Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

Abstract

הארגון והמבנה של תחומי כרומטין הם ייחודיים לתאי תאים נפרדים. הטעות שלהם עלולה לגרום לאובדן זהות תאית ו/או מחלה. למרות מאמצים עצומים, ההבנה שלנו על היווצרות והתפשטות של תחומים כרומטין עדיין מוגבלת. תחומים כרומטין נחקרו בתנאים יציבים, אשר אינם מסייעות לעקוב אחר האירועים הראשוניים במהלך הקמתה. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש תחומים כרומטין לשחזר ולעקוב אחר היווצרות שלהם כפונקציה של זמן. למרות, לראשונה מיושם על המקרה של PRC2-תיווך כרומטין היווצרות התחום, זה יכול להיות מותאם בקלות לתחומים אחרים כרומטין. שינוי ו/או שילוב של שיטה זו עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה יספק כלים יקרי ערך ללמוד את הקמתה של תחומים כרומטין בפירוט רב. אנו מאמינים ששיטה זו מהפכה את ההבנה שלנו לגבי אופן הפעולה של תחומים כרומטין ואינטראקציה זה עם זה.

Introduction

הגנום eukaryotic הם מאורגנים מאוד ושינויים בנגישות כרומטין ישירות שולטת בתמלול גנים1. הגנום מכיל סוגים שונים של תחומים כרומטין, אשר מתאם עם הפעילות הטרנססקריפט ושכפול עיתוי2,3. תחומים אלה כרומותין טווח בגודל של קילוסים מספר (kb) ליותר מ 100 kb והם מאופיינים על ידי העשרה שינויים ברורים ההיסטון4. השאלות המרכזיות הן: כיצד נוצרים תחומים אלה וכיצד הם מופצים?

אחד מתחומי כרומטין המאופיינת ביותר הוא מאומץ באמצעות הפעילות של קומפלקס הדיכוי הרב פוליקומב 2 (PRC2). PRC2 הוא קומפלקס רב ממדי subunit המורכב מקבוצת משנה של קבוצת פולימסרק (pcg) של חלבונים5,6, ו לזרז את מונו-, di-ו טריתילציה של ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 משויכים למצב כרומטין דכאני, אך תפקידה של H3K27me1 אינו ברור6,11. אחד המרכיבים המרכזיים של PRC2, פיתוח אאקטודרם עובריים (שלוש), נקשר למוצר הסופי של PRC2 זרז, H3K27me3, דרך הכלוב הארומטי שלה ותכונה זו מביא לגירוי אלוסטריה של PRC212,13. הפעילות הPRC2 אנזימטית חיונית לשימור הזהות התאית במהלך הפיתוח כביטוי בלתי הולם של גנים מסוימים התפתחותיים, כי הם התווית עבור שושלת מסוימת, יהיה מזיק5,6 . לפיכך, להתיר את המנגנונים שבהם PRC2 מטפחת היווצרות של תחומים כרומטין דכאניים ביונקים היא בעלת חשיבות יסודית להבנת הזהות התאית.

כל המערכות הנסיוניות האחרונות שתוכננו לחקור היווצרות דומיין כרומטין כולל תחומים PRC2-תיווך כרומטין, בוצעו בתנאים יציבים, אשר אינם יכולים לעקוב אחר אירועי התפתחות של היווצרות תחום של כרומטין ב תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מערכת סלולרית inducible העוקבת אחר גיוס והפצה ראשונית של תחומים כרומטין. באופן ספציפי, אנו מתמקדים מעקב אחר היווצרות של תחומים כרומטין PRC2 מתווכת המהווים H3K27me2/3. מערכת זו שיכולה ללכוד את הפרטים המכניים של היווצרות דומיין כרומטין, יכול להיות מותאם לשלב תחומים כרומטין אחרים, כגון תחומים למדו נרחב הכוללת או H2AK119ub או H3K9me. בשילוב עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה, לגישה זו יש את הפוטנציאל לטפל בהצלחה בשאלות מרכזיות שונות בביולוגיה כרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דור של inducible הצלה mESCs

1. תרבית תאים

  1. השתמש ללא מאכיל C57BL/6 בתאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) בעל משולב באופן בלתי נשכח CreERT2 טרנזגנטי, אשר ניתן לאתר את הגרעין על הממשל של 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4-OHT)13.
  2. לגדול mESCs ב-בינונית ESC קונבנציונאלי14,15, בתוספת עם 1000 U/mL בחיי, 1 μm טיפשה מעכב PD0325901 ו 3 μm GSK3 מעכב CHIR99021. עבור מדיום הרגיל ESC, השתמש בנוק-אאוט המכיל 15% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ו 0.1 mM 2-mercaptoethanol.
  3. להשתמש לוחות מצופה עם 0.1% הג פתרון עבור culturing mESCs.

2. הדור של נוקאאוט שבטים (KO) mESCs

  1. מדריך עיצוב RNAs (gRNAs) כדי למחוק Exon 10 ו Exon 11 של עותק אנדוגני של mESCs באמצעות כלי העיצוב CRISPR בספסל16. הרובוט-ko-grna-1 מטרות אינטרון מיד הזרם של אקסון 10 ו--KO-grna-2 מטרות אינטרון מיד במורד הזרם אקסון 11. היישום הסימולטני של gRNAs האלה מוחק הן Exon 10 ו-Exon 11 על ידי הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ).
  2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.
  3. בפורמט 6-היטב, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של כל ד. ל. Ko-grna-1 ו-שולחן ה-Ko-grna-2 (ראה טבלה של חומרים) באמצעות הזיהום מגיב על ידי ביצוע הוראות היצרן. שינוי התקשורת 24 שעות לאחר הזיהום.
  4. יומיים לאחר ההעברה, לבודד את התאים החיוביים GFP באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS). צפו ליעילות השינוי בסביבות 10-30%. למיין סביב 5 x 105 תאים כדי ללכוד מספיק תאים gfp חיוביים לציפוי.
  5. צלחת מבודדת GFP חיובי mESCs לתוך 15 ס מ מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין (10-20 x103 תאים לכל צלחת) עבור קטיף המושבה.
  6. הגדל את התאים באמצעי ESC במשך שבוע עד שמושבות בודדות יהיו גלויות. . להחליף את התקשורת כל יומיים
  7. בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות 20 μL מיקרופיפטה טיפ. מגרדים את המושבה בזמן. שאתה מוריד את המיקרופיפטה אל תשבור את המושבה. לתאים בודדים להעביר את המושבה לתוך המאהאז (20 mL) 96 צלחת היטב.
  8. מודקון את המושבות במשך 10 דקות ב 37 ° c עד כל התאים מנוכה.
  9. הוסף 200 mL של מדיית ESC לתוך כל טוב באמצעות הצינורות רב-ערוצי.
  10. מערבבים היטב את התאים לתוך שני 96 בנפרד לוחות היטב באמצעות צינורות רב-ערוצי.
  11. השתמש באחד הצלחות 96 היטב עבור הגנוקלדה ולשמור על השני גדל עד המסקנה הגנוזה. השתמש בפתרון החילוץ DNA כדי לחלץ דנ א מ 96 צלחת הבאר על ידי ביצוע הוראות היצרן.
  12. השתמש ב-גנוהקלדה התחל Gnt_EED-KO-up ו -Gnt_EED-KO_down, אשר לאורך האתר נמחק ולבצע את ה-PCR הגנוזה עם taq DNA פולימראז בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: סוגים אחרים של השימוש בדנ א יכול לשמש גם עבור הגנוטיפים, עם זאת, Taq DNA פולימראז מציע נוחות כמו תגובת ה-PCR יכול ישירות להיות טעון על ג'ל כאשר מאגר התגובה שלה בצבע משמש.
    1. צפו במוצר ה-DNA של משקל מולקולרי נמוך בתאים עם מחיקה homozygous יחסית למקרה פראי (WT).
      הערה: כדי ליצור תאים PRC2 null, homozygous מחיקה של exons 10 ו -11 היא הכרחית לערער ולבזות, יחידת משנה חיונית של ליבה PRC213. היעילות של המטרה היא. כ -10%
  13. לאמת את מחיקת ה-בסיס 10 ו -11 ואובדן של חלבון ה-, באמצעות רצפי הרצף של סאנגר והמערב המערבי, בהתאמה.
  14. לאשר את דלדול של ה-H3K27me2/me3 מ כרומטין בתאי ה-, באמצעות שבב-seq באמצעות נוגדנים נגד H3K27me2/me3 ו-. השתמש בפרוטוקול שניתן ב Oksuz et al., 201715 עבור ניסויי שבב-seq.

3. הנדסת mESCs לנמל הרבור הERT2 המבוסס על מinducible

  1. עיצוב grna (-inducible) כדי להציג חתך בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של באמצעות באמצעות כלי העיצוב crispr בספסל16 (ראה טבלת חומרים).
  2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.
  3. עיצוב ה-DNA תבנית התורם הכוללת רצף של ה-dna לאחר אקסון 9 ו-C-טרמינל דגל-HA תג במעלה של רצף T2A-gfp, הכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגן אנדוסוגני.
    1. האגף את הקלטת עם אחוי-מסדר ורצף פוליאדלציה מקונן בין הטרוולוגי לאתרים loxP הפוכה (lox66 ו lox71)18.
    2. כלול לפחות 500 bp של זרועות הומולוגיה מכל קצה. פצל את תבנית התורם לתוך 2 מקטעים של שברי גנים gBlocks (ראה בלוק-1, Gblocks-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ו-Gblocks-2-כלוב-מוטציה "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") ולהרכיב אותם לתוך וקטור בוטה באמצעות גיבסון שיבוט בעקבות הוראות היצרן.
      הערה: gblock-2 מכיל שאריות ארומטיים (Y365) בתוך כלוב המידע החשוב לאינטראקציה עם H3K27me312. gBlock-2-Wt מכיל שאריות סוג פראי, ואילו gblock-2-כלוב-מוטציה מכיל את כלוב-המוטציה של (Y365A), לא מסוגל לחייב את H3K27me3. ההצלה Inducible WT הצלה מסומן כמו i-WT-r ו Inducible כלוב-מוטציה הצלה ההצלה מסומן כמו i-MT-r לנוחות.
  4. בתבנית 6-הבאר, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של grna (אני-grna-inducible) ו 1 מ"ג של תבניות התורם (i-WT-r או i-MT-r) באמצעות מגיב לבידוד ובידוד בתאי gfp חיוביים באמצעות facs.
  5. בצע את השלבים 2.3-2.11 כדי לבודד מושבות בודדות מוכן עבור מיקוד מוצלח.
  6. השתמש הקלדה התחל Inducible_Genotype-FW -1 ו -Inducible_Genotype-REV-1, אשר לאורך הקלטת שנוספה ולבצע PCR הקלדה באמצעות taq DNA פולימראז.
    הערה: יעילות המיקוד עבור CRISPR היא בסביבות 10%.
    1. אשר שילוב נכון של הקלטת על-ידי ה-PCR באמצעות Inducible_Genotype-FW-2 ו -Inducible_Genotype-REV-2 התחל, אשר נמצאים מחוץ לזרועות הומולוגיה.
      הערה: שילוב Homozygous של הקלטת הוא הכרחי כדי לבצע הצלה יעילה של הצוות. שים לב כי תאים עם אינטגרציה homozygous יפיק מוצר אחד גדול DNA בהשוואה ל-WT, אשר יפיק מוצר קצר.
  7. אשר את השילוב של הקלטת על-ידי רצף של סנגר.
  8. לאשר היפוך של הקלטת ואת הביטוי של PRC2 ורכיבי ליבה אחרים (למשל, EZH2 ו SUZ12) על ממשל 4-OHT על ידי המערב המערבי.
  9. לאשר את הביטוי של T2A-GFP ואחוז של להעיף ידי cy try זרימה. שים לב כי הביטוי של GFP הוא מעיד על היפוך של הקלטת ואת הביטוי של ה-משפט.

4. בעקבות התגררות והפצת פעילות PRC2 על כרומטין

  1. ודא כי i-WT-r ו-i-MT-r mESCs אין ביטוי דולף של GFP על ידי הזרמת cy, לנסות. במקרה של ביטוי דולף של GFP, לבודד תאים GFP-שליליים על ידי FACS לפני תחילת הניסוי.
  2. הרחב את i-WT-r ואני-MT-r mESCs לתוך 5 15 ס"מ לוחות (5x 106 תאים לכל צלחת).
  3. לגרום הבעה של WT או כלוב-מוטציה באמצעות מינהל של 0.5 mM 4-OHT עבור 0 h, 12 h, 24 שעות, 36 h ו 8 ימים (1 15 ס מ לתנאי). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות. בודד את התאים המשולבים מחדש בהצלחה על-ידי FACS באמצעות GFP. כוונן את זמן הטיפולים כך שכל התנאים ייאספו בו.
  4. בצע שבב-seq עבור H3K27me2, H3K27me3 לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של WT או כלוב-מוטציה ב. השתמש בפרוטוקול שבב-seq כולל הכנה לספריה המפורטת ב-Oksuz et al., 201715.
  5. השתמש בבקרת הדקר בכל מדגם כדי לאפשר השוואה כמותית בין נקודות זמן שונות19.
    1. עבור שליטה ספייק, השימוש כרומטין מדרוסופילה מלאנוסטר (ביחס 1:50 לכרוטין הנגזרת מהsc), כמו גם לדרוזוהילה H2Av נוגדן ספציפי (1 μl של נוגדן H2Av לכל 4 μg של דרוזוהילה כרומטין על פי הוראות היצרן) בכל דוגמה.
    2. הכינו את הכרוטין מדרוסופילה באופן דומה לזה מmESCs באמצעות הפרוטוקול המפורט Oksuz et al., 201715.
  6. מפה את הרצף קורא עבור שבב-seq כדי mm10 הגנום עם Bowtie 2 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל20.
  7. לנרמל את העכבר שבב-seq קורא לדקר ב Drosophila ילה לקרוא ספירות21. חשב את פקטור הנורמליזציה של הדקר באמצעות הנוסחה הבאה: 1 x 106/מיוחד של דרוזוהילה הקורא ספירות. מצפים לקבל בערך 1 x 106דרוזוהילה לקרוא ספירות ו 20 x 106 העכבר סופר לכל ניסוי.
    1. כאשר אתה מסדר את דגימות הקלט, אל תכלול את הכרומטותין .
  8. השתמש בכלי genomecov מכלי המיטה כדי להמיר קובץ bam לתוך bedtools22. בשלב הבא, המירו את המיטה לקובץ הפאה הגדולה בעזרת הכלי מיטה מUSCS23,24. עיין בקובץ ה-script הבא:
    gen = "הנתיב אל mm10 הגנום"
    chr = "נתיב לגודל כרומוזום mm10"
    inp_bam = "הנתיב אל קלט bam הקובץ"
    הכפל = "חישוב פקטור הנורמליזציה של הדקר"
    כלים למיטה genomecov-bg-$multiply-ibam $inp-g $gen > פלט. בדפורגרף
    מיון-k1, 1-k2, 2n פלט. בדפורגרף > output_sorted.
    בoutput_sorted ביגרפיטופאה. ב$chr output.bw
  9. להמחיש את הצפיפות שבב-seq לקרוא על ידי העלאת קבצים פורסמים בדפדפן USCS הגנום24.

5. ניטור הופעתה וצמיחה של H3K27me3 וקדי בגרעין mESCs

  1. צלחת 1x 104 mESCs לתוך 8-היטב שקופיות קאמרית מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין.
  2. למחרת, להתחיל לבצע ברציפות 4-OHT (0.5 מ"מ) השראות לאסוף את התאים ביטוי ד. א. עבור נקודות הזמן שצוין (0 h, 12 h, 24 h ו 36 h). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות.
  3. תקן את mESCs עם 4% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.
  4. החדירות התאים עם PBS/0.25% טריטון X-100 בשעה RT עבור 30 דקות.
  5. לחסום את התאים עם ה-PBS/5% סרום חמור/0.1% טריטון X-100 (חסימת מאגר) ב RT עבור 30 דקות.
  6. לדלל H3K27me3 נוגדן ראשי 1:500 במאגר חסימת ולהוסיף על התאים.
  7. מודיית את התאים עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c.
  8. למחרת, לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
  9. לדלל נוגדן משני (אלקסה פלורינציה 595) 1:1000 במאגר חסימת ולהוסיף על תאים.
    1. בצע את כל הincubations בחושך בשלבים הבאים כמו נוגדנים משני מצועם אלקסה Fluor הם רגישים באור.
  10. מודיית את הנוגדן המשני עבור 2 h ב RT.
  11. לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
  12. לדלל DAPI (1 מ"ג/mL) 1:4000 עם PBS/0.1% טריטון X-100 ולהוסיף על תאים.
  13. דגירה את התאים עם DAPI עבור 10 דקות ב RT.
  14. הר את התאים עם הר אקווה.
  15. התמונה התאים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בהגדלה 63 x.
  16. עיבוד וצבע מדומה לתמונות באמצעות התפלגות ImageJ, פיג'י25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוכנית כללית של מערכת ההצלה המותנית
איור 1 מראה את התוכנית מיקוד כדי להציל באופן מותנה תאים מבוססי KO עם או WT או כלוב-המוטציות (Y365A) המתבטאת כי הוא מתבטא מתוך לוקוס מסוגני. לאחר הפסקת הפעולה של ה-PRC2, יחידת משנה של הליבה החיונית עבור היציבות והפעילות האנזימטית שלה, קלטת בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של המערכת הציגה (איור 1). הקלטת כוללת את הרצף הנותר של שלוש שנות ה-Dna, בכיוון הפוך ביחס לרצף הגנטי האנדוגני.  הקלטת מוקף הטרוולוגי אתרים הפוכים loxP (lox66 ו lox71)18. התאים מופצים עד אובדן מוחלט של H3K27me2/3 הוא נצפתה. עם ההפעלה של הrecombinase ביטוי על ידי התוספת של 4-oht, הקלטת היא הפוכה כגון כי אקסון 9 משולבים לתוך הקלטת באמצעות אחוטור הרצף (איור 1). עם מערכת זו, התאים של ה-אני KO עכשיו יכול להינצל על ידי או או כלוב-מוטציה גירסאות של ה-, שניהם יש תג C-terminal דגל-HA. המטה T2A-GFP מספק סמן כדי לבחור עבור תאים העוברים אירוע היפוך מוצלח. אות ה-polyA מונע שעתוק רצפים במורד הזרם. עם מערכת זו, קינטיקה של גיוס PRC2 והיווצרות של תחומים H3K27me יכול עכשיו להיות אחריו.

מעקב אחר התצהיר הזמני של PRC2 בתיווך H3K27me2/3
כדי לעקוב אחר הדינמיקה הטמפורלית של הקמת תחום PRC2-בתיווך כרומטין, הגירסה של WT או כלוב-מוטציה של ד. ר. מתבטאת מחדש ברקע של תאי ד. ב., ביחס 4-OHT (איור 2א, ב). כדי לעקוב אחר התצהיר של H3K27me2/3 מארקס, שבב-seq של H3K27me2/me3 מבוצעים לאחר ביטוי מחדש של WT או כלוב-מוטציה במשך נקודות הזמן המצוין. הופעתה של H3K27me3 הוא נצפתה על 12 שעות לאחר ביטוי WT באזורים דיסקרטית כי הם מסומנים "אתרי התגרעות" (איור 2ג), ולאחר מכן באזורים רחוקים מאתרי הנוקלאוציה הראשונית על ידי 24 h13. בסופו של דבר, התפלגות של H3K27me3 כמעט לקירוב את זה של רמות לראות תאים הורים WT ב 36 h לאחר ביטוי הש. האזורים הקבועים במטה של H3K27me3 מכונים "אתרים מתפשטים"13. מערכת זו יכולה גם לעקוב אחר התצהיר הזמני של H3K27me2, אשר מופיע לפני H3K27me3 תצהיר (איור 2ג, ד). לבסוף, ביטוי מחדש של כלוב-מוטציה מוצגים בדינמיקה שונה ביחס ל-WT (איור 2ג, ד). במקרה זה, הפקדת H3K27me3 היא מאוד לא יעילה ובמקום זאת, H3K27me2 הופך להיות גלוי ומרוכז יותר באתרי הנוקלאוציה, המעידים על כך שבכלוב מוטציה שאינו מסוגל להפיץ את השינוי באזורים השכנים.

הופעתה של H3K27me3 וקדי והצמיחה שלהם יכול להיות גם דמיינו על ידי מיקרוסקופ (איור 2E)13. לפני אינדוקציה של ביטוי הH3K27me3 WT, כתמים לא ברור. עם זאת, 12 h של ביטוי WT מראה ראיות של היווצרות H3K27me3 וקדי. הגידול האלה וקדי במספר וגודל על ידי 24 h, ובסופו של דבר להתפשט לאזורים גדולים של הגרעין על ידי 36 h של הבעה WT. מערכת זו מעניקה עדות של דה נובו היווצרות של PRC2-תיווך כרומטין תחומים כפיקוח על ידי שבב-seq ו immunofluorescence (איור 2C-E)13.

Figure 1
איור 1 : מיקוד הערכה כדי להציל באופן מותנה KO mESCs או עם WT או קייג '-mt (Y365A). מחיקה של אקסון 10 ו -11 גורמת לחוסר יציבות והשפלה של הפסד H3K27me2/me3. קלטת ב-אינטרון בין אקסון 9 ו-10 מוכנס לכיוון ההפוך כפי שמצוין. תוספת של 4-OHT הופכת את הקלטת כגון האקסודוגני 9 splices לתוך כלוב-מוטציה או סוג פראי cDNA של הקלטת המאפשר inducible re-ביטוי של WT או כלוב-מוטציה ב. דמות זו שונתה מ Oksuz ואח ', 201813. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : אימותים ויישומים מייצגים של מערכות הצלה inducible (i-WT-r ואני-MT-r). (א). i-WT-r ואני-MT-r מערכות מאומת על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדנים שצוין על תמציות שלמות לאחר 4-oht טיפול כדי לגרום לביטוי של WT (i-WT-r) או כלוב-מוטציה (אני-MT-r) הקשה, בנקודת הזמן המצוין. (ב). זרימת cy, ניתוח של gfp בתאי i-WT-r לפני (0 h) ואחרי (36 h) 4-oht טיפול לאישור היעילות של הביטוי של T2A-gfp, אשר מעיד על היפוך מוצלח של הקלטת ההפוכה. (C, D). שבב-seq רצועות עבור H3K27me3 (C) ו H3K27me2 (ד) ליד הגן Emx1 ב WT, או ב i-WT-r או בתאי i-MT-r, עבור הזמנים המצוינים של טיפול 4-oht. אתרים מוקדמים ומתעכבים לצורך הפקדת סימני האבן מסומנים. (ה). אימונולוורבורנציה באמצעות נוגדן H3K27me3 ב 0, 12, 24 ו 36 h לאחר ההצלה של ביטוי באמצעות ה-wt ב i-WT-r mESCs. כתמים ב 36 h מוצג בחשיפות נמוכות. הפאנל הימני ביותר הוא תמונה מוגדלת של התא המסומן בחץ אדום. דמות זו שונתה מ Oksuz ואח ', 201813. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גישה רבת עוצמה כלפי הבנת הפרטים המכניים במהלך היווצרות תחום כרומטין נתון, היא לשבש תחילה את התחום ולאחר מכן לעקוב אחר השיחזור שלה במהלך התאים. התהליך יכול להיות מושהה בכל עת במהלך השיקום כדי לנתח בפרוטרוט את האירועים המתבצעים. המחקרים הקודמים על תחומים כרומטין לא היו מסוגלים לפתור אירועים כאלה כפי שהם בוצעו בתנאים יציבים המצב (למשל, השוואת סוג פראי ונוקאאוט גן). כאן, אנו מתווה מערכת כדי להעריך את היווצרות דינמי של תחומים כרומטין, כפי שמסומן על ידי גיוס והפצת תחומים דכאניים PRC2 בתאים.

הצעד הקריטי ביותר עבור מערכת inducible זו הוא עיצוב מדויק של בניית DNA כדי לבטא מחדש את החלבונים הרצוי (או RNA) לאחר מחיקה בהתאמה שלהם מן התאים. מוטציות שונות, תגים, סמנים פלורסנט ניתן להציג בתוך המבנים האלה, בהתאם ליישומים במורד הזרם. לדוגמה, במקום להשתמש self-T2A פפטיד באופן מיידי לפני gfp כדי לנתק אותו מן החלבון של עניין, היתוך שונים של פיוז'ן חלבונים יכול להיווצר עבור דימות ברזולוציה גבוהה ו/או ניסויים בודד חלקיקים מעקב כדי ל לפקח על האירועים הראשוניים של היווצרות תחום כרומטין בתאי החיים.

למרות ששיטה זו יכולה להיות שונה במובנים רבים כדי לספק תובנות להיווצרות תחומים כרומטין, יש לו כמה מגבלות. ראשית, זה דורש קו תא המנמלים את הגן של ERT2. שנית, מיטוב הכרחי כדי לקבוע את נקודות הזמן לאחר טיפול 4-OHT. שלישית, מערכת זו אינה הפיכה כדי לפקח על האירועים במהלך דקונסטרוקציה של תחום כרומטין. ניתן להשתמש בשיטות מבוססות degron כחלופה לשיטה המתוארת כאן26,27. מערכות אלו מאפשרות השפלה הפיכה ומהירה של חלבונים, אך בדרך כלל דורשים מולקולות יקרות לחוסר יציבות בחלבון, כגון שאוקאין או מגן26,27. יתר על כן, אלה מבוססי degron שיטות יש מגבלות. ניתן להשתמש בהם רק כדי לבטא מחדש את גרסת ה-WT של החלבון לאחר השפלה. לעומת זאת, המערכת המתוארת בזאת מאפשרת ביטוי מותנה של גרסת המוטציות של חלבון הריבית בנוסף לעמיתו WT שלו. שילוב כזה של מערכת degron עם השיטה המתוארת כאן יהיה אמצעי רב עוצמה כדי לווסת את היווצרות של תחומים כרומטין. שיטה חלופית לאחר היווצרות תחומים כרומטין כרוך בשימוש של מעכבי ספציפיים לרוקן שינוי כרומטין מוגדר מ כרומטין ולאחר מכן כשלון המעכב לעקוב דה נובו התצהיר של השינוי. לדוגמה, טיפול עם מעכב EZH2 וכשלון הבאים משמש למעקב אחר היווצרות מחדש של תחומים H3K27me28. עם זאת, EZH2 מעכב אינו יעיל לחלוטין מכלה H3K27me, אפילו 7 ימים לאחר הטיפול. במקרה זה, הנוכחות של H3K27me מראש קיים עשוי לגייס ולהפעיל PRC212, ובכך לסבך את הפרשנות של התוצאות. כמו כן, השימוש באסטרטגיה מעכב וכשלון מוגבל בשל העדר מעכבי ספציפיים וחזקים עבור תחומים רבים כרומטין.

בנוסף לתחולתה של שיטה זו למערכות סלולריות, ניתן להשתמש בה כדי ליצור inducible מוטציות/תיוג על החלבונים הרצויים בבעלי חיים. במקרים מסוימים, שינוי חלבון או הוספת תג יכול להיות קטלני במהלך הפיתוח. שיטה זו עוקפת את הצורה הזאת ומספקת שליטה בזמן ובמרחב של מוטציה/תיוג של חלבונים על ידי צימוד עם ERT2 זנים ספציפיים של העכבר יצורים. סוגים אלה של ניסויים יהיה בעל ערך לקבוע את ההשפעה של מוטציה ברקמה מסוימת ו/או בשלב מסוים של התפתחות. חשוב מכך, היא מאפשרת בידוד של תאים העוברים שילוב מוצלח באמצעות הכתב בתוך הקלטת. הדבר מקל על ניתוחים ביוכימיים, כגון טיהור אהדה מרקמות ספציפיות, כדי לבודד את הרקמה הייחודית לחלבון מסוים. מערכת זו יכולה להיות מיועדת לפקח על שינויים דינמיים בכל תהליך הסלולר נתון, ולכן אינו מוגבל לעקוב אחר היווצרות דומיין כרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.R. הוא שותף מייסד של קונסטליישן תרופות ו משען Therapeutics. מחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר ל. ואלס, ד. Ozata ו-H. Mou לתיקון כתב היד. מעבדת D.R. נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז והמכונים הלאומיים לבריאות (R01CA199652 וR01NS100897).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Tags

גנטיקה סוגיה 150 PRC2 תחומים כרומטין H3K27me2 H3K27me3 אפיגנטיקה התגררות התפשטות inducible/הצלה מותנית.
שיטה ללמוד <em>דה נובו</em> היווצרות של כרומטין דומיינים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter