Summary
Denne metode er designet til at følge dannelsen af PRC2-mediated kromatin domæner i cellelinjer, og metoden kan tilpasses til mange andre systemer.
Abstract
Organisation og struktur af kromatin domæner er unikke for individuelle celle lineages. Deres fejl regulering kan føre til et tab af cellulær identitet og/eller sygdom. På trods af en enorm indsats, er vores forståelse af dannelsen og udbredelsen af kromatin domæner stadig begrænset. Kromatin domæner er blevet undersøgt under Steady-State betingelser, som ikke er befordrende for at følge de første begivenheder under deres etablering. Her præsenterer vi en metode til inducibly rekonstruere kromatin domæner og følge deres re-formation som en funktion af tid. Selv om, først anvendes på tilfælde af PRC2-medieret undertrykkende kromatin domæne dannelse, det kunne nemt tilpasses andre kromatin domæner. Ændringen af og/eller kombinationen af denne metode med genomforskning og billeddannelsesteknologier vil give uvurderlige værktøjer til at studere etableringen af kromatin domæner i stor detalje. Vi mener, at denne metode vil revolutionere vores forståelse af, hvordan kromatin domæner form og interagere med hinanden.
Introduction
Eukaryotic genomer er meget organiseret og ændringer i kromatin tilgængelighed direkte kontrollerer gen transkriptionen1. Genomet indeholder forskellige typer af kromatin domæner, som korrelerer med transkriptional aktivitet og replikation timing2,3. Disse kromatin domæner spænder i størrelse fra et par kilobaser (KB) til mere end 100 KB og er karakteriseret ved en berigelse i særskilte Histon modifikationer4. De centrale spørgsmål er: hvordan dannes disse domæner, og hvordan spredes de?
En af de mest velkarakteriserede kromatin domæner fremmes gennem aktiviteten af Polycomb repressive kompleks 2 (PRC2). PRC2 er en multi-subunit kompleks bestående af en delmængde af polycomb gruppe (PCG) af proteiner5,6, og katalyserer mono-, di-og trimethylering af lysin 27 af Histon H3 (H3K27me1/ME2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 er forbundet med en undertrykkende kromatin tilstand, men funktionen af H3K27me1 er uklar6,11. En af de centrale komponenter i PRC2, embryonale ectoderm udvikling (Eed), binder til slutproduktet af PRC2 katalyse, H3K27me3, gennem sin aromatiske bur og denne funktion resulterer i allosteriske stimulation af PRC212,13. Den PRC2 enzymatiske aktivitet er afgørende for at bevare cellernes identitet under udviklingen, da det uhensigtsmæssige udtryk for visse udviklingsmæssige gener, der er kontraindiceret for en bestemt slægt, ville være skadeligt5,6 . Derfor, unraveling de mekanismer, som PRC2 fremmer dannelsen af repressive kromatin domæner i pattedyr er af grundlæggende betydning for forståelsen cellulære identitet.
Alle de tidligere eksperimentelle systemer designet til at undersøge kromatin domæne dannelse herunder PRC2-medierede kromatin domæner, blev udført under Steady-State betingelser, som ikke er i stand til at spore de udfolder hændelser af kromatin domæne dannelse i Celler. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at generere en inducerbar cellulære system, der overvåger den indledende rekruttering og formering af kromatin domæner. Specifikt fokuserer vi på at spore dannelsen af PRC2-medierede repressive kromatin domæner, der omfatter H3K27me2/3. Dette system, der kan fange de mekanistiske detaljer af kromatin domæne dannelse, kunne tilpasses til at indarbejde andre kromatin domæner, såsom de bredt undersøgt domæner, der omfatter enten H2AK119ub eller H3K9me. I kombination med genomforskning og billeddannelsesteknologier har denne tilgang potentialet til at kunne håndtere forskellige, centrale spørgsmål i kromatin biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generering af inducerbare EED rednings-Mes'er
1. cellekultur
- Brug feeder-fri C57BL/6 mus embryonale stamceller (Mesc'er) besidder en stabilt integreret CreERT2 transgene, som kan omplacere til kernen ved administration af 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
- Grow mescs i konventionelle ESC medium14,15, suppleret med 1000 U/ml Lif, 1 μM Erk inhibitor PD0325901 og 3 μm GSK3 hæmmer CHIR99021. For konventionelle ESC medium, brug knockout DMEM indeholdende 15% føtal kvægserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penicillin/streptomycin og 0,1 mM 2-mercaptoethanol.
- Brug plader belagt med 0,1% gelatineopløsning til dyrkning af Mesc'er.
2. generering af klon Eed knockout (ko) mesc'er
- Design guide RNAs (gRNAs) til at slette exon 10 og exon 11 af endogen kopi af EED i Mesc'er ved hjælp af CRISPR-designværktøjet i Benchling16. EED-KO-gRNA-1 er rettet mod intron umiddelbart opstrøms for exon 10 og EED-KO-gRNA-2 er rettet mod intron umiddelbart nedstrøms for exon 11. Den samtidige anvendelse af disse gRNAs sletter både exon 10 og exon 11 af ikke-homologous end-slutter (NHEJ).
- Klon gRNAs i pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) ved hjælp af instruktioner i ran et al., 201317.
- I et 6-brønd plade format, transficere 2 x 105 mesc'er med 1 mg af hver Eed-ko-grna-1 og Eed-ko-grna-2 (Se tabel over materialer) ved hjælp af transfektering reagens ved at følge producentens anvisninger. Skift mediet 24 timer efter transfection.
- To dage efter transfection isoleres GFP-positive celler ved hjælp af fluorescens-aktiverede celle sortering (FACER). Forvent, at transfektering effektivitet varierer omkring 10-30%. Sorter omkring 5 x 105 celler til at fange tilstrækkelige gfp positive celler til plating.
- Plade de isolerede GFP positive mESCs i 15 cm plader præ-belagt med 0,1% gelatine (10-20 x103 celler per plade) for koloni plukning.
- Udvid cellerne i ESC-mediet i ca. en uge, indtil enkelt kolonier er synlige. Skift mediet hver 2.
- Vælg mindst 48 kolonier med 20 μL mikropipette spids. Skrabe over kolonien, mens du aspirerer ind i mikropipette spidsen. Du må ikke opdele kolonien i enkeltceller. Kolonien overføres til en accutase-indeholdende (20 mL) 96 brønd plade.
- Kolonierne inkubateres i 10 min ved 37 °C, indtil alle celler er dissocierede.
- Tilsæt 200 mL ESC-medie til hver brønd ved hjælp af multikanalpipette.
- Bland godt og plade cellerne i to separate 96 brønd plader ved hjælp af multikanals pipette.
- Brug en af 96 brønd pladerne til genotypebestemmelse og hold den anden voksende indtil genotypebestemmelse er afsluttet. Brug DNA ekstraktionsopløsning til at udtrække DNA fra 96 brønd pladen ved at følge producentens anvisninger.
- Brug Geno Typing primere Gnt_EED-ko-up og Gnt_EED-KO_down, som spænder over det slettede sted og udfører genotypebestemmelse PCR med Taq DNA Polymerase efter producentens anvisninger.
Bemærk: andre typer af DNA-polymeraser kan også anvendes til genotypebestemmelse, men Taq DNA Polymerase tilbyder bekvemmelighed, da PCR-reaktionen kan indlæses direkte på en gel, når dens farvede reaktionsbuffer anvendes.- Overhold et DNA-produkt med lavere molekylvægt i celler med en homozygot sletning i forhold til Wild-type (WT)-etuiet.
Bemærk: for at generere PRC2 null-celler er homozygot sletning af exons 10 og 11 nødvendig for at destabilisere og forringe EED, en vigtig underenhed af Core PRC213. Den CRISPR målretning effektivitet er omkring 10%.
- Overhold et DNA-produkt med lavere molekylvægt i celler med en homozygot sletning i forhold til Wild-type (WT)-etuiet.
- Validere sletningen af Eed exon 10 og 11 og tabet af Eed protein af sanger sekventering og Western blotting, hhv.
- Bekræfte nedbrydningen af EED og H3K27me2/me3 fra kromatin i EED KO-celler ved hjælp af antistoffer mod H3K27me2/me3 og EED. Brug den protokol, som blev givet i Oksuz et al., 201715 til ChIP-SEQ-eksperimenter.
3. Engineering den EED knockout mESCs til Harbor CRE-ERT2 baseret inducerbar EED udtryk
- Design gRNA (EED-gRNA-inducerbare) at indføre en nedskæring i intron efter exon 9 af EED ved hjælp af CRISPR design Tool i Benchling16 (Se tabel over materialer).
- Klon gRNAs i pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) ved hjælp af instruktioner i ran et al., 201317.
- Design en donor skabelon DNA, der omfatter EED cDNA sekvens efter exon 9 og en C-Terminal flag-HA tag opstrøms for en T2A-GFP sekvens, alle i omvendt retning med hensyn til den endogene gen sekvens.
- Flanke kassetten med en Splice-acceptor og en polyadenylationsekvens, der er indlejret mellem heterologe inverterede loxP-steder (lox66 og lox71)18.
- Medtag mindst 500 BP af homologi arme fra hver ende. Opdel donor skabelonen i 2 segmenter af gBlocks-genfragmenter (Se gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" og gBlock-2-Cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") og saml dem i PCR stump vektor ved hjælp af Gibson kloning efter producentens anvisninger.
Bemærk: gblock-2 indeholder en aromatisk rest (Y365) inden for EED, som er vigtig for interaktion med H3K27me312. gBlock-2-WT indeholder vildtype rester, hvorimod gblock-2-Cage-mutant indeholder bur-mutant af EED (Y365A), som ikke er i stand til at binde sig til H3K27me3. Inducerbar WT EED Rescue er angivet som i-WT-r og inducerbar bur-mutant Eed Rescue er betegnet som i-MT-r for nemheds skyld.
- I en 6-brønd plade format, transficere 2 x 105 mesc'er med 1 mg af grna (Eed-grna-inducerbar) og 1 mg af donor skabeloner (i-WT-r eller i-MT-r) ved hjælp af transfektering reagens og isolere gfp positive celler ved hjælp af FACS.
- Følg trin 2.3-2.11 for at isolere individuelle kolonier, som er klar til genotypebestemmelse for vellykket målretning.
- Brug Geno Typing primere Inducible_Genotype-fw-1 og Inducible_Genotype-Rev-1, som spænder over den indsatte kassette og udfører genotypebestemmelse PCR med Taq-DNA-Polymerase.
Bemærk: målretningen effektivitet for CRISPR er omkring 10%.- Bekræft korrekt integration af kassetten ved PCR ved hjælp af Inducible_Genotype-FW-2 og Inducible_Genotype-Rev-2 primere, som er uden for de homologiske arme.
Bemærk: homozygot integration af kassetten er nødvendig for at opnå effektiv redning af EED. Bemærk, at celler med homozygot integration vil producere et enkelt stort DNA-produkt sammenlignet med WT EED, som vil producere et kort produkt.
- Bekræft korrekt integration af kassetten ved PCR ved hjælp af Inducible_Genotype-FW-2 og Inducible_Genotype-Rev-2 primere, som er uden for de homologiske arme.
- Bekræft integrationen af kassetten ved sanger sekvensering.
- Bekræft flipping af kassetten og udtrykket af EED og andre PRC2 kernekomponenter (f. eks EZH2 og SUZ12) ved 4-OHT administration af Western blotting.
- Bekræft ekspression af T2A-GFP og procent af flip-by-flow cytometri. Bemærk, at udtryk af GFP er tegn på flipping af kassetten og udtrykket af EED.
4. efter nukleation og spredning af PRC2 aktivitet på kromatin
- Bekræft, at i-WT-r og i-MT-r mESCs ikke har utætte udtryk for GFP ved flowcytometri. I tilfælde af utætte ekspression af GFP isoleres GFP-negative celler af FACS, før eksperimentet påbegyndes.
- Udvid i-WT-r og i-MT-r mESCs til 5 15 cm plader (5x 106 celler pr. plade).
- Inducere ekspression af WT eller bur-mutant EED ved administration af 0,5 mM 4-OHT i 0 h, 12 h, 24 h, 36 h og 8 dage (1 15 cm plade pr. tilstand). Skift mediet efter 12 timer for behandlinger, som er længere end 12 h. Isoler de genkombinerede celler ved hjælp af GFP. Juster tidspunktet for behandlingerne, således at alle betingelser er indsamlet på én gang.
- Udfør ChIP-SEQ for H3K27me2, H3K27me3 at undersøge deres tidsmæssige deposition til kromatin som reaktion på genekspression af WT eller bur-mutant EED. Brug ChIP-SEQ-protokollen, herunder forberedelse af bibliotek, detaljeret i Oksuz et al., 201715.
- Brug Spike-in kontrol i hver prøve for at give mulighed for kvantitativ sammenligning mellem forskellige tidspunkter19.
- For Spike-in kontrol, brug kromatin fra Drosophila melanogaster (i et 1:50 forhold til den mesc-afledte kromatin) samt Drosophila specifikke H2Av antistof (1 μl af H2Av antistof pr 4 μg Drosophila kromatin i henhold til fabrikantens anvisninger) i hver prøve.
- Forbered kromatin fra Drosophila på en måde, der ligner den fra mesc'er ved hjælp af protokollen beskrevet i oksuz et al., 201715.
- MAP sekvensen læser for ChIP-SEQ til mm10 genom med Bowtie 2 ved hjælp af standardparametre20.
- Normalisere musen ChIP-SEQ læser til Spike-in Drosophila Læs tæller21. Beregn Spike-in normaliserings faktoren ved hjælp af følgende formel: 1 x 106/Unique Drosophila Læs tæller. Forvent at komme omkring 1 x 106Drosophila Læs tæller og 20 x 106 mus læse tæller per eksperiment.
- Medtag ikke Drosophila kromatin ved sekvensering af input prøverne.
- Brug genomecov værktøj fra bedtools til at konvertere Bam fil i bedgraph22. Dernæst konvertere bedgraph til bigwig fil ved hjælp af bedgraphtobigwig værktøj fra uscs23,24. Se følgende script:
gen = "sti til mm10 Genome"
Chr = "sti til mm10 kromosom størrelser"
inp_bam = "sti til indtastning af Bam-fil"
Multiplicer = "Beregn en normaliseringsfaktor for Spike-in"
bedtools genomecov-BG-skala $multiply-ibam $inp _bam-g $gen > udgang. bedGraph
sort-K1, 1-K2, 2n udgang. bedGraph > output_sorted. bedGraph
bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw - Visualiser ChIP-SEQ-læse tæthederne ved at uploade bigwig-filerne på uscs genom-browseren24.
5. overvågning af fremkomsten og væksten af H3K27me3 Foci i mESCs-kerner
- Plade 1x 104 mesc'er i 8-brøndkammer slides præ-belagt med 0,1% gelatine.
- Næste dag, begynde at udføre sammenhængende 4-OHT (0,5 mM) induktioner at indsamle cellerne udtrykker EED for indikerede tidspunkter (0 h, 12 h, 24 h og 36 h). Skift mediet efter 12 timer for behandlinger, som er længere end 12 timer.
- Mesc'erne fastsættes med 4% PARAFORMALDEHYD i fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter.
- Permeabilize cellerne med PBS/0,25% Triton X-100 ved RT i 30 min.
- Bloker cellerne med PBS/5% Donkey serum/0,1% Triton X-100 (blokerende buffer) ved RT i 30 min.
- Fortynde H3K27me3 primære antistof 1:500 i blokerings bufferen, og læg dem på cellerne.
- Inkuber cellerne med primært antistof natten over ved 4 °C.
- Næste dag, udføre 3 skyller med PBS/0.1% Triton X-100.
- Fortynd sekundært antistof (Alexa fluor 595) 1:1000 i blokerings bufferen og Tilføj på celler.
- Udfør alle inkubationer i mørke i følgende trin, da sekundære antistoffer, der er konjugeret med Alexa fluor, er lysfølsomme.
- Det sekundære antistof inkubates i 2 timer ved RT.
- Udfør 3 skyller med PBS/0,1% Triton X-100.
- DAPI fortyndes (1 mg/mL) 1:4000 med PBS/0,1% Triton X-100 og tilsættes til cellerne.
- Inkubatér cellerne med DAPI i 10 minutter ved RT.
- Monter cellerne med Aqua mount.
- Billede cellerne med Konfokal mikroskopi ved 63X forstørrelse.
- Proces og pseudo-farve billederne ved hjælp af en fordeling af ImageJ, Fiji25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generel ordning for det betingede redningssystem
Figur 1 viser målretnings ordningen for betinget redning af Eed ko-celler med enten WT eller bur-mutant (Y365A) Eed, der udtrykkes fra det endogene Eed locus. Efter at have slået EED, en kerne underenhed af PRC2, der er afgørende for dens stabilitet og enzymatiske aktivitet, indføres en kassette i intron efter exon 9 af EED (figur 1). Kassetten består af den resterende 3 ' cDNA-sekvens af EED i omvendt retning i forhold til den endogene gensekvens. Kassetten er flankeret af heterolog omvendt loxp sites (lox66 og lox71)18. Cellerne overføres, indtil det komplette tab af H3K27me2/3 observeres. Ved aktivering af CRE-rekombinase-udtryk ved tilsætning af 4-OHT inverteres kassetten således, at exon 9 splejres ind i kassetten ved hjælp af Splice acceptor-sekvensen (figur 1). Med dette system, kan EED KO celler nu blive reddet af enten WT eller bur-mutant versioner af EED, som begge har en C-Terminal flag-HA tag. Downstream T2A-GFP giver en markør til at vælge for celler, der gennemgår en vellykket inversion begivenhed. PolyA-signalet forhindrer transkriptionen af downstream-sekvenser. Med dette system, kan kinetikken af PRC2 rekruttering og dannelsen af H3K27me domæner nu følges.
Sporing af den tidsmæssige aflejring af PRC2-medieret H3K27me2/3
For at følge den tidsmæssige dynamik i PRC2-medieret kromatin-domæne etablering genudtrykkes WT eller bur-mutant version af EED i baggrunden af EED KO-celler ved 4-OHT-behandling (figur 2A, B). For at følge depositionen af H3K27me2/3-mærker udføres ChIP-SEQ af H3K27me2/me3 efter genekspression af WT eller burmutant EED for de angivne tidspunkter. Fremkomsten af H3K27me3 observeres ved 12 timer efter WT Eed udtryk i diskrete regioner, der betegnes som "nukleation sites" (figur 2C), og derefter i regioner fjernt fra de oprindelige nukleation sites af 24 h13. Til sidst, fordelingen af H3K27me3 nærmer sig næsten den af de niveauer, der ses i WT forældre celler på 36 h efter WT EED udtryk. De tidsmæssigt etablerede downstream-lokaliteter af H3K27me3 betegnes som "sprednings steder"13. Dette system kan også spore den tidsmæssige deposition af H3K27me2, som synes at gå forud for H3K27me3 deposition (figur 2C, D). Endelig udviser genekspression af bur-mutant EED forskellig dynamik i forhold til WT EED (figur 2C, D). I dette tilfælde er deposition af H3K27me3 meget ineffektiv, og i stedet bliver H3K27me2 tydelig og mere koncentreret på nukleations stederne, hvilket indikerer, at burmutant EED ikke er i stand til at sprede ændringen til naboregioner.
Fremkomsten af H3K27me3 Foci og deres vækst kan også visualiseres ved mikroskopi (figur 2E)13. Før induktion af WT EED udtryk, H3K27me3 farvning er ikke synlig. 12 h af WT EED-udtryk viser imidlertid tegn på H3K27me3 dannelse af Foci. Disse Foci stigning i antal og størrelse af 24 h, og til sidst spredes til store regioner i kernen af 36 h af WT EED udtryk. Dette system giver dokumentation for de Novo dannelsen af PRC2-medierede kromatin domæner som overvåget af ChIP-SEQ og immunofluorescens (figur 2C-E)13.
Figur 1 : Målretnings ordning for betinget redning af Eed ko Mesc'er enten med WT eller bur-MT Eed (Y365A). Sletning af exon 10 og 11 forårsager destabilisering og nedbrydning af EED og globalt tab af H3K27me2/me3. En kassette i intron mellem exon 9 og 10 indsættes i modsat retning som angivet. Tilsætning af 4-OHT inverterer kassetten således, at endogene exon 9 splejser ind i Burre-mutant eller vildtype cDNA i kassetten, hvilket muliggør inducerbart genekspression af WT eller burmutant EED. Dette tal er blevet modificeret fra Oksuz et al., 201813. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Valideringer og repræsentative anvendelser af ikke-fremkaldende Eed Redningssystemer (i-WT-r og i-MT-r). (A). i-WT-r og i-MT-r-systemer valideres af Western blot ved hjælp af indikerede antistoffer på hele ekstrakter efter 4-oht-behandling for at inducere ekspression af WT (i-WT-r) eller bur-mutant (i-MT-r) Eed på det angivne tidspunkt. (B). flow cytometri analyse af gfp i i-WT-r celler før (0 h) og efter (36 h) 4-oht behandling for at bekræfte effektiviteten af ekspression af T2A-gfp, hvilket er tegn på en vellykket flip af inverteret kassette. (C, D). ChIP-SEQ-spor for H3K27me3 (C) og H3K27me2 (D) i nærheden af Emx1 genet i WT, eller i i-WT-r eller i i-MT-r-celler, for de angivne tidspunkter for 4-oht-behandling. Tidlige og forsinkede lokaliteter til deposition af Histon mærkerne er angivet. (E). immunofluorescens ved hjælp af H3K27me3 antistof ved 0, 12, 24 og 36 h efter redning af WT Eed udtryk i i-WT-r mescs. Farvning ved 36 h vises ved lavere eksponeringer. Panelet længst til højre er et zoomet billede af cellen, der er mærket med en rød pil. Dette tal er blevet modificeret fra Oksuz et al., 201813. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kraftfuld tilgang til at forstå de mekaniske detaljer under dannelsen af et givent kromatin domæne, er først at forstyrre domænet og derefter spore sin genopbygning i gang i cellerne. Processen kan afbrydes på ethvert tidspunkt under genopbygningen for at analysere i detaljer de begivenheder, der er i gang. Tidligere undersøgelser af kromatin domæner kunne ikke løse sådanne hændelser, da de blev udført under Steady-State betingelser (f. eks. sammenligne Wild-type og gen knockout). Her skitserer vi et system til at vurdere den dynamiske dannelse af kromatin domæner, som fremhævet af rekruttering og spredning af PRC2-medierede repressive domæner i celler.
Det mest kritiske skridt for dette inducerbare system er den nøjagtige udformning af DNA-konstruktioner til at re-udtrykke de ønskede proteiner (eller RNA) efter deres respektive sletning fra cellerne. Forskellige mutationer, Tags, og fluorescerende markører kunne indføres inden for disse konstruktioner, afhængigt af downstream-applikationer. For eksempel, i stedet for at bruge selv-cleaving T2A peptid umiddelbart før GFP at afbryde det fra det protein af interesse, kan forskellige fluorescerende fusions proteiner genereres for høj opløsning billeddannelse og/eller single-partikel tracking eksperimenter til overvåge de indledende hændelser af kromatin domæne dannelse i levende celler.
Selv om denne metode kan ændres på mange måder at give indsigt i dannelsen af kromatin domæner, det har nogle begrænsninger. For det første kræver det en cellelinje, der huser CRE-ERT2 genet. For det andet er optimeringer nødvendige for at bestemme tidspunkterne efter 4-OHT behandling. For det tredje er dette system ikke reversibelt for at overvåge begivenhederne under dekonstruktion af et kromatin-domæne. Degron-baserede metoder kan anvendes som et alternativ til den metode, der er beskrevet her26,27. Disse systemer muliggør reversibel og hurtig nedbrydning af proteiner, men normalt kræver dyre molekyler for protein destabilisering, såsom auxin eller Shield26,27. Desuden har disse degron-baserede metoder begrænsninger. De kunne kun bruges til at gengive WT-versionen af proteinet igen efter nedbrydningen. I modsætning hertil giver det beskrevne system mulighed for betinget ekspression af den mutante version af det protein, der er af interesse, ud over sin WT-modpart. Kombinere sådan en degron system med den metode, der er beskrevet her, ville være et effektivt middel til reversibelt modulende dannelse af kromatin domæner. En alternativ metode til at følge dannelsen af kromatin domæner indebærer brug af specifikke hæmmere til at nedbryder en defineret kromatin modifikation fra kromatin og derefter udvaskes inhibitor til at følge de Novo deposition af ændringen. For eksempel anvendes behandling med EZH2-hæmmer og efterfølgende udskylning til sporing af gendannelsen af H3K27me domæner28. Men, EZH2 hæmmer er ikke effektiv i fuldstændig nedbrydende H3K27me, selv 7 dage efter behandling. I dette tilfælde kan tilstedeværelsen af allerede eksisterende H3K27me rekruttere og aktivere PRC212, hvilket komplicerer fortolkningen af resultaterne. Samt, brugen af inhibitor og udvaskningen strategi er begrænset på grund af fraværet af specifikke og potente hæmmere for mange kromatin domæner.
Ud over anvendeligheden af denne metode til cellulære systemer, det kan bruges til at generere inducerbare mutationer/tagging på ønskede proteiner i dyr. I nogle tilfælde kan muterer et protein eller indsættelse af et tag være dødbringende under udvikling. Denne metode omgår denne dødelighed og giver en tidsmæssig og rumlig kontrol af mutation/tagging af proteiner ved kobling med vævsspecifikke CRE-ERT2 muse stammer. Disse typer eksperimenter ville være værdifulde til at bestemme virkningen af en mutation i et bestemt væv og/eller på et bestemt udviklingstrin. Vigtigere, det giver mulighed for isolering af celler, der gennemgår en vellykket rekombination via reporter i kassetten. Dette letter biokemiske analyser, såsom affinitets rensning fra bestemte væv, for at isolere det vævsspecifikke interactome for et givet protein. Dette system kunne være gearet til at overvåge dynamiske ændringer i en given cellulære proces, og dermed er ikke begrænset til sporing kromatin domæne dannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.R. er medstifter af konstellation Pharmaceuticals og Fulcrum Therapeutics. Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker DRs. L. Vales, D. Ozata og H. MOU for revision af manuskriptet. D.R. Lab er støttet af Howard Hughes Medical Institute og National Institutes of Health (R01CA199652 og R01NS100897).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
