Summary
Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.
Abstract
Die Organisation und Struktur von Chromatindomänen ist für einzelne Zelllinien einzigartig. Ihre Fehlregulation könnte zu einem Verlust der zellulären Identität und/oder Krankheit führen. Trotz enormer Anstrengungen ist unser Verständnis der Bildung und Verbreitung von Chromatin-Domänen immer noch begrenzt. Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen untersucht, die nicht förderlich für die Verfolgung der ersten Ereignisse während ihrer Einrichtung sind. Hier stellen wir eine Methode vor, um Chromatin-Domänen induduziert und deren Neubildung als Funktion der Zeit zu verfolgen. Obwohl, zuerst auf den Fall der PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänenbildung angewendet, könnte es leicht an andere Chromatin-Domänen angepasst werden. Die Modifikation und/oder Kombination dieser Methode mit Genomik- und Bildgebungstechnologien wird unschätzbare Werkzeuge liefern, um die Etablierung von Chromatin-Domänen im Detail zu untersuchen. Wir glauben, dass diese Methode unser Verständnis davon revolutionieren wird, wie Chromatin-Domänen sich bilden und miteinander interagieren.
Introduction
Eukaryotische Genome sind hoch gradig organisiert und Veränderungen in der Chromatin-Zugänglichkeit steuern direkt die Gentranskription1. Das Genom enthält verschiedene Arten von Chromatin-Domänen, die mit transkriptionaler Aktivität und Replikationtiming2,3korrelieren. Diese Chromatin-Domänen reichen von wenigen Kilobasen (kb) bis zu mehr als 100 kb und zeichnen sich durch eine Bereicherung in unterschiedlichen Histonmodifikationenaus 4. Die zentralen Fragen sind: Wie werden diese Domänen gebildet und wie werden sie propagiert?
Eine der am besten charakterisierten Chromatin-Domänen wird durch die Aktivität des Polycomb-Repressionskomplexes 2 (PRC2) gefördert. PRC2 ist ein Komplex mit mehreren Untereinheiten, der aus einer Teilmenge der Polycomb-Gruppe (PcG) der Proteine5,6besteht und die Mono-, Di- und Trimethylierung von Lysin 27 des Histons H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sind mit einem repressiven Chromatinzustand verbunden, aber die Funktion von H3K27me1 ist unklar6,11. Eine der Kernkomponenten der PRC2, die embryonale Ektodermentwicklung (EED), bindet durch ihren aromatischen Käfig an das Endprodukt der PRC2-Katalyse, H3K27me3, und diese Funktion führt zur allosterischen Stimulation von PRC212,13. Die enzymatische Aktivität der VR China ist entscheidend für die Erhaltung der zellulären Identität während der Entwicklung, da die unangemessene Expression bestimmter Entwicklungsgene, die für eine bestimmte Abstammung kontraindiziert sind, schädlich wäre5,6 . Daher ist die Auflösung der Mechanismen, mit denen PRC2 die Bildung repressiver Chromatindomänen bei Säugetieren fördert, von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der zellulären Identität.
Alle bisherigen experimentellen Systeme zur Untersuchung der Chromatin-Domänenbildung einschließlich PRC2-vermittelter Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, die sich entfaltenden Ereignisse der Chromatin-Domänenbildung in Zellen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung eines induzierbaren Zellsystems vor, das die anfängliche Rekrutierung und Verbreitung von Chromatin-Domains überwacht. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Verfolgung der Bildung von PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänen, die H3K27me2/3 umfassen. Dieses System, das die mechanistischen Details der Chromatin-Domänenbildung erfassen kann, könnte angepasst werden, um andere Chromatin-Domänen zu integrieren, wie die weithin untersuchten Domänen, die entweder H2AK119ub oder H3K9me umfassen. In Kombination mit Genomik- und Bildgebungstechnologien hat dieser Ansatz das Potenzial, verschiedene, zentrale Fragen der Chromatinbiologie erfolgreich anzugehen.
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Protocol
Generierung induzierbarer EED-Rettungs-MESCs
1. Zellkultur
- Verwenden Sie feederfreie C57BL/6-Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs), die ein stabil integriertes CreERT2-Transgen besitzen, das sich bei Verabreichung von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13in den Kern transortieren kann.
- Wachsen Sie mESCs in konventionellen ESC-Medium14,15, ergänzt mit 1000 U/mL LIF, 1 M ERK-Hemmer PD0325901 und 3 M GSK3-Hemmer CHIR99021. Für herkömmliches ESC-Medium verwenden Sie Knockout DMEM mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1X Penicillin/Streptomycin und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol.
- Verwenden Sie Platten, die mit 0,1% Gelatinelösung für die Kultivierung von mESCs beschichtet sind.
2. Erzeugung von klonalen EED Knockout (KO) mESCs
- Entwurfsanleitung RNAs (gRNAs), um Exon 10 und Exon 11 der endogenen Kopie von EED in mESCs mit dem CRISPR-Designtool in Benchling16zu löschen. EED-KO-gRNA-1 zielt unmittelbar vor Exon 10 auf das Intron und EED-KO-gRNA-2 auf das Intron unmittelbar flussabwärts von Exon 11. Die gleichzeitige Anwendung dieser gRNAs löscht sowohl Exon 10 als auch Exon 11 durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ).
- Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 201317.
- In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 105 mESCs mit je 1 mg EED-KO-gRNA-1 und EED-KO-gRNA-2 (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von Transfektionsreagenz, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Ändern Sie das Medium 24 h nach der Transfektion.
- Zwei Tage nach der Transfektion isolieren GfP-positive Zellen mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Erwarten Sie, dass die Transfektionseffizienz um 10-30 % variiert. Sortieren Sie etwa 5 x 105 Zellen, um genügend GFP-positive Zellen für die Beschichtung zu erfassen.
- Die isolierten GFP-positiven mESCs in 15 cm Platten vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine (10-20 x103 Zellen pro Platte) für die Koloniekommissionierung.
- Wachsen Sie die Zellen im ESC-Medium für etwa eine Woche, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.
- Wählen Sie mindestens 48 Kolonien mit 20 L Mikropipette Spitze. Schrott über die Kolonie, während in die Mikropipette Spitze zu aspirating. Zerteilen Sie die Kolonie nicht in einzelne Zellen. Übertragen Sie die Kolonie in eine accutase-haltige (20 ml) 96 Brunnenplatte.
- Inkubieren Sie die Kolonien 10 min bei 37 °C, bis alle Zellen getrennt sind.
- Fügen Sie 200 ml ESC-Medien in jeden Brunnen mit Mehrkanal-Pipette.
- Mischen Sie die Zellen gut und verblechen Sie die Zellen in zwei separate 96 Brunnenplatten mit Mehrkanal-Pipette.
- Verwenden Sie eine der 96 Brunnenplatten für die Genotypisierung und halten Sie die andere wachsen, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist. Verwenden Sie DNA-Extraktionslösung, um DNA aus der 96-Well-Platte zu extrahieren, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
- Verwenden Sie genotypisierende Primer Gnt_EED-KO-up und Gnt_EED-KO_down, die die gelöschte Seite umfassen und die Genotypisierung szieren PCR mit Taq DNA Polymerase nach den Anweisungen des Herstellers durchführen.
HINWEIS: Andere Arten von DNA-Polymerasen können auch für die Genotypisierung verwendet werden, jedoch bietet Taq DNA-Polymerase Komfort, da die PCR-Reaktion direkt auf ein Gel geladen werden kann, wenn sein farbiger Reaktionspuffer verwendet wird.- Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zum Wildtyp-Fall (WT).
ANMERKUNG: Um PRC2-Nullzellen zu erzeugen, ist die homozygote Löschung der Exons 10 und 11 notwendig, um EED zu destabilisieren und zu degradieren, eine wesentliche Untereinheit des Kerns PRC213. Die CRISPR-Zieleffizienz beträgt rund 10 %.
- Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zum Wildtyp-Fall (WT).
- Validieren Sie die Löschung von EED exon 10 und 11 und den Verlust von EED-Protein durch Sanger-Sequenzierung bzw. Western Blotting.
- Bestätigen Sie die Erschöpfung von EED und H3K27me2/me3 aus Chromatin in EED KO-Zellen durch ChIP-seq unter Verwendung von Antikörpern gegen H3K27me2/me3 und EED. Verwenden Sie das Protokoll in Oksuz et al., 201715 für ChIP-seq-Experimente.
3. Entwicklung der EED-Knockout-mESCs für Cre-ERT2-basierte induzierbare EED-Expression
- Entwerfen Sie gRNA (EED-gRNA-inducible), um einen Schnitt innerhalb des intron folgenden Exons 9 von EED mit dem CRISPR-Design-Tool in Benchling16 einzuführen (siehe Tabelle der Materialien).
- Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 201317.
- Entwerfen Sie eine Spender-Vorlagen-DNA, die EED-cDNA-Sequenz nach Exon 9 und ein C-terminales Flag-HA-Tag vor einer T2A-GFP-Sequenz umfasst, alles in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz.
- Flankieren Sie die Kassette mit einem Spleiß-Akzeptor und einer Polyadenylierungssequenz, die zwischen heterologen invertierten LoxP-Standorten (lox66 und lox71) verschachteltist 18.
- Schließen Sie mindestens 500 bp Homologiearme von jedem Ende ein. Teilen Sie die Spendervorlage in 2 Segmente von gBlocks-Genfragmenten auf (siehe gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" und gBlock-2-Käfigmut "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") und montieren Sie sie in PCR Blunt Vektor mit Gibson Klonen nach den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: gblock-2 enthält einen aromatischen Rückstand (Y365) im EED-Käfig, der für die Interaktion mit H3K27me312wichtig ist. gBlock-2-Wt enthält Wildtyprückstände, während gblock-2-cage-mutant die Käfigmutante eED (Y365A) enthält, die nicht an H3K27me3 gebunden werden kann. Induzierbare WT EED Rettung wird als i-WT-r bezeichnet und induzierbare Käfig-mutierte EED-Rettung wird als i-MT-r aus Bequemlichkeit bezeichnet.
- In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 105 mESCs mit 1 mg der gRNA (EED-gRNA-inducible) und 1 mg der Spenderschablonen (i-WT-r oder i-MT-r) mit Transfektionsreagenz und isolieren GFP-positive Zellen mit FACS.
- Befolgen Sie die Schritte 2.3-2.11, um einzelne Kolonien zu isolieren, die für die Genotypisierung bereit sind, um eine erfolgreiche Ausrichtung zu haben.
- Verwenden Sie Genotypisierungsprimer Inducible_Genotype-FW-1 und Inducible_Genotype-REV-1, die die eingelegte Kassette überspannen und genotypisierende PCR mit Taq DNA-Polymerase durchführen.
HINWEIS: Die Targeting-Effizienz für CRISPR beträgt etwa 10 %.- Bestätigen Sie die korrekte Integration der Kassette per PCR mit Inducible_Genotype-FW-2 und Inducible_Genotype-REV-2 Primern, die außerhalb der Homologiearme liegen.
HINWEIS: Die homozygote Integration der Kassette ist notwendig, um eine effiziente Rettung von EED zu erreichen. Beachten Sie, dass Zellen mit homozygoter Integration ein einziges großes DNA-Produkt im Vergleich zu WT EED produzieren, das ein kurzes Produkt produziert.
- Bestätigen Sie die korrekte Integration der Kassette per PCR mit Inducible_Genotype-FW-2 und Inducible_Genotype-REV-2 Primern, die außerhalb der Homologiearme liegen.
- Bestätigen Sie die Integration der Kassette durch Sanger-Sequenzierung.
- Bestätigen Sie das Umblättern der Kassette und den Ausdruck von EED und anderen PRC2-Kernkomponenten (z. B. EZH2 und SUZ12) bei 4-OHT-Verwaltung durch Western Blotting.
- Bestätigen Sie die Expression von T2A-GFP und den Prozentsatz des Flip-by-Flow-Zytometrie. Beachten Sie, dass die Expression von GFP auf das Umdrehen der Kassette und den Ausdruck von EED hindeutet.
4. Nach Keimbildung und Verbreitung der PRC2-Aktivität auf Chromatin
- Bestätigen Sie, dass i-WT-r und i-MT-r mESCs keine undichte Expression von GFP durch Durchflusszytometrie haben. Im Falle einer undichten Expression von GFP, isolieren GFP-negative Zellen durch FACS vor Beginn des Experiments.
- Erweitern Sie die mESCs i-WT-r und i-MT-r in fünf 15 cm Platten (5x 106 Zellen pro Platte).
- Induzieren Sie die Expression von WT oder Käfig-mutierteem EED durch Verabreichung von 0,5 mM 4-OHT für 0 h, 12 h, 24 h, 36 h und 8 Tage (eine 15 cm Platte pro Zustand). Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h. Isolieren Sie die erfolgreich rekombinierten Zellen durch FACS mit GFP. Passen Sie die Zeit der Behandlungen so an, dass alle Bedingungen auf einmal gesammelt werden.
- Führen Sie ChIP-seq für H3K27me2, H3K27me3 durch, um ihre zeitliche Ablagerung an Chromatin als Reaktion auf die Wiederexpression von WT oder Käfig-mutiertem EED zu untersuchen. Verwenden Sie das ChIP-seq-Protokoll einschließlich der Bibliotheksvorbereitung, die in Oksuz et al., 201715beschrieben ist.
- Verwenden Sie die Spike-in-Steuerung in jeder Stichprobe, um einen quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Zeitpunkten19zu ermöglichen.
- Für die Spike-in-Kontrolle verwenden Sie Chromatin von Drosophila melanogaster (im Verhältnis 1:50 zum mESC-abgeleiteten Chromatin) sowie Drosophila-spezifischem H2Av-Antikörper (1 l H2Av-Antikörper pro 4 g Drosophila-Chromatin nach Herstelleranweisungen) in jeder Probe.
- Bereiten Sie das Chromatin von Drosophila ähnlich wie von mESCs mit dem Protokoll in Oksuz et al., 201715.
- Ordnen Sie die Sequenz für ChIP-seq bis mm10 Genom mit Bowtie 2 mit Denisstandardparametern20.
- Normalisieren Sie die Maus ChIP-seq liest zu spike-in Drosophila Lesezählt21. Berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor mit der folgenden Formel: 1 x 106/eindeutige Drosophila-Lesezahlen. Erwarten Sie etwa 1 x 106Drosophila Lesezahlen und 20 x 106 Maus Lesezahlen pro Experiment zu bekommen.
- Fügen Sie das Drosophila-Chromatin bei der Sequenzierung der Eingangsproben nicht ein.
- Verwenden Sie genomecov Werkzeug von Bettwerkzeugen, um Bam-Datei in Bettgraph22zu konvertieren. Als nächstes, konvertieren Sie die bettgraph in bigwig Datei mit bedGraphToBigWig Werkzeug von USCS23,24. Siehe das folgende Skript:
gen="Pfad zum mm10-Genom"
chr="Pfad zu mm10 Chromosomengrößen"
inp_bam="pfad zur Eingabe bam-Datei "
multiply="berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor"
betttools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
sortieren -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw - Visualisieren Sie die ChIP-seq Lesedichten, indem Sie die bigwig-Dateien auf den USCS-Genombrowser24hochladen.
5. Überwachung der Entstehung und des Wachstums der H3K27me3-Schwerpunkte in den mESCs-Kernen
- Platte 1x 104 mESCs in 8-Well-Kammer-Dias vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine.
- Am nächsten Tag beginnen Sie mit der Durchführung aufeinander folgender 4-OHT-Induktionen (0,5 mM), um die Zellen zu sammeln, die EED für angegebene Zeitpunkte (0 h, 12 h, 24 h und 36 h) exemiten. Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h.
- Fixieren Sie die mESCs mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur (RT) für 10 min.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS/0,25% Triton X-100 bei RT für 30 min.
- Blockieren Sie die Zellen mit PBS/5% Eselserum/0,1% Triton X-100 (Sperrpuffer) bei RT für 30 min.
- H3K27me3 Primärantikörper 1:500 im Sperrpuffer verdünnen und den Zellen hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C.
- Führen Sie am nächsten Tag 3 Wässen mit PBS/0,1% Triton X-100 durch.
- Sekundärantikörper (Alexa fluor 595) 1:1000 im Sperrpuffer verdünnen und zellenverstärken.
- Führen Sie alle Inkubationen im Dunkeln in den folgenden Schritten durch, da sekundäre Antikörper, die mit Alexa Fluor konjugiert sind, lichtempfindlich sind.
- Inkubieren Sie den sekundären Antikörper für 2 h bei RT.
- Führen Sie 3 Wässen mit PBS/0.1% Triton X-100 durch.
- DAPI (1 mg/ml) 1:4000 mit PBS/0,1% Triton X-100 verdünnen und zellenverstärken.
- Inkubieren Sie die Zellen mit DAPI für 10 min bei RT.
- Montieren Sie die Zellen mit Aqua-Halterung.
- Stellen Sie die Zellen mit konfokaler Mikroskopie bei 63-facher Vergrößerung ab.
- Verarbeiten und Pseudo-Farbe der Bilder mit einer Verteilung von ImageJ, Fidschi25.
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Representative Results
Ein allgemeines Schema des bedingten Rettungssystems
Abbildung 1 zeigt das Targeting-Schema zur bedingten Rettung von EED-KO-Zellen mit entweder WT- oder Käfigmutant (Y365A) EED, das aus dem endogenen EED-Lokus exprimiert wird. Nach dem Knocking out EED, einer Kernuntereinheit von PRC2, die für ihre Stabilität und enzymatische Aktivität unerlässlich ist, wird eine Kassette innerhalb des intron folgenden Exon s 9 von EED eingeführt (Abbildung 1). Die Kassette besteht aus der restlichen 3' cDNA-Sequenz von EED, in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz. Die Kassette wird von heterologen invertierten LoxP-Standorten (lox66 und lox71)18flankiert. Die Zellen werden vermehrt, bis der vollständige Verlust von H3K27me2/3 beobachtet wird. Bei Aktivierung des Cre-Rekombinatoase-Ausdrucks durch Zugabe von 4-OHT wird die Kassette so invertiert, dass exon 9 mit der Spleißakzeptorsequenz in die Kassette gespleißt wird (Abbildung 1). Mit diesem System können EED KO-Zellen nun entweder durch WT- oder Käfig-mutierte Versionen von EED gerettet werden, die beide ein C-Terminal Flag-HA-Tag haben. Das nachgeschaltete T2A-GFP bietet einen Marker zur Auswahl für Zellen, die einem erfolgreichen Inversionsereignis unterzogen werden. Das PolyA-Signal verhindert die Transkription nachgeschalteter Sequenzen. Mit diesem System kann nun die Kinetik der PRC2-Rekrutierung und die Bildung von H3K27me-Domains verfolgt werden.
Nachverfolgen der zeitlichen Ablagerung von PRC2-vermitteltem H3K27me2/3
Um der zeitlichen Dynamik der PRC2-vermittelten Chromatin-Domäneneinrichtung zu folgen, wird die WT- oder Käfig-mutierte Version von EED im Hintergrund von EED-KO-Zellen nach 4-OHT-Behandlung (Abbildung2A,B) erneut exprimiert. Um der Abscheidung von H3K27me2/3-Markierungen zu folgen, wird ChIP-seq von H3K27me2/me3 nach Wiederexpression von WT oder Käfig-mutiertem EED für die angegebenen Zeitpunkte durchgeführt. Die Entstehung von H3K27me3 wird bei 12 h nach der WT EED-Expression in diskreten Regionen beobachtet, die als "Kernstellen" bezeichnet werden (Abbildung 2C), und dann in Regionen, die von den ursprünglichen Keimbildungsstellen entfernt sind, um 24 h13. Schließlich entspricht die Verteilung von H3K27me3 fast der der Werte, die in WT-Elternzellen bei 36 h nach WT EED-Expression beobachtet wurden. Die zeitlich etablierten nachgelagerten Standorte von H3K27me3 werden als "Verbreitungsstellen"13bezeichnet. Dieses System kann auch die zeitliche Ablagerung von H3K27me2 verfolgen, die h3K27me3-Deposition voranzulesen scheint (Abbildung 2C,D). Schließlich weist die Wiederexpression von Käfig-mutiertem EED eine unterschiedliche Dynamik im Vergleich zu WT EED auf (Abbildung 2C,D). In diesem Fall ist die Ablagerung von H3K27me3 sehr ineffizient und stattdessen wird H3K27me2 an den Keimstellen sichtbar und konzentrierter, was darauf hindeutet, dass der Käfig-mutierte EED nicht in der Lage ist, die Modifikation auf benachbarte Regionen zu verteilen.
Die Entstehung von H3K27me3-Brennpunkten und deren Wachstum können auch durch Mikroskopie visualisiert werden (Abbildung 2E)13. Vor der Induktion der WT EED-Expression ist die H3K27me3 Färbung nicht erkennbar. Jedoch, 12 h der WT EED-Expression zeigt Beweise für H3K27me3 Foci Bildung. Diese Brennpunkte erhöhen die Anzahl und Größe um 24 h und breiten sich schließlich um 36 h des WT-EED-Ausdrucks auf große Regionen des Kerns aus. Dieses System belegt die De-novo-Bildung von PRC2-vermittelten Chromatin-Domänen, die von ChIP-seq und Immunfluoreszenz überwacht werden (Abbildung 2C-E)13.
Abbildung 1 : Targeting-Schema zur bedingten Rettung von EED KO mESCs entweder mit WT oder Cage-mt EED (Y365A). Die Löschung von Exon 10 und 11 führt zu Destabilisierung und Verschlechterung von EED und globalem Verlust von H3K27me2/me3. Eine Kassette im Intron zwischen exon 9 und 10 wird wie angegeben in umgekehrter Richtung eingelegt. Durch Zugabe von 4-OHT wird die Kassette so invertiert, dass endogene Exon-9-Spleiße in die Käfig-Mutant- oder Wildtyp-cDNA der Kassette spleißen, was eine induzierbare Reexpression von WT oder Käfig-mutiertem EED ermöglicht. Diese Zahl wurde geändert von Oksuz et al., 201813. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Validierungen und repräsentative Anwendungen von induzierbaren EED-Rettungssystemen (i-WT-r und i-MT-r). (A). i-WT-r und i-MT-r Systeme werden durch Western Blot mit indizierten Antikörpern an ganzen Extrakten nach 4-OHT-Behandlung validiert, um die Expression von WT (i-WT-r) oder Käfig-mutiertem (i-MT-r) EED zum angegebenen Zeitpunkt zu induzieren. (B). Durchflusszytometrieanalyse von GFP in i-WT-r-Zellen vor (0 h) und nach (36 h) 4-OHT-Behandlung zur Bestätigung der Wirksamkeit der Expression von T2A-GFP, was auf ein erfolgreiches Umdrehen der invertierten Kassette hindeutet. (C, D). ChIP-seq Tracks für H3K27me3 (C) und H3K27me2 (D) in der Nähe des Emx1-Gens im WT, oder in i-WT-r oder in i-MT-r-Zellen, für die angegebenen Zeiten der 4-OHT-Behandlung. Frühe und verzögerte Stellen für die Ablagerung der Histonmarkierungen werden angezeigt. (E). Immunfluoreszenz mit H3K27me3 Antikörper bei 0, 12, 24 und 36 h nach Rettung der WT EED-Expression in i-WT-r mESCs. Färbung bei 36 h wird bei niedrigeren Expositionen gezeigt. Das rechte Bedienfeld ist ein vergrößertes Bild der Zelle, die mit einem roten Pfeil beschriftet ist. Diese Zahl wurde geändert von Oksuz et al., 201813. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein kraftvoller Ansatz, um die mechanistischen Details während der Bildung einer bestimmten Chromatin-Domäne zu verstehen, besteht darin, zuerst die Domäne zu stören und dann ihre Rekonstruktion in den Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit während der Rekonstruktion angehalten werden, um die laufenden Ereignisse im Detail zu analysieren. Frühere Studien an Chromatin-Domänen waren nicht in der Lage, solche Ereignisse zu lösen, wie sie unter stationären Bedingungen durchgeführt wurden (z. B. Vergleich von Wildtyp und Gen-Knockout). Hier skizzieren wir ein System zur Bewertung der dynamischen Bildung von Chromatin-Domänen, wie die Rekrutierung und Verbreitung von PRC2-vermittelten repressiven Domänen in Zellen zeigt.
Der wichtigste Schritt für dieses induzierbare System ist die genaue Konstruktion von DNA-Konstrukten, um die gewünschten Proteine (oder RNA) nach ihrer jeweiligen Löschung aus den Zellen wieder auszudrücken. Je nach nachfolgenden Anwendungen könnten in diesen Konstrukten verschiedene Mutationen, Tags und fluoreszierende Marker eingeführt werden. Anstatt beispielsweise selbstverklemmendes T2A-Peptid unmittelbar vor GFP zu verwenden, um es vom Protein von Interesse zu trennen, könnten verschiedene fluoreszierende Fusionsproteine für hochauflösende Bildgebungs- und/oder Single-Partikel-Tracking-Experimente erzeugt werden, um die ersten Ereignisse der Chromatin-Domänenbildung in lebenden Zellen zu überwachen.
Obwohl diese Methode in vielerlei Hinsicht geändert werden könnte, um Einblicke in die Bildung von Chromatindomänen zu geben, hat sie einige Einschränkungen. Zunächst erfordert es eine Zelllinie, die das Cre-ERT2-Gen beherbergt. Zweitens sind Optimierungen notwendig, um die Zeitpunkte nach der 4-OHT-Behandlung zu bestimmen. Drittens ist dieses System nicht umkehrbar, um die Ereignisse während des Dekonstruktions einer Chromatindomäne zu überwachen. Degron-basierte Methoden könnten als Alternative zu derhier beschriebenen Methode 26,27verwendet werden. Diese Systeme ermöglichen einen reversiblen und schnellen Abbau von Proteinen, erfordern aber in der Regel kostspielige Moleküle für die Proteindestabilisierung, wie Auxin oder Schild26,27. Darüber hinaus haben diese degronbasierten Methoden Einschränkungen. Sie konnten nur verwendet werden, um die WT-Version des Proteins nach dessen Abbau wieder auszudrücken. Im Gegensatz dazu erlaubt das hier beschriebene System zusätzlich zu seinem WT-Pendant eine bedingte Expression der mutierten Version des Proteins von Interesse. Die Kombination eines solchen Degronsystems mit der hier beschriebenen Methode wäre ein leistungsfähiges Mittel, um die Bildung von Chromatin-Domänen reversibel zu modulieren. Eine alternative Methode zur Verfolgung der Bildung von Chromatin-Domänen beinhaltet die Verwendung spezifischer Inhibitoren, um eine definierte Chromatin-Modifikation aus dem Chromatin zu erschöpfen und dann den Inhibitor auszuwaschen, um der de novo-Deposition der Modifikation zu folgen. Zum Beispiel wird die Behandlung mit EZH2-Hemmer und das anschließende Auswaschen verwendet, um die Neubildung der H3K27me-Domänen28zu verfolgen. Jedoch, EZH2-Hemmer ist nicht wirksam bei vollständiger Erschöpfung H3K27me, auch 7 Tage nach der Behandlung. In diesem Fall könnte das Vorhandensein von bereits bestehenden H3K27me PRC212rekrutieren und aktivieren, wodurch die Interpretation der Ergebnisse erschwert wird. Auch, die Verwendung der Inhibitor und Auswaschung Strategie ist begrenzt aufgrund des Fehlens von spezifischen und potenten Inhibitoren für viele Chromatin-Domänen.
Zusätzlich zur Anwendbarkeit dieser Methode auf zelluläre Systeme kann sie verwendet werden, um induzierbare Mutationen/Tagging auf gewünschten Proteinen bei Tieren zu erzeugen. In einigen Fällen kann das Mutieren eines Proteins oder das Einfügen eines Tags während der Entwicklung tödlich sein. Diese Methode umgeht diese Letalität und ermöglicht eine zeitliche und räumliche Kontrolle der Mutation/Tagging von Proteinen durch Kopplung mit gewebespezifischen Cre-ERT2-Mausstämmen. Diese Arten von Experimenten wären wertvoll, um die Wirkung einer Mutation in einem bestimmten Gewebe und/oder in einem bestimmten Entwicklungsstadium zu bestimmen. Wichtig ist, dass es die Isolierung von Zellen ermöglicht, die über den Reporter innerhalb der Kassette erfolgreich rekombiniert werden. Dies erleichtert biochemische Analysen, wie die Affinitätsreinigung aus bestimmten Geweben, um das gewebespezifische Interom für ein bestimmtes Protein zu isolieren. Dieses System könnte darauf ausgerichtet sein, dynamische Veränderungen in einem bestimmten zellulären Prozess zu überwachen, und ist daher nicht auf die Verfolgung der Bildung von Chromatin-Domänen beschränkt.
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Disclosures
D.R. ist Mitbegründer von Constellation Pharmaceuticals und Fulcrum Therapeutics. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Drs. L. Vales, D. Ozata und H. Mou für die Überarbeitung des Manuskripts. Das D.R. Lab wird vom Howard Hughes Medical Institute und den National Institutes of Health (R01CA199652 und R01NS100897) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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