ChIP-seq和免疫荧光监测的PRC2介导染色质域的脱致证据（图2C-E）13。
图 1：有条件地用WT或笼式EED（Y365A）进行有条件地拯救EEDKO MESCs。删除外大10和11会导致EED不稳定和退化，H3K27me2/me3的全球损失。外斥9和10之间的内子盒插入相反方向，如所示。加入4-OHT反转盒，使内源性外生9拼接到盒的笼突变或野生型cDNA的盒，允许诱导的WT或笼突变EED的再表达。这个数字已由Oksuz等人修改，2018年13。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：可诱导EED救援系统（i-WT-r和i-MT-r）的验证和代表性应用。（A. i-WT-r 和 i-MT-r 系统在 4-OHT 处理后使用指示抗体对整个提取物进行验证，以在所述时间点诱导 WT （i-WT-r） 或笼突变体 （i-MT-r） EED 的表达。（ B .在i-WT-r 细胞的流式细胞测定分析之前 （0 h） 和后 （36 h） 4-OHT 处理，以确认 T2A-GFP 表达的效率，这表明倒置盒已成功翻转。（C， D.ChIP-seq 跟踪 H3K27me3 （C） 和 H3K27me2 （D） 附近的 Emx1 基因在 WT， 或在 i-WT-r 或 i-MT-r 细胞中， 在指示时间 4-OHT 治疗.指示组蛋白标记沉积的早期和延迟位点。（ E .在i-WT-r mESCs 中抢救 WT EED 表达后，在 0、12、24 和 36 h 处使用 H3K27me3 抗体进行免疫荧光。在 36 小时时显示在较低的曝光度。最右侧的面板是标有红色箭头的单元格的放大图像。这个数字已由Oksuz等人修改，2018年13。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在给定染色质域形成期间，理解机械细节的有力方法是首先破坏该域，然后跟踪其在细胞内正在进行的重建。在重建过程中，可以随时暂停该过程，以详细分析正在进行的事件。以前关于染色质域的研究无法解决在稳定状态条件下执行的事件（例如，比较野生型和基因挖空）。在这里，我们概述了一个系统，以评估染色质域的动态形成，这突出说明了在细胞中招募和传播PRC2介导的压制性域。
这个诱导系统最关键的步骤是DNA结构的精确设计，以在它们各自从细胞中删除后重新表达所需的蛋白质（或RNA）。根据下游应用的不同，这些构造中可以引入各种突变、标记和荧光标记。例如，无需在GFP之前使用自裂T2A肽将其与感兴趣的蛋白质分离，而是可以生成各种荧光融合蛋白，用于高分辨率成像和/或单粒子跟踪实验，监测活细胞中染色质域形成的初始事件。
虽然这种方法可以通过多种方式进行修改，以便深入了解染色质域的形成，但它确实存在一些限制。首先，它需要一个含有Cre-ERT2基因的细胞系。其次，需要优化以确定 4-OHT 处理后的时间点。第三，该系统不可逆，以便监测染色质域解构过程中发生的事件。基于Degron的方法可以作为本文所述方法的替代方法，26，27。这些系统使蛋白质的可逆和快速降解，但通常需要昂贵的分子来破坏蛋白质的不稳定，如辅助剂或屏蔽26，27。此外，这些基于脱粒的方法也有局限性。它们只能在蛋白质降解后重新表达WT版本。相反，本文描述的系统允许除 WT 对应蛋白外，有条件地表达感兴趣的蛋白质的突变版本。将这种脱粒体系统与此处描述的方法相结合，将是可逆调节染色质域形成的有力手段。跟踪染色质域形成的替代方法是使用特定的抑制剂来耗尽染色质中定义的染色质修饰，然后冲洗抑制剂以遵循修饰的再沉积。例如，使用EZH2抑制剂和随后冲洗的处理用于跟踪H3K27me域28的重新形成。然而，EZH2抑制剂在完全消耗H3K27me方面是无效的，即使在治疗后7天。在这种情况下，存在预先存在的H3K27me可能会招募和激活PRC212，从而使结果的解释复杂化。此外，由于许多染色质领域缺乏特定且有效的抑制剂，抑制剂和冲洗策略的使用受到限制。
除了这种方法适用于细胞系统外，它还可用于在动物体内产生诱导突变/标记所需的蛋白质。在某些情况下，在发育过程中，突变蛋白质或插入标签可能是致命的。这种方法绕过了这种致命性，并通过与组织特异性Cre-ERT2小鼠菌株耦合，对蛋白质的突变/标记提供了时间和空间控制。这些类型的实验对于确定突变在特定组织和/或特定发育阶段的影响将非常有价值。重要的是，它允许通过盒内报告器成功重组的细胞进行分离。这有利于生化分析，如从特定组织的亲和纯化，以分离特定蛋白质的组织特异性相互作用。该系统可用于监测任何给定细胞过程的动态变化，因此不限于跟踪染色质域的形成。
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Disclosures
D.R. 是星座制药和富尔克拉姆治疗学的联合创始人。作者声明他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢L.Vales博士、D.Ozata博士和H.Mou博士对手稿的修订。D.R. 实验室由霍华德·休斯医学研究所和国家卫生研究院（R01CA199652和R01NS100897）提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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