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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Une méthode d'étude de novo Formation des Domaines chromatine

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

Cette méthode est conçue pour suivre la formation de domaines de chromatine à médiation PRC2 dans les lignées cellulaires, et la méthode peut être adaptée à de nombreux autres systèmes.

Abstract

L'organisation et la structure des domaines de chromatine sont uniques aux lignées cellulaires individuelles. Leur mauvaise réglementation pourrait entraîner une perte de l'identité cellulaire et/ou de la maladie. Malgré d'énormes efforts, notre compréhension de la formation et de la propagation des domaines de la chromatine est encore limitée. Les domaines de chromatine ont été étudiés dans des conditions d'état stable, qui ne sont pas propices à suivre les événements initiaux pendant leur établissement. Ici, nous présentons une méthode pour reconstruire inducibly les domaines de chromatine et suivre leur reformation en fonction du temps. Bien que, d'abord appliqué au cas de la formation de domaine de chromatine répressive à médiation PRC2, il pourrait être facilement adapté à d'autres domaines de chromatine. La modification et/ou la combinaison de cette méthode avec la génomique et les technologies d'imagerie fournira des outils précieux pour étudier en détail l'établissement des domaines de la chromatine. Nous croyons que cette méthode va révolutionner notre compréhension de la façon dont les domaines de chromatine se forment et interagissent les uns avec les autres.

Introduction

Les génomes eucaryotes sont très organisés et les changements dans l'accessibilité de la chromatine contrôlent directement la transcription des gènes1. Le génome contient des types distincts de domaines de chromatine, qui sont en corrélation avec l'activité transcriptionnelle et le calendrier de réplication2,3. Ces domaines de chromatine varient en taille de quelques kilobases (kb) à plus de 100 kb et sont caractérisés par un enrichissement dans les modifications histone s'agit de distincts4. Les questions centrales sont les suivantes : comment ces domaines sont-ils formés et comment se propagent-ils ?

L'un des domaines de chromatine les plus bien caractérisés est favorisé par l'activité du complexe répressif Polycomb 2 (PRC2). PRC2 est un complexe multi-subunit composé d'un sous-ensemble du Groupe Polycomb (PcG) de protéines5,6, et catalyse le mono-, di- et trimethylation de lysine 27 de l'histone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sont associés à un état de chromatine répressif, mais la fonction de H3K27me1 n'est pas claire6,11. L'un des composants de base de PRC2, le développement embryonnaire ectoderm (EED), se lie au produit final de la catalyse PRC2, H3K27me3, à travers sa cage aromatique et cette caractéristique se traduit par la stimulation allostérique de PRC212,13. L'activité enzymatique PRC2 est cruciale pour préserver l'identité cellulaire pendant le développement car l'expression inappropriée de certains gènes développementaux qui sont contre-indiqués pour une lignée spécifique, serait préjudiciable5,6 . Par conséquent, démêler les mécanismes par lesquels PRC2 favorise la formation de domaines répressifs de chromatine chez les mammifères est d'une importance fondamentale pour comprendre l'identité cellulaire.

Tous les systèmes expérimentaux antérieurs conçus pour étudier la formation de domaine de chromatine, y compris les domaines de chromatine à médiation PRC2, ont été exécutés dans des conditions d'état stable, qui sont incapables de suivre les événements qui se déroulent de la formation de domaine de chromatine dans Cellules. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour générer un système cellulaire inductible qui surveille le recrutement initial et la propagation des domaines de chromatine. Plus précisément, nous nous concentrons sur le suivi de la formation de domaines de chromatine répressive à médiation PRC2 qui comprennent H3K27me2/3. Ce système qui peut capturer les détails mécanistes de la formation de domaine de chromatine, pourrait être adapté pour intégrer d'autres domaines de chromatine, tels que les domaines largement étudiés comprenant soit H2AK119ub ou H3K9me. Combinée à la génomique et aux technologies d'imagerie, cette approche a le potentiel de répondre avec succès à diverses questions clés en biologie de la chromatine.

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Protocol

Génération de MESC de sauvetage EED inductibles

1. Culture cellulaire

  1. Utilisez des cellules souches embryonnaires C57BL/6 sans mangeoire (MESC) possédant un transgène CreERT2 intégré de façon stable, qui peut se transposer au noyau sur l'administration de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Cultivez des MESC dans le milieu ESC conventionnel14,15, complété par 1000 U/mL LIF, 1 inhibiteur ERK PD0325901 et 3 inhibiteur sGSK3 CHIR99021. Pour le milieu ESC conventionnel, utilisez le DMEM knock-out contenant 15 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1X pénicilline/streptomycine et 0,1 mM 2-mercaptoéthanol.
  3. Utilisez des plaques enduites d'une solution de gélatine de 0,1 % pour la culture des MESC.

2. Génération de cils EED knock-out (KO) mESCs

  1. Guide de conception RNAs (gRNAs) pour supprimer Exon 10 et Exon 11 de copie endogène de l'EED dans les MESCs en utilisant l'outil de conception CRISPR dans Benchling16. EED-KO-gRNA-1 cible l'intron immédiatement en amont de l'exon 10 et EED-KO-gRNA-2 cible l'intron immédiatement en aval d'Exon 11. L'application simultanée de ces gRNAs supprime à la fois Exon 10 et Exon 11 par jointure de fin non-homologue (NHEJ).
  2. Clone gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) using instructions in Ran et al., 201317.
  3. Dans un format de plaque de 6 puits, transfect 2 x 105 mESC s'il y a 1 mg de chaque EED-KO-gRNA-1 et EED-KO-gRNA-2 (voir Tableau des matériaux)en utilisant un réactif de transfection en suivant les instructions du fabricant. Changer les médias 24 h après la transfection.
  4. Deux jours après la transfection, isoler les cellules positives GFP à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Attendez-vous à ce que l'efficacité de la transfection varie autour de 10-30 %. Triez environ 5 x 105 cellules pour capturer suffisamment de cellules positives GFP pour le placage.
  5. Déposer les MESC positifs gFP isolés dans des plaques de 15 cm pré-enduites de 0,1 % de gélatine (10-20 x103 cellules par assiette) pour la cueillette des colonies.
  6. Cultivez les cellules dans le milieu ESC pendant environ une semaine jusqu'à ce que les colonies simples soient visibles. Changez les médias tous les 2 jours.
  7. Choisissez un minimum de 48 colonies à l'aide d'une pointe micropipette de 20 l. Gratter la colonie tout en s'envolant dans la pointe de la micropipette. Ne pas briser la colonie en cellules individuelles. Transférer la colonie dans une plaque de puits contenant de l'accutase (20 ml) 96.
  8. Incuber les colonies pendant 10 min à 37 oC jusqu'à ce que toutes les cellules soient dissociées.
  9. Ajouter 200 ml de support ESC dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
  10. Bien mélanger et plaquer les cellules en deux plaques de puits séparées de 96 à l'aide d'une pipette multicanal.
  11. Utilisez l'une des 96 plaques de puits pour le génotypage et gardez l'autre en croissance jusqu'à ce que le génotypage soit conclu. Utilisez la solution d'extraction d'ADN pour extraire l'ADN de la plaque de puits 96 en suivant les instructions du fabricant.
  12. Utilisez les amorces de génotypage Gnt-EED-KO-up et Gnt-EED-KO-down, qui couvrent le site supprimé et effectuent le génotypage PCR avec la polymérase d'ADN Taq suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE: D'autres types de polymères d'ADN peuvent également être utilisés pour le génotypage, cependant, la polymérase d'ADN de Taq offre la convenance car la réaction de PCR peut être directement chargée sur un gel quand son tampon coloré de réaction est employé.
    1. Observez un produit d'ADN de poids moléculaire inférieur dans les cellules avec une suppression homozygote par rapport au cas sauvage-type (WT).
      REMARQUE: Pour générer des cellules nulles PRC2, la suppression homozygote des exons 10 et 11 est nécessaire pour déstabiliser et dégrader EED, une sous-unité essentielle de base PRC213. L'efficacité du ciblage CRISPR est d'environ 10 %.
  13. Valider la suppression de l'exon EED 10 et 11 et la perte de protéines EED par le séquençage Sanger et le ballonnement occidental, respectivement.
  14. Confirmez l'épuisement de l'EED et h3K27me2/me3 de la chromatine dans les cellules EED KO par ChIP-seq en utilisant des anticorps contre H3K27me2/me3 et EED. Utilisez le protocole donné dans Oksuz et al., 201715 pour les expériences ChIP-seq.

3. Ingénierie de l'EED KO mESCs pour héberger Cre-ERT2 base d'expression EED inductible

  1. Concevoir gRNA (EED-gRNA-inducible) pour introduire une coupe dans l'intron suite à l'exon 9 de l'EED à l'aide de l'outil de conception CRISPR dans Benchling16 (voir Tableau des matériaux).
  2. Clone gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) using instructions in Ran et al., 201317.
  3. Concevoir un modèle d'ADN de donneur qui comprend la séquence d'ADNc EED après l'exon 9 et une étiquette C-terminal Flag-HA en amont d'une séquence T2A-GFP, le tout en orientation inverse en ce qui concerne la séquence gène endogène.
    1. Flank la cassette avec un épissage-acceptant et une séquence de polyadenylation niché entre les sites loxP inversés hétérologues (lox66 et lox71)18.
    2. Inclure au moins 500 bp de bras d'homologie de chaque extrémité. Divisez le modèle de donneur en 2 segments de fragments de gènes gBlocks (voir gBlock-1, gBlock-2-WT « https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI » et gBlock-2-cage-mutant « https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM ») et assemblez-les en PcR Blunt vecteur utilisant le clonage Gibson suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: gblock-2 contient un résidu aromatique (Y365) dans la cage de EED qui est important pour l'interaction avec H3K27me312. gBlock-2-Wt contient des résidus de type sauvage, tandis que gblock-2-cage-mutant contient la cage-mutant de EED (Y365A), incapable de se lier à H3K27me3. Le sauvetage inductible de WT EED est désigné comme i-WT-r et le sauvetage inductible d'EED de cage-mutant est désigné comme i-MT-r pour plus de commodité.
  4. Dans un format de plaque de 6 puits, transfect 2 x 105 mESC avec 1 mg de gRNA (EED-gRNA-inducible) et 1 mg des modèles de distributeur (i-WT-r ou i-MT-r) utilisant le réactif de transfection et isolez les cellules positives de GFP utilisant DES FACS.
  5. Suivez les étapes 2.3-2.11 pour isoler les colonies individuelles prêtes à faire du génotypage pour un ciblage réussi.
  6. Utilisez des amorces de génotypage Inducible-Genotype-FW-1 et Inducible-Genotype-REV-1, qui couvrent la cassette insérée et effectuent le génotypage PCR à l'aide de la polymérase d'ADN Taq.
    REMARQUE: L'efficacité de ciblage pour CRISPR est d'environ 10 %.
    1. Confirmer l'intégration correcte de la cassette par PCR à l'aide d'amorces Inducible-Genotype-FW-2 et Inducible-Genotype-REV-2, qui sont en dehors des bras d'homologie.
      REMARQUE : L'intégration homozygous de la cassette est nécessaire pour accomplir le sauvetage efficace de l'EED. Notez que les cellules avec l'intégration homozygote produiront un produit d'ADN unique de grande taille par rapport à WT EED, qui produira un produit court.
  7. Confirmer l'intégration de la cassette par séquençage Sanger.
  8. Confirmer le retournement de la cassette et l'expression de l'EED et d'autres composants de base de PRC2 (p. ex., EZH2 et SUZ12) sur l'administration 4-OHT par le ballonnement occidental.
  9. Confirmer l'expression de T2A-GFP et le pourcentage de flip par cytométrie de flux. Notez que l'expression de GFP est indicative du retournement de la cassette et de l'expression de l'EED.

4. Suite à la nucléation et à la diffusion de l'activité PRC2 sur la chromatine

  1. Confirmez que les mESC i-WT-r et i-MT-r n'ont pas d'expression fuyante de GFP par cytométrie de flux. Dans le cas de l'expression de fuite de GFP, isolez les cellules GFP-négatives par FACS avant de commencer l'expérience.
  2. Étendre les mESC i-WT-r et i-MT-r en cinq plaques de 15 cm (5x 106 cellules par assiette).
  3. Induire l'expression de WT ou cage-mutant EED par administration de 0,5 mM 4-OHT pour 0 h, 12 h, 24 h, 36 h et 8 jours (une plaque de 15 cm par condition). Changer le support après 12 h pour les traitements de plus de 12 h. Isoler les cellules recombinées avec succès par FACS à l'aide de GFP. Ajuster le temps des traitements de sorte que toutes les conditions sont recueillies à la fois.
  4. Effectuer ChIP-seq pour H3K27me2, H3K27me3 pour étudier leur dépôt temporel à la chromatine en réponse à la réexpression de WT ou cage-mutant EED. Utilisez le protocole ChIP-seq, y compris la préparation de la bibliothèque détaillée dans Oksuz et al., 201715.
  5. Utilisez le contrôle de pointe dans chaque échantillon pour permettre une comparaison quantitative entre les différents points de temps19.
    1. Pour le contrôle de pointe, utilisez la chromatine de Drosophila melanogaster (dans un rapport de 1:50 à la chromatine dérivée du MESC) ainsi que l'anticorps H2Av spécifique à Drosophila (1 l d'anticorps H2Av par 4 g de chromatine d'origine drosophila selon instructions du fabricant) dans chaque échantillon.
    2. Préparer la chromatine de Drosophila d'une manière similaire à celle des MESC en utilisant le protocole détaillé dans Oksuz et al., 201715.
  6. Cartographier la séquence se lit pour le génome de ChIP-seq à mm10 avec Bowtie 2 en utilisant les paramètres par défaut20.
  7. Normaliser la souris ChIP-seq lit à pic-in Drosophila lire les comptes21. Calculez le facteur de normalisation à l'aide de la formule suivante : 1 x 106/unique Drosophila lit compte. Attendez-vous à obtenir environ 1 x 106Drosophila compte de lecture et 20 x 106 comptes de lecture de souris par expérience.
    1. N'incluez pas la chromatine Drosophila lors du séquençage des échantillons d'entrée.
  8. Utilisez l'outil genomecov des outils de lit pour convertir le fichier bam en bedgraph22. Ensuite, convertir le bedgraph en fichier bigwig en utilisant bedGraphToBigWig outil de USCS23,24. Voir le script suivant:
    gen-"chemin vers le génome mm10"
    chr '"chemin à mm10 tailles chromosomiques"
    inp'bam"path to input bam file "
    multiplier le « calcul du facteur de normalisation »
    bedtools genomecov -bg -échelle $multiply -ibam $inp-bam -g $gen 'gt; output.bedGraph
    tri -k1,1 -k2,2n output.bedGraph 'gt; output.sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig sortie-sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Visualisez les densités de lecture ChIP-seq en téléchargeant les fichiers bigwig sur le navigateur du génome USCS24.

5. Suivi de l'émergence et de la croissance des foyers H3K27me3 dans les noyaux du MES

  1. Plaque 1x 104 mESC s'engouffré à 8 puits de lachambre pré-enduit e de 0,1% de gélatine.
  2. Le lendemain, commencez à effectuer des inductions consécutives de 4-OHT (0,5 mM) pour recueillir les cellules exprimant l'EED pour les points de temps indiqués (0 h, 12 h, 24 h et 36 h). Changer les médias après 12 h pour les traitements de plus de 12 h.
  3. Fixer les MESC avec 4% de paraformaldéhyde dans la saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante (RT) pendant 10 min.
  4. Perméabilize les cellules avec PBS/0.25% Triton X-100 à RT pendant 30 min.
  5. Bloquer les cellules avec PBS/5% sérum d'âne/0,1% Triton X-100 (tampon de blocage) à RT pendant 30 min.
  6. Diluer l'anticorps primaire H3K27me3 1:500 dans le tampon de blocage et ajouter sur les cellules.
  7. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire pendant la nuit à 4 oC.
  8. Le lendemain, effectuer 3 lavages avec PBS/0,1% Triton X-100.
  9. Diluer l'anticorps secondaire (Alexa fluor 595) 1:1000 dans le tampon de blocage et ajouter sur les cellules.
    1. Effectuez toutes les incubations dans l'obscurité dans les étapes suivantes car les anticorps secondaires conjugués avec Alexa Fluor sont sensibles à la lumière.
  10. Incuber l'anticorps secondaire pendant 2 h à RT.
  11. Effectuer 3 lavages avec PBS/0,1% Triton X-100.
  12. Diluer DAPI (1 mg/mL) 1:4000 avec PBS/0.1% Triton X-100 et ajouter sur les cellules.
  13. Incuber les cellules avec DAPI pendant 10 min à RT.
  14. Montez les cellules avec la monture Aqua.
  15. Imagez les cellules avec une microscopie confocale au grossissement 63X.
  16. Processus et pseudo-couleur des images à l'aide d'une distribution de ImageJ, Fidji25.

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Representative Results

Un régime général du système de sauvetage conditionnel
La figure 1 montre le schéma de ciblage pour sauver conditionnellement les cellules EED KO avec WT ou cage-mutant (Y365A) EED qui est exprimé à partir du locus EED endogène. Après avoir éliminé EED, une sous-unité centrale de PRC2 essentielle à sa stabilité et à son activité enzymatique, une cassette dans l'intron suivant l'exon 9 de l'EED est introduite (Figure 1). La cassette se compose de la séquence cDNA restante de 3' de eED, en orientation inverse en ce qui concerne la séquence gène endogène.  La cassette est flanquée de sites loxP inversés hétérologues (lox66 et lox71)18. Les cellules sont propagées jusqu'à ce que la perte complète de H3K27me2/3 soit observée. Lors de l'activation de l'expression Cre recombinase par l'ajout de 4-OHT, la cassette est inversée de telle sorte que l'exon 9 est épissé dans la cassette à l'aide de la séquence accepteur épissage (Figure 1). Avec ce système, les cellules EED KO peuvent maintenant être sauvées par des versions WT ou cage-mutant de EED qui ont tous deux une étiquette C-terminal Flag-HA. Le T2A-GFP en aval fournit un marqueur à sélectionner pour les cellules qui subissent un événement d'inversion réussie. Le signal polyA empêche la transcription des séquences en aval. Avec ce système, la cinétique du recrutement PRC2 et la formation de domaines H3K27me peuvent maintenant être suivies.

Suivi du dépôt temporel du H3K27me2/3 à médiation PRC2
Pour suivre la dynamique temporelle de l'établissement de domaine de chromatine à médiation PRC2, la version WT ou cage-mutant eED est réexprimée dans le fond des cellules EED KO, sur un traitement 4-OHT (Figure 2A,B). Pour suivre le dépôt des marques H3K27me2/3, ChIP-seq de H3K27me2/me3 sont effectués après la réexpression de WT ou cage-mutant EED pour les points de temps indiqués. L'émergence de H3K27me3 est observée à 12 h après l'expression DeE WT dans des régions discrètes qui sont désignées comme des « sites de nucléation » (figure 2C), puis dans des régions éloignées des sites de nucléation initiaux de 24 h13. Finalement, la distribution de H3K27me3 se rapproche presque de celle des niveaux observés dans les cellules parentales WT à 36 h après l'expression WT EED. Les sites en aval temporellement établis de H3K27me3 sont appelés « sites d'épandage »13. Ce système peut également suivre le dépôt temporel de H3K27me2, qui semble précéder la déposition H3K27me3 (figure 2C,D). Enfin, la réexpression de l'EED en cage-mutante présente une dynamique différente par rapport au WT EED (figure2C,D). Dans ce cas, le dépôt de H3K27me3 est très inefficace et au lieu de cela, H3K27me2 devient apparent et plus concentré sur les sites de nucléation, ce qui indique que la cage-mutant EED est incapable de diffuser la modification dans les régions voisines.

L'émergence des foyers H3K27me3 et leur croissance peuvent également être visualisées par microscopie (Figure 2E)13. Avant l'induction de l'expression WT EED, la coloration H3K27me3 n'est pas apparente. Cependant, 12 h d'expression WT EED montre des preuves de formation de foyers H3K27me3. Ces foyers augmentent en nombre et en taille de 24 h, et finissent par se propager à de grandes régions du noyau de 36 h d'expression WT EED. Ce système témoigne de la formation de novo de domaines de chromatine à médiation PRC2, tel que surveillé par ChIP-seq et immunofluorescence (Figure 2C-E)13.

Figure 1
Figure 1 : Plan de ciblage pour sauver conditionnellement EED KO mESCs soit avec WT ou cage-mt EED (Y365A). La suppression de l'exon 10 et 11 provoque la déstabilisation et la dégradation de l'EED et la perte globale de H3K27me2/me3. Une cassette dans l'intron entre l'exon 9 et le 10 est insérée dans la direction inverse comme indiqué. L'addition de 4-OHT inverse la cassette de telle sorte que l'explion endogène 9 épissures dans le cDNA de type en cage-mutant ou sauvage de la cassette permettant la réexpression inductible de WT ou cage-mutant EED. Ce chiffre a été modifié à partir d'Oksuz et al., 201813. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Validations et applications représentatives des systèmes de sauvetage EED inductibles (i-WT-r et i-MT-r). (A. i-WT-r et i-MT-r systèmes sont validés par Western blot en utilisant des anticorps indiqués sur des extraits entiers après le traitement 4-OHT pour induire l'expression de WT (i-WT-r) ou cage-mutant (i-MT-r) EED, au moment indiqué. (B. Analyse de cytométrie de flux de GFP dans les cellules i-WT-r avant (0 h) et après (36 h) 4-OHT traitement pour confirmer l'efficacité de l'expression de T2A-GFP, qui est indicatif du retournement réussi de la cassette inversée. (C, D). Pistes ChIP-seq pour H3K27me3 (C) et H3K27me2 (D) près du gène Emx1 dans le WT, ou dans i-WT-r ou dans les cellules i-MT-r, pour les temps indiqués du traitement 4-OHT. Des sites précoces et retardés pour le dépôt des marques histones sont indiqués. (E. Immunofluorescence utilisant l'anticorps H3K27me3 à 0, 12, 24 et 36 h après le sauvetage de l'expression WT EED dans les MESC i-WT-r. La coloration à 36 h est indiquée à des expositions plus faibles. Le panneau le plus à droite est une image zoomée de la cellule étiquetée avec une flèche rouge. Ce chiffre a été modifié à partir d'Oksuz et al., 201813. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Une approche puissante pour comprendre les détails mécanistes lors de la formation d'un domaine de chromatine donnée, est d'abord perturber le domaine, puis suivre sa reconstruction en cours au sein des cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pendant la reconstruction pour analyser en détail les événements en cours. Les études antérieures sur les domaines de chromatine n'ont pas été en mesure de résoudre de tels événements car ils ont été effectués dans des conditions d'état stable (par exemple, en comparant le type sauvage et le gène knock-out). Ici, nous dénoncons un système d'évaluation de la formation dynamique des domaines de chromatine, comme en témoigne le recrutement et la diffusion de domaines répressifs médiés par la RPC2 dans les cellules.

L'étape la plus critique pour ce système inductible est la conception précise des constructions d'ADN pour ré-exprimer les protéines désirées (ou ARN) après leur suppression respective des cellules. Diverses mutations, étiquettes et marqueurs fluorescents pourraient être introduits dans ces constructions, selon les applications en aval. Par exemple, au lieu d'utiliser le peptide T2A auto-clivant immédiatement avant GFP pour le déconnecter de la protéine d'intérêt, diverses protéines fluorescentes de fusion pourraient être générées pour l'imagerie à haute résolution et/ou des expériences de suivi à particule unique pour surveiller les premiers événements de formation de domaine de chromatine dans les cellules vivantes.

Bien que cette méthode pourrait être modifiée de plusieurs façons pour fournir un aperçu de la formation des domaines de chromatine, elle a certaines limites. Tout d'abord, il nécessite une lignée cellulaire qui abrite le gène Cre-ERT2. Deuxièmement, des optimisations sont nécessaires pour déterminer les points de temps après le traitement 4-OHT. Troisièmement, ce système n'est pas réversible afin de surveiller les événements lors de la déconstruction d'un domaine de chromatine. Les méthodes basées sur Degron pourraient être utilisées comme alternative à la méthode décrite ici26,27. Ces systèmes permettent une dégradation réversible et rapide des protéines, mais nécessitent généralement des molécules coûteuses pour la déstabilisation des protéines, telles que l'auxine ou le bouclier26,27. En outre, ces méthodes basées sur le degron ont des limites. Ils ne pouvaient être utilisés que pour réexprimer la version WT de la protéine après sa dégradation. En revanche, le système décrit ci-temps permet l'expression conditionnelle de la version mutante de la protéine d'intérêt en plus de son homologue WT. La combinaison d'un tel système de degron avec la méthode décrite ici serait un moyen puissant de moduler de manière réversible la formation des domaines de chromatine. Une méthode alternative pour suivre la formation des domaines de chromatine implique l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques pour épuiser une modification définie de chromatine de la chromatine et puis laver l'inhibiteur pour suivre le dépôt de novo de la modification. Par exemple, le traitement avec l'inhibiteur EZH2 et le lavage subséquent est utilisé pour suivre la reformation des domaines H3K27me28. Cependant, l'inhibiteur d'EZH2 n'est pas efficace en appauvrissant complètement H3K27me, même 7 jours après traitement. Dans ce cas, la présence de H3K27me préexistant pourrait recruter et activer PRC212, compliquant ainsi l'interprétation des résultats. En outre, l'utilisation de l'inhibiteur et de la stratégie de lavage est limitée en raison de l'absence d'inhibiteurs spécifiques et puissants pour de nombreux domaines de chromatine.

En plus de l'applicabilité de cette méthode aux systèmes cellulaires, il peut être utilisé pour générer des mutations inductibles / marquage sur les protéines désirées chez les animaux. Dans certains cas, la mutation d'une protéine ou l'insertion d'une étiquette peuvent être mortelles au cours du développement. Cette méthode contourne cette létalité et fournit un contrôle temporel et spatial de la mutation/marquage des protéines en couplant avec des souches de souris Cre-ERT2 spécifiques aux tissus. Ces types d'expériences seraient utiles pour déterminer l'effet d'une mutation dans un tissu spécifique et/ou à un stade spécifique de développement. Surtout, il permet l'isolement des cellules qui subissent une recombinaison réussie par l'intermédiaire du journaliste dans la cassette. Cela facilite les analyses biochimiques, telles que la purification d'affinité de tissus spécifiques, pour isoler l'interinomome spécifique aux tissus pour une protéine donnée. Ce système pourrait être conçu pour surveiller les changements dynamiques dans n'importe quel processus cellulaire donné, et ne se limite donc pas au suivi de la formation de domaine de chromatine.

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Disclosures

D.R. est co-fondateur de Constellation Pharmaceuticals et Fulcrum Therapeutics. Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts contradictoires.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs L. Vales, D. Ozata et H. Mou pour la révision du manuscrit. Le Laboratoire D.R. est soutenu par le Howard Hughes Medical Institute et les National Institutes of Health (R01CA199652 et R01NS100897).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

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References

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Génétique Numéro 150 PRC2 domaines de chromatine H3K27me2 H3K27me3 épigénétique nucléation propagation sauvetage inductible/conditionnel.
Une méthode d'étude <em>de novo</em> Formation des Domaines chromatine
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Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

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