Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Abstract

De organisatie en structuur van chromatine domeinen zijn uniek voor individuele celkilometer standen. Hun misregulering zou kunnen leiden tot een verlies van cellulaire identiteit en/of ziekte. Ondanks enorme inspanningen is ons begrip van de vorming en voortplanting van chromatine domeinen nog steeds beperkt. Chromatin domeinen zijn bestudeerd onder steady-state omstandigheden, die niet bevorderlijk zijn voor het volgen van de eerste gebeurtenissen tijdens hun oprichting. Hier presenteren we een methode om chromatine-domeinen te reconstrueren en hun re-formatie als functie van de tijd te volgen. Hoewel, eerst toegepast op het geval van PRC2-gemedieerde repressief chromatine domein vorming, het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine domeinen. De wijziging van en/of de combinatie van deze methode met Genomics en beeldvormings technologieën zal waardevolle hulpmiddelen bieden om de oprichting van chromatine domeinen in detail te bestuderen. Wij geloven dat deze methode zal een revolutie in ons begrip van hoe chromatine domeinen vormen en interactie met elkaar.

Introduction

Eukaryotische genomen zijn sterk georganiseerd en veranderingen in de chromatine toegankelijkheid regelt direct Gene transcriptie1. Het genoom bevat verschillende soorten chromatine domeinen, die correleren met transcriptionele activiteit en replicatie timing2,3. Deze chromatine domeinen variëren in grootte van een paar kilo bases (KB) tot meer dan 100 kB en worden gekenmerkt door een verrijking in verschillende Histon-modificaties4. De centrale vragen zijn: hoe worden deze domeinen gevormd en hoe worden ze gepropageerd?

Een van de meest goed gekenmerkte chromatine domeinen wordt bevorderd door de activiteit van de Polycomb repressieve complex 2 (PRC2). PRC2 is een multi-subunit complex bestaande uit een subset van de Polycomb groep (PCG) van eiwitten5,6, en katalyseert de mono-, di-en trimethylation van lysine 27 van Histon H3 (H3K27me1/ME2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 worden geassocieerd met een repressief chromatine staat, maar de functie van H3K27me1 is onduidelijk6,11. Een van de kerncomponenten van PRC2, embryonale Ectoderm ontwikkeling (eed), bindt zich aan het eindproduct van PRC2 katalyse, H3K27me3, door zijn aromatische kooi en deze functie resulteert in de allosterische stimulatie van PRC212,13. De PRC2 enzymatische activiteit is cruciaal voor het behoud van de cellulaire identiteit tijdens de ontwikkeling, omdat de ongepaste expressie van bepaalde ontwikkelings genen die gecontra-indiceerd zijn voor een specifieke afstamming, schadelijk zou zijn op6,5 . Daarom is het ontraveling van de mechanismen waarmee PRC2 de vorming van repressieve chromatine-domeinen in zoogdieren bevordert, van fundamenteel belang om de cellulaire identiteit te begrijpen.

Alle uit het verleden experimentele systemen die zijn ontworpen om de chromatine-domein vorming te onderzoeken, waaronder PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen, werden uitgevoerd onder steady-state omstandigheden, die niet in staat zijn om de ontvouwende gebeurtenissen van chromatine-domein vorming bij te houden in Cellen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om een induceerbaar cellulair systeem te genereren dat de initiële werving en verspreiding van chromatine-domeinen bewaakt. Concreet richten we ons op het volgen van de vorming van PRC2 gemedieerde repressief chromatine domeinen die H3K27me2/3 vormen. Dit systeem dat de mechanistische Details van chromatine domein vorming kan vastleggen, kan worden aangepast om andere chromatine domeinen op te nemen, zoals de breed bestudeerde domeinen bestaande uit H2AK119ub of H3K9me. In combinatie met Genomics-en beeldvormings technologieën heeft deze aanpak het potentieel om diverse, belangrijke vragen in de chromatide biologie succesvol aan te pakken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Generatie van induceerbare cytochromen Rescue mescs

1. celcultuur

  1. Gebruik feeder-Free C57BL/6 Mouse embryonale stamcellen (mESCs) met een stabiel geïntegreerd CreERT2 transgene, dat kan translokaliseren naar de Nucleus bij toediening van 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Groei mescs in conventionele ESC-medium14,15, aangevuld met 1000 U/ml LIF, 1 μm ERK-remmer PD0325901 en 3 μm GSK3 remmer CHIR99021. Gebruik voor conventioneel ESC-medium de afdek DMEM met 15% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1X penicilin/streptomycine en 0,1 mM 2-mercaptoethanol.
  3. Gebruik platen gecoat met 0,1% gelatine oplossing voor het kweken van mESCs.

2. generatie van van klonen eed knock-out (ko) mescs

  1. Ontwerpgids RNAs (gRNAs) om Exon 10 en Exon 11 van de endogene kopie van EED in mESCs te verwijderen met behulp van de CRISPR design tool in Benchling16. EED-KO-gRNA-1 richt zich op de Intron onmiddellijk stroomopwaarts van Exon 10 en EED-KO-gRNA-2 richt zich op de Intron onmiddellijk stroomafwaarts van Exon 11. De gelijktijdige toepassing van deze Grna's verwijdert zowel Exon 10 als Exon 11 door niet-homologeuze eindverbindingen (NHEJ).
  2. Kloon gRNAs in pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) met behulp van instructies in ran et al., 201317.
  3. In een 6-well plaat formaat, transfect 2 x 105 mescs met 1 mg van elke eed-ko-grna-1 en eed-ko-grna-2 (Zie tabel van de materialen) met behulp van transfectie reagens door het volgen van de instructies van de fabrikant. Verander de media 24 h na transfectie.
  4. Twee dagen na de transfectie isoleren GFP-positieve cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Verwacht dat de transfectie-efficiëntie ongeveer 10-30% varieert. Sorteer rond 5 x 105 cellen om voldoende GFP positieve cellen voor het beplating vast te leggen.
  5. Plaat de geïsoleerde GFP positieve mESCs in 15 cm platen voorgecoat met 0,1% gelatine (10-20 X103 cellen per plaat) voor het plukken van de kolonie.
  6. Laat de cellen in het ESC-medium ongeveer een week groeien tot enkele kolonies zichtbaar zijn. Verander de media elke 2 dagen.
  7. Kies minimaal 48 kolonies met een micro pipetpunt van 20 μL. Schrait over de kolonie terwijl hij naar de pipetpunt aspireren. Breek de kolonie niet in enkele cellen. Breng de kolonie over in een accutase-bevattende (20 mL) 96 goed bord.
  8. Inbroed de kolonies gedurende 10 minuten bij 37 °C totdat alle cellen zijn losgekoppeld.
  9. Voeg met behulp van multichannel pipetten 200 mL ESC-media toe aan elke put.
  10. Meng goed en plaat de cellen in twee afzonderlijke 96 goed platen met behulp van meerkanaals pipet.
  11. Gebruik een van de 96-goed-platen voor genotypering en houd de andere groeit tot het genotypering is gesloten. Gebruik DNA-extractieoplossing om DNA uit de 96 goed te halen door de instructies van de fabrikant te volgen.
  12. Gebruik genotypering primers Gnt_EED-ko-up en Gnt_EED-KO_down, die de verwijderde site beslaan en de genotypering PCR met Taq DNA polymerase uitvoeren volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: andere soorten DNA-polymerasen kunnen ook worden gebruikt voor genotypering, maar Taq DNA polymerase biedt gemak omdat de PCR-reactie direct op een gel kan worden geladen wanneer de gekleurde reactiebuffer wordt gebruikt.
    1. Observeer een DNA-product met een lager molecuulgewicht in cellen met een homozygoot deletie ten opzichte van het wild type (WT)-geval.
      Opmerking: om PRC2 null-cellen te genereren, is homozygoot verwijdering van exonen sequentie 10 en 11 noodzakelijk om EED te destabiliseren en te degraderen, een essentiële subeenheid van kern PRC213. De CRISPR-doelmatigheid is ongeveer 10%.
  13. Valideer de verwijdering van EED Exon 10 en 11 en het verlies van EED-eiwitten door Sanger-sequencing en Western blotting, respectievelijk.
  14. Bevestig de depletie van EED en H3K27me2/me3 van chromatine in EED KO-cellen door middel van ChIP-SEQ met antilichamen tegen H3K27me2/me3 en EED. Gebruik het protocol gegeven in Oksuz et al., 201715 voor chip-SEQ-experimenten.

3. Engineering van de eed Knockout-mescs naar de haven van CRE-ERT2 gebaseerde induceerbare cytochromen eed-expressie

  1. Ontwerp gRNA (EED-gRNA-inducible) om een snede te introduceren binnen het intron na Exon 9 van EED met behulp van de CRISPR design tool in Benchling16 (Zie tabel met materialen).
  2. Kloon gRNAs in pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) met behulp van instructies in ran et al., 201317.
  3. Ontwerp een donor sjabloon-DNA dat bestaat uit de EED cDNA-sequentie na Exon 9 en een C-Terminal Flag-HA-tag stroomopwaarts van een T2A-GFP-sequentie, allemaal in omgekeerde richting met betrekking tot de endogene gensequentie.
    1. Flank van de cassette met een Splice-acceptor en een polyadenylatie sequentie genest tussen heterologeuze omgekeerde loxP-sites (lox66 en lox71)18.
    2. Neem ten minste 500 BP van homologie armen van elk uiteinde. Splits de donor sjabloon in 2 segmenten van gBlocks genfragmenten (Zie gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" en gBlock-2-Cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") en Assembleer ze in PCR Blunt vector met behulp van Gibson klonen volgens de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: gblock-2 bevat een aromatisch residu (Y365) in de kooi van EED dat belangrijk is voor interactie met H3K27me312. gBlock-2-WT bevat wild type residu, terwijl gblock-2-Cage-Mutant de kooi-Mutant van EED (Y365A) bevat, die niet in staat is om te binden aan H3K27me3. Induceerbare cytochromen WT eed Rescue wordt aangeduid als i-WT-r en induceerbare cytochromen Cage-Mutant eed Rescue wordt aangeduid als i-MT-r voor gemak.
  4. In een 6-well plaat formaat, transfect 2 x 105 mescs met 1 mg van de grna (eed-grna-inducible) en 1 mg van de donor templates (i-WT-r of i-MT-r) met behulp van transfectie reagens en isoleren GFP positieve cellen met behulp van FACS.
  5. Volg de stappen 2.3-2.11 om individuele kolonies te isoleren die klaar zijn voor genotypering voor succesvolle targeting.
  6. Gebruik genotypering primers Inducible_Genotype-FW-1 en Inducible_Genotype-Rev-1, die de ingevoegde cassette beslaan en de genotypering uitvoeren met behulp van Taq DNA polymerase.
    Opmerking: de targetingefficiëntie voor CRISPR is ongeveer 10%.
    1. Bevestig de juiste integratie van de cassette door PCR met behulp van Inducible_Genotype-FW-2 en Inducible_Genotype-Rev-2 primers, die zich buiten de homologie armen bevinden.
      Opmerking: homozygoot integratie van de cassette is noodzakelijk om een efficiënte redding van EED te realiseren. Merk op dat cellen met homozygoot-integratie een enkel groot DNA-product zullen produceren in vergelijking met WT EED, dat een kort product zal produceren.
  7. Bevestig de integratie van de cassette door Sanger-sequencing.
  8. Bevestig het omdraaien van de cassette en de expressie van EED en andere PRC2 kerncomponenten (bijv. EZH2 en SUZ12) bij 4-OHT administratie door Western blotting.
  9. Bevestig de expressie van T2A-GFP en percentage van flip door flow Cytometry. Merk op dat de uitdrukking van GFP indicatief is voor het omdraaien van de cassette en de uitdrukking van EED.

4. volgende nucleatie en verspreiding van PRC2 activiteit op chromatine

  1. Bevestig dat i-WT-r en i-MT-r-mESCs geen leky-expressie van GFP hebben door Flowcytometrie. In het geval van lekkend expressie van GFP, Isoleer GFP-negatieve cellen door FACS voordat het experiment begint.
  2. Breid de i-WT-r en i-MT-r-mESCs uit in 5 15 cm platen (5x 106 cellen per plaat).
  3. Induceren van de expressie van WT of kooi-Mutant EED door toediening van 0,5 mM 4-OHT voor 0 h, 12 h, 24 h, 36 h en 8 dagen (1 15 cm plaat per aandoening). Wijzig de media na 12 uur voor behandelingen die langer zijn dan 12 uur. Isoleer de cellen die met succes zijn samengevoegd met behulp van GFP. Pas de tijd van de behandelingen zodanig aan dat alle voorwaarden in één keer worden verzameld.
  4. Voer ChIP-SEQ uit voor H3K27me2, H3K27me3 om hun temporele depositie te onderzoeken naar chromatine als reactie op re-expressie van WT of Cage-Mutant EED. Gebruik het ChIP-SEQ-protocol, inclusief bibliotheek voorbereiding, gedetailleerd in Oksuz et al., 201715.
  5. Gebruik een Spike-in-besturingselement in elk monster om kwantitatieve vergelijking tussen verschillende tijdspunten19mogelijk te maken.
    1. Gebruik voor Spike-in-controle chromatine van Drosophila melanogaster (in een verhouding van 1:50 tot het MESC-afgeleide chromatine) evenals Drosophila specifiek H2Av antilichaam (1 μL H2Av antilichaam per 4 μg Drosophila chromatine volgens instructies van de fabrikant) in elk monster.
    2. Bereid de chromatine van Drosophila op een manier die vergelijkbaar is met die van mescs met behulp van het protocol gedetailleerd in Oksuz et al., 201715.
  6. Kaart de sequentie leest voor ChIP-SEQ aan mm10 genoom met bowtie 2 met standaard parameters20.
  7. Normaliseer de muis ChIP-SEQ leest naar Spike-in Drosophila Lees graven21. Bereken de Spike-in normalisatie factor met behulp van de volgende formule: 1 x 106/Unique Drosophila Lees aantallen. Verwacht te krijgen rond 1 x 106Drosophila lezen tellingen en 20 x 106 muis lezen tellingen per experiment.
    1. Neem het Drosophila chromatine niet op bij het sequentiëren van de invoer monsters.
  8. Gebruik het genomecov -gereedschap van bedtools om het BAM-bestand om te zetten in bedgraph22. Converteer vervolgens de bedgraph naar daar-bestand met behulp van de tool bedgraphtobigwig van USCS23,24. Zie het volgende script:
    gen = "pad naar mm10 genoom"
    Chr = "pad naar mm10 chromosoom grootten"
    inp_bam = "pad naar invoer BAM-bestand"
    vermenigvuldigen = "Bereken de Spike-in normalisatie factor"
    bedtools genomecov-BG-schaal $multiply-ibam $inp _bam-g $gen > output. bedGraph
    Sorteer-K1, 1-K2, 2n uitgang. bedGraph > output_sorted. bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw
  9. Visualiseer de chip-SEQ Lees dichtheden door het uploaden van de daar bestanden op de USCS genoom browser24.

5. monitoring van opkomst en groei van de H3K27me3 Foci in de mESCs-kernen

  1. Plaat 1x 104 mescs in 8-well kamer glaasjes voorgecoat met 0,1% gelatine.
  2. Begin volgende dag met het uitvoeren van opeenvolgende 4-OHT (0,5 mM) inducties om de cellen te verzamelen die EED uitdrukken voor aangegeven tijdpunten (0 uur, 12 uur, 24 uur en 36 h). Verander de media na 12 uur voor behandelingen langer dan 12 uur.
  3. Bevestig de mESCs met 4% Paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten.
  4. Permeabiliseer de cellen met PBS/0.25% Triton X-100 bij RT gedurende 30 minuten.
  5. Blokkeer de cellen met PBS/5% Donkey serum/0,1% Triton X-100 (blokkerende buffer) bij RT gedurende 30 minuten.
  6. Verdun H3K27me3 primair antilichaam 1:500 in de blokkerende buffer en voeg toe aan de cellen.
  7. Incuberen de cellen met primair antilichaam 's nachts bij 4 °C.
  8. Voer de volgende dag 3 wast uit met PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Verdun secundair antilichaam (Alexa Fluor 595) 1:1000 in de blokkerende buffer en voeg toe aan cellen.
    1. Voer alle incubaties in het donker uit in de volgende stappen, aangezien secundaire antilichamen die zijn geconjugeerd met Alexa Fluor lichtgevoelig zijn.
  10. Inincuberen van het secundaire antilichaam voor 2 uur bij RT.
  11. Voer 3 wast uit met PBS/0.1% Triton X-100.
  12. Verdun DAPI (1 mg/mL) 1:4000 met PBS/0.1% Triton X-100 en voeg ze toe aan de cellen.
  13. Inincuberen de cellen met DAPI gedurende 10 min bij RT.
  14. Monteer de cellen met Aqua mount.
  15. Beeld de cellen met confocale microscopie bij 63X vergroting.
  16. Proces en pseudo-kleur de afbeeldingen met behulp van een distributie van ImageJ, Fiji25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een algemene regeling van het voorwaardelijke Reddingssysteem
Figuur 1 toont het targetingschema om eed ko-cellen voorwaardelijk te redden met ofwel WT of Cage-Mutant (Y365A) eed dat wordt uitgedrukt uit de endogene eed Locus. Na het kloppen van EED, een kern subeenheid van PRC2 die essentieel is voor zijn stabiliteit en enzymatische activiteit, wordt een cassette in het intron na Exon 9 van EED geïntroduceerd (Figuur 1). De cassette bestaat uit de resterende 3 ' cDNA-sequentie van EED, in omgekeerde richting met betrekking tot de endogene gensequentie.  De cassette wordt geflankeerd door heterologeuze omgekeerde loxP-sites (lox66 en lox71)18. De cellen worden doorgegeven totdat het volledige verlies van H3K27me2/3 wordt waargenomen. Bij activering van CRE of expressie door toevoeging van 4-OHT wordt de cassette zodanig omgekeerd dat Exon 9 in de cassette wordt gesplitst met behulp van de Splice acceptor-sequentie (Figuur 1). Met dit systeem kunnen de EED KO-cellen nu worden gered door een WT-of Cage-Mutant versie van EED die beide een C-Terminal Flag-HA-tag hebben. De downstream T2A-GFP biedt een markering om te selecteren voor cellen die een geslaagde inversie-gebeurtenis ondergaan. Het polyA-signaal voorkomt transcriptie van stroomafwaartse sequenties. Met dit systeem kan nu de kinetiek van PRC2 recruitment en de vorming van H3K27me domeinen gevolgd worden.

Het volgen van de temporele depositie van PRC2-gemedieerde H3K27me2/3
Om de temporele dynamiek van PRC2-gemedieerde chromatine-domeininstelling te volgen, wordt de WT-of kooi-Mutante versie van EED opnieuw uitgedrukt in de achtergrond van EED KO-cellen, na 4-OHT-behandeling (Figuur 2A, B). Om de afzetting van H3K27me2/3-markeringen te volgen, worden de ChIP-SEQ-H3K27me2/-me3 uitgevoerd na re-expressie van WT of kooi-Mutant EED voor de aangegeven tijdpunten. De opkomst van H3K27me3 wordt waargenomen bij 12 h na WT eed expressie in discrete gebieden die worden aangeduid als "nucleatie plaatsen" (Figuur 2C), en vervolgens op gebieden ver van de initiële nucleatie plaatsen door 24 h13. Uiteindelijk, de verdeling van H3K27me3 benadert bijna die van de niveaus gezien in WT ouderlijke cellen op 36 h na WT EED expressie. De tijdelijk gevestigde downstreamsites van H3K27me3 worden "verspreidingsgebieden"13genoemd. Dit systeem kan ook de temporele depositie van H3K27me2 volgen, die lijkt te voorafgaan aan H3K27me3 depositie (Figuur 2C, D). Ten slotte vertoont herexpressie van kooi-Mutant EED verschillende dynamiek ten opzichte van WT EED (Figuur 2C, D). In dit geval is de afzetting van H3K27me3 zeer inefficiënt en in plaats daarvan wordt H3K27me2 zichtbaar en meer geconcentreerd op de nucleatie plaatsen, wat aangeeft dat de kooi-Mutant EED de modificatie niet kan verspreiden naar naburige regio's.

De opkomst van H3K27me3 Foci en hun groei kunnen ook worden gevisualiseerd door microscopie (Figuur 2E)13. Vóór de inductie van WT EED-expressie is H3K27me3 kleuring niet zichtbaar. Echter, 12 h van WT EED expressie toont bewijs van H3K27me3 Foci vorming. Deze Foci toename in aantal en grootte door 24 h, en uiteindelijk verspreid naar grote gebieden van de Nucleus door 36 h van WT EED expressie. Dit systeem geeft bewijs van de de Novo vorming van PRC2-gemedieerde chromatische domeinen, zoals gecontroleerd door middel van chip-SEQ en immunofluorescentie (Figuur 2C-E)13.

Figure 1
Figuur 1 : Targetingschema om eed ko mESCs voorwaardelijk te redden, ofwel met WT of Cage-MT eed (Y365A). Deletie van Exon 10 en 11 veroorzaakt destabilisatie en degradatie van EED en wereldwijd verlies van H3K27me2/me3. Een cassette in het intron tussen Exon 9 en 10 wordt in de omgekeerde richting geplaatst zoals aangegeven. Toevoeging van 4-OHT inverteert de cassette zodanig dat endogene Exon 9 splitst in de kooi-Mutant of wild type cDNA van de cassette waardoor een induceerbaar re-expressie van WT of kooi-Mutant eed. Dit cijfer is gewijzigd van Oksuz et al., 201813. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Validaties en representatieve toepassingen van induceerbare cytochromen eed-reddingssystemen (i-WT-r en i-MT-r). A). i-WT-r-en i-MT-r-systemen worden gevalideerd door Western Blot met behulp van aangegeven antilichamen op hele extracten na 4-OHT-behandeling om de expressie van WT (i-WT-r) of kooi-Mutant (i-MT-r) eed, op het aangegeven tijdstip, te induceren. (B). Flowcytometrie analyse van GFP in i-WT-r cellen vóór (0 h) en na (36 h) 4-OHT behandeling voor het bevestigen van de efficiëntie van de uitdrukking van T2a-GFP, wat indicatief is voor succesvolle Flip van de omgekeerde cassette. (C, D). ChIP-SEQ tracks voor H3K27me3 (C) en H3K27me2 (D) in de buurt van het EMX1 gen in de WT, of in i-WT-r of in i-MT-r cellen, voor de aangegeven tijden van 4-OHT behandeling. Vroege en vertraagde locaties voor de afzetting van de Histon-merken zijn geïndiceerd. E) immunofluorescentie met H3K27me3 antilichaam op 0, 12, 24 en 36 h na redding van WT eed-expressie in i-WT-r-mescs. Kleuring bij 36 h wordt weergegeven bij lagere belichtingen. Het meest rechtse deelvenster is een ingezoomde afbeelding van de cel met een rode pijl. Dit cijfer is gewijzigd van Oksuz et al., 201813. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een krachtige benadering van het begrijpen van de mechanistische details tijdens de vorming van een gegeven chromatine domein, is om eerst het domein te verstoren en vervolgens de wederopbouw in de vooruitgang in cellen volgen. Het proces kan op elk gewenst moment tijdens de reconstructie worden onderbroken om de gebeurtenissen in uitvoering gedetailleerd te analyseren. Eerdere studies over chromatine domeinen waren niet in staat om dergelijke gebeurtenissen op te lossen zoals ze werden uitgevoerd onder steady-state omstandigheden (bijv. het vergelijken van wild-type en genen knock-out). Hier schetsen we een systeem om de dynamische vorming van chromatine-domeinen te beoordelen, zoals benadrukt door de werving en verspreiding van PRC2-gemedieerde repressieve domeinen in cellen.

De meest kritieke stap voor dit induceerbare cytochromen systeem is het nauwkeurige ontwerp van DNA-constructies om de gewenste eiwitten (of RNA) opnieuw uit te drukken na hun respectieve verwijdering uit de cellen. Verschillende mutaties, tags en fluorescerende markers kunnen binnen deze constructies worden geïntroduceerd, afhankelijk van de downstreamtoepassingen. Bijvoorbeeld, in plaats van het gebruik van Self-cleaving T2A peptide onmiddellijk voordat GFP om het te ontkoppelen van het eiwit van belang, verschillende fluorescerende fusie eiwitten kunnen worden gegenereerd voor hoge resolutie beeldvorming en/of één-deeltjes tracking experimenten om monitor de initiële gebeurtenissen van chromatine domein vorming in levende cellen.

Hoewel deze methode op veel manieren kan worden gewijzigd om inzicht te geven in de vorming van chromatine-domeinen, heeft het wel enkele beperkingen. Ten eerste, het vereist een cellijn die het CRE-ERT2 gen herbergt. Ten tweede zijn optimalisaties nodig om de tijdpunten na 4-OHT-behandeling te bepalen. Ten derde is dit systeem niet omkeerbaar om de gebeurtenissen tijdens de deconstructie van een chromatine-domein te monitoren. Degron-gebaseerde methoden kunnen worden gebruikt als een alternatief voor de hier beschreven methode26,27. Deze systemen maken omkeerbare en snelle afbraak van eiwitten mogelijk, maar vereisen meestal dure moleculen voor eiwit destabilisatie, zoals auxine of Shield26,27. Bovendien hebben deze op degron gebaseerde methoden beperkingen. Ze konden alleen worden gebruikt om de WT-versie van het eiwit opnieuw uit te drukken na de degradatie. Het systeem dat hierin wordt beschreven, staat daarentegen toe dat de Mutante versie van het eiwit van belang naast de WT-tegenhanger voorwaardelijke expressie bevat. Het combineren van een dergelijk degron-systeem met de hier beschreven methode zou een krachtig middel zijn om de vorming van chromatine-domeinen omkeerbaar te moduleren. Een alternatieve methode voor het volgen van de vorming van chromatine-domeinen impliceert het gebruik van specifieke remmers om een gedefinieerde chromatische modificatie uit het chromatine af te putten en vervolgens de remmer te gebruiken om de Novo afzetting van de modificatie te volgen. Bijvoorbeeld, behandeling met EZH2 inhibitor en daaropvolgende wegwassende werking wordt gebruikt voor het bijhouden van de re-formatie van H3K27me domeinen28. Echter, EZH2 inhibitor is niet effectief in het volledig afbreken van H3K27me, zelfs 7 dagen na de behandeling. In dit geval kan de aanwezigheid van reeds bestaande H3K27me rekruteren en activeren PRC212, waardoor de interpretatie van de resultaten compliceren. Ook, het gebruik van de remmer en wegwassende werking strategie is beperkt als gevolg van de afwezigheid van specifieke en krachtige remmers voor veel chromatine domeinen.

Naast de toepasselijkheid van deze methode op cellulaire systemen, het kan worden gebruikt voor het genereren van induceerbare cytochromen mutaties/tagging op de gewenste eiwitten in dieren. In sommige gevallen kan het muteren van een eiwit of het invoegen van een tag dodelijk zijn tijdens de ontwikkeling. Deze methode omzeilt deze letaliteit en biedt een temporele en ruimtelijke controle van de mutatie/tagging van eiwitten door koppeling met weefsel specifieke CRE-ERT2 muis stammen. Dit soort experimenten zou waardevol zijn om het effect van een mutatie in een specifiek weefsel en/of in een bepaald stadium van ontwikkeling te bepalen. Belangrijk, het zorgt voor de isolatie van cellen die een succesvolle recombinatie via de melder in de cassette ondergaan. Dit vergemakkelijkt biochemische analyses, zoals affiniteits zuivering van specifieke weefsels, om de Weefselspecifieke interactome voor een bepaald eiwit te isoleren. Dit systeem kan worden afgestemd op dynamische veranderingen in een bepaald cellulaire proces, en daarom is niet beperkt tot het volgen van chromatine domein vorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.R. is mede-oprichter van Constellation Pharmaceuticals en Fulcrum Therapeutics. Auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken drs. L. Vales, D. Ozata en H. MOU voor de revisie van het manuscript. Het D.R. lab wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute en de National Institutes of Health (R01CA199652 en R01NS100897).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Tags

Genetica uitgave 150 PRC2 chromatine domeinen H3K27me2 H3K27me3 epigenetica nucleatie verspreiding inducible/voorwaardelijke redding.
Een methode om <em>de Novo</em> vorming van Chromatin domeinen te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter