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Genetics

क्रोमैटिन डोमेन के नवो के गठन का अध्ययन करने की एक विधि

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

इस विधि को सेल लाइनों में PRC2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन के गठन का पालन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और विधि कई अन्य प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

संगठन और क्रोमैटिन डोमेन की संरचना व्यक्तिगत सेल वंश के लिए अद्वितीय हैं. उनके गलत विनियमन सेलुलर पहचान और / जबरदस्त प्रयासों के बावजूद, क्रोमैटिन डोमेन के गठन और प्रचार के बारे में हमारी समझ अभी भी सीमित है। क्रोमैटिन डोमेन का अध्ययन स्थिर राज्य स्थितियों के तहत किया गया है, जो अपनी स्थापना के दौरान प्रारंभिक घटनाओं का पालन करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। यहाँ, हम क्रोमैटिन डोमेन को अनिवार्य रूप से पुनर्निर्माण करने और समय के एक समारोह के रूप में उनके पुन: गठन का पालन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, पहले PRC2-मध्यस्थ दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन गठन के मामले में लागू किया, यह आसानी से अन्य क्रोमैटिन डोमेन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जीनोमिक्स और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ इस विधि के संशोधन और/या संयोजन महान विस्तार में क्रोमैटिन डोमेन की स्थापना का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा। हमें विश्वास है कि इस विधि कैसे chromatin डोमेन फार्म और एक दूसरे के साथ बातचीत की हमारी समझ में क्रांतिकारी बदलाव होगा.

Introduction

यूकैरियोटिक जीनोम अत्यधिक संगठित होते हैं और क्रोमैटिन पहुंच में परिवर्तन सीधे जीन प्रतिलेखन1को नियंत्रित करता है . जीनोम में क्रोमैटिन डोमेन के अलग-अलग प्रकार होते हैं, जो ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और प्रतिकृति समय2,3के साथ सहसंबंधित होते हैं। इन क्रोमैटिन डोमेन का आकार कुछ किलोबेस (केबी) से लेकर 100 केबी तक होता है और इसकी विशेषता अलग-अलग हिस्टोन संशोधनों4में एक समृद्धि की विशेषता होती है। केंद्रीय प्रश्न हैं: इन डोमेन कैसे बनते हैं और उनका प्रचार कैसे किया जाता है?

सबसे अच्छी तरह से विशेषता क्रोमैटिन डोमेन में से एक Polycomb दमनकारी परिसर 2 (PRC2) की गतिविधि के माध्यम से बढ़ावा दिया है. पीआरसी 2 एक बहु-सबयूनिट जटिल है जो पॉलीकॉम्ब समूह (पीसीजी) के सबसेट से बना हैजिसमें प्रोटीन5,6, और मोनो-, डाइ-और ट्राइमेथिलेशन ऑफ हिस्टोन एच 3 (H3K27me1/ 9,10. H3K27me2/me3 एक दमनकारी क्रोमैटिन राज्य के साथ जुड़े रहे हैं, लेकिन H3K27me1 का कार्य स्पष्ट नहीं है6,11. पीआरसी 2 के मुख्य घटकों में से एक, भ्रूण बहिर्चर्म विकास (ईईडी), PRC2 catalysis, H3K27me3 के अंत उत्पाद के लिए बांध, अपने खुशबूदार पिंजरे के माध्यम से और इस सुविधा के परिणाम में PRC212,13के allosteric उत्तेजना . पीआरसी 2 एंजाइमी गतिविधि विकास के दौरान सेलुलर पहचान के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ विकासात्मक जीनों की अनुचित अभिव्यक्ति जो किसी विशिष्ट वंश के लिएनिषिद्धहैं, 5,6 . इसलिए, तंत्र जिसके द्वारा PRC2 स्तनधारियों में दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन के गठन को बढ़ावा जानने सेलुलर पहचान को समझने के लिए मौलिक महत्व का है.

पीआरसी 2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन सहित क्रोमैटिन डोमेन गठन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए पिछले प्रयोगात्मक प्रणालियों के सभी, स्थिर राज्य की स्थितियों के तहत प्रदर्शन किया गया, जो क्रोमैटिन डोमेन गठन की घटनाओं को ट्रैक करने में असमर्थ हैं कक्षों. यहाँ, हम एक प्रेरक सेलुलर प्रणाली है जो प्रारंभिक भर्ती और क्रोमैटिन डोमेन के प्रचार पर नज़र रखता है उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. विशेष रूप से, हम PRC2-मध्यस्थ दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन है कि H3K27me2/3 शामिल के गठन पर नज़र रखने पर ध्यान केंद्रित. इस प्रणाली है कि chromatin डोमेन गठन के मशीनी विवरण पर कब्जा कर सकते हैं, अन्य क्रोमैटिन डोमेन को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि व्यापक रूप से अध्ययन डोमेन या तो H2AK119ub या H3K9me शामिल. जीनोमिक्स और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में, इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक क्रोमैटिन जीव विज्ञान में विभिन्न, महत्वपूर्ण सवालों का समाधान करने की क्षमता है.

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Protocol

प्रेरक ईईडी बचाव एमईएससी का उत्पादन

1. सेल संस्कृति

  1. फीडर मुक्त C57BL/6 माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (MESCs) एक stably एकीकृत CreERT2 transgene, जो 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)13के प्रशासन पर नाभिक के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं रखने का प्रयोग करें.
  2. पारंपरिक ईएससी माध्यम में एमईएससी बढ़ाएं14,15, 1000 U/mL LIF के साथ पूरक, 1 $M ERK अवरोध करनेवाला PD0325901 और 3 $M GSK3 अवरोधक CHIR99021. पारंपरिक ईएससी माध्यम के लिए, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1X पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.1 एम 2-मेरकैप्टोथेनोल युक्त नॉकआउट डीएमई का उपयोग करें।
  3. एमईएससी की culturing के लिए 0.1% जिलेटिन समाधान के साथ लेपित प्लेटों का प्रयोग करें।

2. क्लोनल Ed नॉकआउट (KO) एमईएससी की पीढ़ी

  1. डिजाइन गाइड RNAs (gRNAs) को नष्ट करने के लिए Exon 10 और Exon 11 के endogenous प्रतिलिपि के MESCs में ED के बेंचलिंग16में CRISPR डिजाइन उपकरण का उपयोग कर. ईईडी-KO-GRNA-1 एक्सऑन 10 के तुरंत अपस्ट्रीम इनट्रॉन को लक्षित करता है और ईईडी-KO-GRNA-2 एक्सऑन 11 के तुरंत डाउनस्ट्रीम को लक्षित करता है। इन gRNAs के एक साथ आवेदन दोनों Exon 10 और Exon 11 गैर समजात अंत में शामिल होने (NHEJ) द्वारा हटाता है.
  2. Clone gRNAs में pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran एट अल में निर्देशों का उपयोग कर, 201317|
  3. एक 6-वेल प्लेट प्रारूप में, ट्रांसफेक्ट 2 x 105 एमईएससी प्रत्येक ईईडी-KO-gRNA-1 और EED-KO-gRNA-2 के 1 मिलीग्राम के साथ (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों का पालन करके ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग कर। transfection के बाद मीडिया 24 ज बदलें।
  4. ट्रांसफेलेशन के दो दिन बाद, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके GFP सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करें। ट्रांसफेक्शन दक्षता 10-30 % के आसपास भिन्न होने की अपेक्षा करें। चढ़ाना के लिए पर्याप्त GFP सकारात्मक कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए 5 x 105 कोशिकाओं के आसपास क्रमबद्ध करें।
  5. कॉलोनी उठा के लिए 15 सेमी प्लेटों में अलग GFP सकारात्मक MESCs प्लेट 0.1% जिलेटिन (10-20 x103 कोशिकाओं प्रति प्लेट) के साथ पूर्व लेपित.
  6. एक कालोनियों दिखाई दे रहे हैं जब तक के बारे में एक सप्ताह के लिए ईएससी माध्यम में कोशिकाओं को बढ़ाएँ। हर 2 दिन में मीडिया बदलें.
  7. 20 डिग्री एल माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके कम से कम 48 कालोनियों को चुनें। माइक्रोपिपेट टिप में aspirating जबकि कॉलोनी पर स्क्रैप. कॉलोनी को एकल कोशिकाओं में न तोड़ें। कॉलोनी को एक accutase युक्त (20 एमएल) 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित करें।
  8. कालोनियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए तब तक इन्क्यूबेट करें जब तक कि सभी कोशिकाओं को अलग नहीं कर दिया जाता।
  9. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में ईएससी मीडिया का 200 एमएल जोड़ें।
  10. अच्छी तरह से मिक्स और दो अलग 96 अच्छी तरह से प्लेटें मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर में कोशिकाओं थाली.
  11. जीनोटाइपिंग के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों में से एक का प्रयोग करें और अन्य बढ़ रहा है जब तक genotyping निष्कर्ष निकाला है रहते हैं. निर्माता के निर्देशों का पालन करके 96 अच्छी तरह से थाली से डीएनए निकालने के लिए डीएनए निष्कर्षण समाधान का उपयोग करें।
  12. जीनोटाइपिंग प्राइमर Gnt$EED-KO-up और Gnt$EED-KO$downका उपयोग करें, जो हटाए गए साइट को बढ़ादेते हैं और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए टाक डीएनए पॉलिमरेज के साथ जीनोटाइपिंग पीसीआर का प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: डीएनए polymerases के अन्य प्रकार भी जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, Tak डीएनए polymerase सुविधा प्रदान करता है के रूप में पीसीआर प्रतिक्रिया सीधे एक जेल पर लोड किया जा सकता है जब अपनी रंगीन प्रतिक्रिया बफर प्रयोग किया जाता है.
    1. जंगली प्रकार (WT) मामले के सापेक्ष एक समयुग्मज विलोपन के साथ कोशिकाओं में कम आणविक वजन के एक डीएनए उत्पाद का निरीक्षण करें।
      नोट: पीआरसी 2 नल कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए, exons 10 और 11 के समयुग्मज विलोपन को अस्थिर और EED नीचा, कोर PRC213की एक आवश्यक उपइकाई के लिए आवश्यक है। CRISPR लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 10% है।
  13. EED exon 10 और 11 के विलोपन और Sanger अनुक्रमण और पश्चिमी blotting द्वारा ईईडी प्रोटीन के नुकसान को क्रमशः मान्य करें।
  14. H3K27me2/me3 और EED के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर के ChIP-सेक द्वारा Ed KO कोशिकाओं में chromatin से EED और H3K27me2/me3 की कमी की पुष्टि करें। Oksuz एट अल में दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करें, 201715 ChIP-सेक प्रयोगों के लिए।

3. इंजीनियरिंग EED नॉकआउट MESCs क्रे-ERT2 आधारित प्रेरक EED अभिव्यक्ति बंदरगाह के लिए

  1. डिजाइन gRNA (ED-gRNA-inducible) Benchling16 में CRISPR डिजाइन उपकरण का उपयोग कर EED के exon 9 के बाद intron के भीतर एक कटौती शुरू करने के लिए (सामग्री की तालिकादेखें).
  2. Clone gRNAs में pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran एट अल में निर्देशों का उपयोग कर, 201317|
  3. एक दाता टेम्पलेट डीएनए डिजाइन कि exon 9 के बाद ED CDNA अनुक्रम और एक सी-टर्मिनल झंडा-हा टैग एक T2A-GFP अनुक्रम के ऊपर, अंतर्जात जीन अनुक्रम के संबंध में रिवर्स अभिविन्यास में शामिल हैं.
    1. एक जोड़ स्वीकारकर्ता और एक polyadenylation अनुक्रम विषमजड़ प्रतिलोमित loxP साइटों के बीच नेस्टेड के साथ कैसेट flank (lox66 और lox71)18.
    2. प्रत्येक छोर से कम से कम 500 बीपी होमोलॉजी हथियार शामिल करें। दाता टेम्पलेट को gBlocks जीन टुकड़ों के 2 खंडों में विभाजित करें (gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" और gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") देखें और उन्हें इकट्ठा करें निर्माता के निर्देशों का पालन गिब्सन क्लोनिंग का उपयोग कर PCR Blunt वेक्टर।
      नोट: gblock-2 EED के पिंजरे के भीतर एक खुशबूदार अवशेषों (Y365) है कि H3K27me312के साथ बातचीत के लिए महत्वपूर्ण है शामिल हैं. gBlock-2-Wt जंगली प्रकार के अवशेषों में शामिल है, जबकि gblock-2-पिंजर-म्यूटेंट में EED (Y365A) के पिंजरे-म्यूटेंट शामिल हैं, जो H3K27me3 के लिए बाध्यकारी करने में असमर्थ हैं। प्रेरक WT EED बचाव i-WT-r के रूप में चिह्नित किया गया है और induducable पिंजरे-म्यूटेंट ईईडी बचाव सुविधा के लिए i-MT-r के रूप में चिह्नित किया गया है।
  4. एक 6-वेल प्लेट प्रारूप में, ट्रांसफेक्ट 2 x 105 एमईएससी के साथ 1 मिलीग्राम gRNA (Ed-gRNA-inducible) और 1 मिलीग्राम दाता टेम्पलेट्स (i-WT-r या i-MT-r) ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग कर और एफएसीएस का उपयोग करके जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करें।
  5. 2-3-2.11 सफल लक्ष्यीकरण के लिए जीनोटाइपिंग के लिए तैयार अलग-अलग कालोनियों को अलग करने के लिए चरणों का पालन करें।
  6. जीनोटाइपिंग प्राइमर इंसुलेट-जीनोटाइप-FW-1 और Inducible-Genotype-REV-1का उपयोग करें, जो सम्मिलित कैसेट का विस्तार करते हैं और टाक डीएनए पॉलिमरेज का उपयोग करके जीनोटाइपिंग पीसीआर का प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: CRISPR के लिए लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 10% है।
    1. पीसीआर द्वारा कैसेट के सही एकीकरण की पुष्टि करें inducible-Genotype-FW-2 और inducible-Genotype-REV-2 प्राइमर का उपयोग कर, जो होमोलॉजी हथियारों के बाहर हैं.
      नोट: कैसेट के Homogygous एकीकरण Ed के कुशल बचाव को पूरा करने के लिए आवश्यक है. ध्यान दें कि समयुग्मज एकीकरण के साथ कोशिकाओं WT Ed, जो एक छोटे उत्पाद का उत्पादन होगा की तुलना में एक भी बड़े डीएनए उत्पाद का उत्पादन होगा.
  7. Sanger अनुक्रमण द्वारा कैसेट के एकीकरण की पुष्टि करें.
  8. कैसेट के flipping और EED और अन्य PRC2 मुख्य घटकों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें (जैसे, E$H2 और SUz12) पश्चिमी blotting द्वारा 4-OHT प्रशासन पर.
  9. T2A-GFP की अभिव्यक्ति और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लिप का प्रतिशत की पुष्टि करें. ध्यान दें कि GFP की अभिव्यक्ति कैसेट के flipping और EED की अभिव्यक्ति का संकेत है.

4. क्रोमैटिन पर पीआरसी 2 गतिविधि के न्यूक्लिएशन और प्रसार के बाद

  1. पुष्टि करें कि i-WT-r और i-MT-r MESCs प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा GFP की लीक अभिव्यक्ति नहीं है। GFP के लीक अभिव्यक्ति के मामले में, प्रयोग शुरू करने से पहले FACS द्वारा GFP-नकारात्मक कोशिकाओं को अलग.
  2. पांच 15 सेमी प्लेटों (5x 106 कोशिकाओं प्रति प्लेट) में i-WT-r और i-MT-r MESCs का विस्तार करें।
  3. 0 एच, 12 ज, 24 ज, 36 एच और 8 दिन (एक 15 सेमी प्लेट प्रति शर्त) के लिए 0.5 एम एम 4-OHT के प्रशासन द्वारा WT या पिंजरे-म्यूटेंट ईईडी की अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। 12 h से अधिक उपचार के लिए 12 h के बाद मीडिया परिवर्तित करें. GFP का उपयोग करके FACS द्वारा सफलतापूर्वक पुनः संयोजित कोशिकाओं को अलग करें. उपचार के समय को इस तरह समायोजित करें कि सभी शर्तों को एक बार में एकत्र किया जाता है।
  4. WT या पिंजरे-म्यूटेंट EED के पुन: अभिव्यक्ति के जवाब में क्रोमैटिन के लिए उनके अस्थायी जमाव की जांच करने के लिए H3K27me2, H3K27me3 के लिए ChIP-सेक प्रदर्शन। Oksuz एट अल में विस्तृत पुस्तकालय की तैयारी सहित ChIP-सेक प्रोटोकॉल का उपयोग करें, 201715.
  5. विभिन्न समय अंक19के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक नमूने में स्पाइक-इन नियंत्रण का उपयोग करें।
    1. स्पाइक-इन नियंत्रण के लिए, ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर से क्रोमैटिन का उपयोग करें (एमईएससी व्युत्पन्न क्रोमैटिन में 1:50 अनुपात में) साथ ही ड्रोसोफिला विशिष्ट एच 2एवी एंटीबॉडी (1 एच 2एवी एंटीबॉडी का प्रति 4 डिग्री सेल्सियस के अनुसार Drosophila chromatin के अनुसार निर्माता के निर्देश) प्रत्येक नमूने में.
    2. Drosophila से क्रोमैटिन एक तरह से तैयार है कि एमईएससी से Oksuz एट अलमें विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर के समान है.
  6. नक्शा अनुक्रम ChIP-सेक के लिए पढ़ता है mm10 जीनोम Bowti 2 के साथ डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोगकर 20.
  7. माउस ChIP-सेक सामान्य करने के लिए कील में drosophila पढ़ें मायने रखता है21. निम्न सूत्र का उपयोग करके स्पाइक-इन सामान्यीकरण कारक परिकलित करें: 1 x 106/अद्वितीय Drosophila पठन गणना. लगभग 1 x 106Drosophila पढ़ने की गिनती और 20 x 106 माउस पढ़ने के लिए प्रति प्रयोग गिनती प्राप्त करने की उम्मीद.
    1. इनपुट नमूनों को अनुक्रमण करते समय Drosophila क्रोमैटिन शामिल न करें।
  8. बैम्यूक फाइल को बेडग्राफ22में बदलने के लिए बेडटूल से जीनोमकोव टूल का उपयोग करें। इसके बाद, यूएससीएस23,24से bedGraphToBigWig उपकरण का उपयोग कर बिगविग फ़ाइल में बेडग्राफ परिवर्तित करें। निम्न स्क्रिप्ट देखें:
    gen]"मिमी 10 जीनोम के लिए पथ"
    chr]"मिमी10 गुणसूत्र आकार के लिए पथ"
    inp[bam]"इनपुट bam फ़ाइल के लिए पथ "
    गुणा]"कील-इन सामान्यीकरण कारक की गणना"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp]bam -g $gen
    sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph gt; आउटपुट]sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig आउटपुट]sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. USCS जीनोम ब्राउज़र24पर bigwig फ़ाइलें अपलोड करके ChIP-सेक पढ़ा घनत्व कल्पना .

5. MESCs नाभिक में H3K27me3 foci के उद्भव और विकास की निगरानी

  1. प्लेट 1x 104 MESCs में 8-वेल चैम्बर स्लाइड 0.1% जिलेटिन के साथ पूर्व लेपित।
  2. अगले दिन, संकेत समय अंक (0 एच, 12 ज, 24 ज और 36 ज) के लिए EED व्यक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए लगातार 4-OHT (0.5 m) प्रेरण प्रदर्शन शुरू करते हैं। 12 h से अधिक समय तक उपचार के लिए 12 h के बाद मीडिया बदलें.
  3. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ एमईएससी को ठीक करें।
  4. 30 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस/0.25% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कोशिकाओं permebilize।
  5. पीबीएस/5% गधा सीरम/0.1% ट्राइटन एक्स-100 (ब्लॉकिंग बफर) के साथ कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए आरटी पर ब्लॉक करें।
  6. Dilute H3K27me3 प्राथमिक एंटीबॉडी 1:500 अवरुद्ध बफर में और कोशिकाओं पर जोड़ें.
  7. कोशिकाओं को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  8. अगले दिन, PBS/0.1% Triton X-100 के साथ 3 washes प्रदर्शन करते हैं.
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला (एलेक्सा फ्लोर 595) 1:1000 अवरुद्ध बफर में और कोशिकाओं पर जोड़ें.
    1. निम्न चरणों में अंधेरे में सभी ऊष्मायन प्रदर्शन के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर के साथ संयुग्मी प्रकाश संवेदनशील हैं.
  10. आरटी में 2 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेट करें।
  11. PBS/0.1% Triton X-100 के साथ 3 washes प्रदर्शन.
  12. पीबीएस/0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ डिल्यूट डीएपीआई (1 मिलीग्राम/एमएल) 1:4000 और कोशिकाओं पर जोड़ें।
  13. आरटी में 10 मिनट के लिए DAPI के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  14. एक्वा माउंट के साथ कोशिकाओं माउंट.
  15. 63X आवर्धन पर confocal माइक्रोस्कोपी के साथ कोशिकाओं छवि.
  16. प्रक्रिया और छद्म रंग ImageJ, फिजी25के वितरण का उपयोग कर छवियों .

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Representative Results

सशर्त बचाव प्रणाली की एक सामान्य योजना
चित्रा 1 या तो WT या पिंजरे-म्यूटेंट (Y365A) EED कि अंतर्जात EED टिड्डी से व्यक्त की है के साथ सशर्त EED KO कोशिकाओं को बचाने के लिए लक्ष्यीकरण योजना से पता चलता है। EED बाहर दस्तक देने के बाद, PRC2 की एक कोर subunit है कि इसकी स्थिरता और एंजाइमी गतिविधि के लिए आवश्यक है, EED के exon 9 निम्नलिखित intron के भीतर एक कैसेट पेश किया है (चित्र 1). कैसेट शेष 3 के होते हैं ' EED के CDNA अनुक्रम, अंतर्जात जीन अनुक्रम के संबंध में रिवर्स अभिविन्यास में.  कैसेट विषम रूप से उलटा loxP साइटों (lox66 और lox71)18से flanked है. H3K27me2/3 की पूरी हानि मनाया जाता है जब तक कोशिकाओं का प्रचार किया जाता है। 4-OHT के योग द्वारा क्रे रिकॉमबिन्स अभिव्यक्ति के सक्रियण पर, कैसेट इस तरह उलटा है कि exon 9 जोड़ स्वीकारकर्ता अनुक्रम का उपयोग कर कैसेट में spliced है (चित्र 1) . इस प्रणाली के साथ, Ed KO कोशिकाओं को अब या तो WT या पिंजरे EED के उत्परिवर्ती संस्करणों जिनमें से एक सी-टर्मिनल झंडा-हा टैग है द्वारा बचाया जा सकता है. बहाव T2A-GFP एक सफल व्युत्क्रम घटना से गुजरना है कि कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए एक मार्कर प्रदान करता है. polyA संकेत डाउनस्ट्रीम दृश्यों के प्रतिलेखन को रोकता है. इस प्रणाली के साथ, पीआरसी 2 भर्ती की गतिजता और H3K27me डोमेन के गठन का अब पालन किया जा सकता है।

पीआरसी 2-मध्यस्थ H3K27me2/3 के लौकिक जमाव को ट्रैक करना
PRC2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन स्थापना के लौकिक गतिशीलता का पालन करने के लिए, WT या पिंजरे-म्यूटेंट संस्करण ED KO कोशिकाओं की पृष्ठभूमि में फिर से व्यक्त किया जाता है, पर 4-OHT उपचार (चित्र 2ए, बी)। H3K27me2/3 अंकों के जमाव का पालन करने के लिए, संकेत समय अंक के लिए WT या पिंजरे-म्यूटेंट EED के पुन: अभिव्यक्ति के बाद H3K27me2/me3 के ChIP-सेक किया जाता है। H3K27me3 का उद्भव असतत क्षेत्रों में WT EED अभिव्यक्ति के बाद 12 h पर मनाया जाता है जो "न्यूक्लिशन साइट" (चित्र 2ब्) के रूप में निरूपित होते हैं , और फिर प्रारंभिक न्यूक्लिएशन स्थलों से 24 ज13तक दूर के क्षेत्रों में . अंततः, H3K27me3 का वितरण लगभग अनुमानित है कि WT माता पिता की कोशिकाओं में देखा स्तर के 36 h WT Ed अभिव्यक्ति के बाद. H3K27me3 के अस्थायी रूप से स्थापित डाउनस्ट्रीम साइटों को "स्प्रिंग साइटों"13कहा जाता है। यह प्रणाली H3K27me2 के अस्थायी जमाव को भी ट्रैक कर सकती है, जो H3K27me3 निक्षेपण से पहले प्रतीत होती है (चित्र 2C,D)। अंत में, पिंजरे-म्यूटेंट EED की फिर से अभिव्यक्ति WT EED के सापेक्ष विभिन्न गतिशीलता दर्शाती है (चित्र 2सी,डी)। इस मामले में, H3K27me3 के जमाव बहुत अक्षम है और इसके बजाय, H3K27me2 स्पष्ट हो जाता है और अधिक nucleation साइटों पर ध्यान केंद्रित, यह दर्शाता है कि पिंजरे-म्यूटेंट EED पड़ोसी क्षेत्रों में संशोधन प्रसार करने में असमर्थ है.

एच 3 के27म3 फॉसी के उद्भव और उनके विकास की कल्पना माइक्रोस्कोपी द्वारा भी की जा सकती है (चित्र 2ई)13. WT Ed अभिव्यक्ति के प्रेरण से पहले, H3K27me3 धुंधला स्पष्ट नहीं है. हालांकि, WT Ed अभिव्यक्ति के 12 एच H3K27me3 foci गठन के सबूत से पता चलता है. इन foci 24 एच से संख्या और आकार में वृद्धि, और अंत में WT Ed अभिव्यक्ति के 36 एच द्वारा नाभिक के बड़े क्षेत्रों में फैल गया. इस प्रणाली के अनुसार पी.सी.पी.-सेक और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्र 2ब्-ई)13की निगरानी में पीआरसी 2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन के नवो के गठन का प्रमाण है ।

Figure 1
चित्र 1 : लक्ष्य योजना या तो WT या पिंजरे-एमटी ईईडी (Y365A) के साथ ईईडी KO MESCs बचावकरने के लिए। 10 और 11 के विलोपन अस्थिरता और EED की गिरावट और H3K27me2/me3 की वैश्विक हानि का कारण बनता है. एक्सन 9 और 10 के बीच इनट्रॉन में एक कैसेट को विपरीत दिशा में डाला जाता है जैसा कि संकेत दिया गया है। 4-OHT के अलावा कैसेट इस तरह कि अंतर्जात exon 9 splices में पिंजरे-म्यूटेंट या जंगली प्रकार cDNA कैसेट की inducible पुन: अभिव्यक्ति की अनुमति WT या पिंजरे-म्यूटेंट Ed. यह आंकड़ा Oksuz एट अल से संशोधित किया गया है, 201813. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : inducible EED बचाव प्रणाली (i-WT-r और i-MT-r) के सत्यापन और प्रतिनिधि अनुप्रयोगों. (एक)- i-WT-r और i-MT-r सिस्टम को पश्चिमी दाग द्वारा मान्य किया जाता है, जिसमें संकेतित एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए 4-OHT उपचार के बाद डब्ल्यूटी (आई-डब्ल्यूटी-आर) या पिंजरे-म्यूटेंट (आई-एमटी-आर) ईईडी की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए संकेत दिया गया है। (बी) आई-WT-r कोशिकाओं में GFP के प्रवाह cytometry विश्लेषण से पहले (0 ज) और बाद (36 ज) 4-OHT उपचार T2A-GFP की अभिव्यक्ति की दक्षता की पुष्टि के लिए, जो उल्टे कैसेट के सफल फ्लिप का संकेत है. (सी, डी) ChIP-सेक H3K27me3 (सी) और H3K27me2 (डी) WT में Emx1 जीन के पास, या i-WT-r में या i-MT-r कोशिकाओं में, 4-OHT उपचार के इंगित समय के लिए पटरियों। हिस्टोन चिह्न ों के जमा करने के लिए शीघ्र और विलंबित स्थलों का संकेत दिया जाता है। (ई) i-WT-r MESCs में WT EED अभिव्यक्ति के बचाव के बाद 0, 12, 24 और 36 h पर H3K27me3 एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रतिरक्षा प्रवाह। 36 एच पर दाग कम जोखिम पर दिखाया गया है. सबसे दाएँ फलक एक लाल तीर के साथ लेबल सेल की ज़ूम-इन छवि है। यह आंकड़ा Oksuz एट अल से संशोधित किया गया है, 201813. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

दिए गए क्रोमैटिन डोमेन के गठन के दौरान मशीनी विवरण को समझने की दिशा में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण, पहले डोमेन को बाधित करना और फिर कोशिकाओं के भीतर प्रगति में इसके पुनर्निर्माण को ट्रैक करना है। प्रक्रिया पुनर्निर्माण के दौरान किसी भी समय रोका जा सकता है विस्तार से प्रगति में घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए. क्रोमैटिन डोमेन पर पिछले अध्ययन ऐसी घटनाओं को हल करने में असमर्थ थे क्योंकि वे स्थिर राज्य की स्थितियों के तहत प्रदर्शन किए गए थे (जैसे, जंगली-प्रकार और जीन नॉकआउट की तुलना करते हुए)। यहाँ, हम क्रोमैटिन डोमेन के गतिशील गठन का आकलन करने के लिए एक प्रणाली की रूपरेखा, के रूप में भर्ती और कोशिकाओं में PRC2-मध्यस्थ दमनकारी डोमेन के प्रसार से प्रकाश डाला.

इस inducible प्रणाली के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए का सही डिजाइन करने के लिए कोशिकाओं से उनके संबंधित हटाने के बाद वांछित प्रोटीन (या आरएनए) फिर से व्यक्त है. विभिन्न उत्परिवर्तनों, टैग, और फ्लोरोसेंट मार्करों इन निर्माण के भीतर पेश किया जा सकता है, बहाव अनुप्रयोगों के आधार पर. उदाहरण के लिए, GFP से तुरंत पहले स्वयं का उपयोग करने के बजाय T2A पेप्टाइड यह ब्याज के प्रोटीन से डिस्कनेक्ट करने के लिए, विभिन्न फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उत्पन्न किया जा सकता है और / जीवित कोशिकाओं में क्रोमैटिन डोमेन गठन की प्रारंभिक घटनाओं की निगरानी करें।

हालांकि इस विधि chromatin डोमेन के गठन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है, यह कुछ सीमाएं हैं. सबसे पहले, यह एक सेल लाइन है कि Cre-ERT2 जीन बंदरगाह की आवश्यकता है. दूसरा, अनुकूलन 4-OHT उपचार के बाद समय अंक निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। तीसरा, यह प्रणाली प्रतिवर्ती नहीं है ताकि एक क्रोमैटिन डोमेन के deconstruction के दौरान घटनाओं की निगरानी करने के लिए. Degron आधारित विधियों यहाँ वर्णित विधि के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताहै 26,27. ये प्रणालियां प्रोटीनों के प्रतिवर्ती और तीव्र अवक्रमण को सक्षम करती हैं , लेकिन आमतौर पर प्रोटीन अस्थिरता के लिए महंगे अणुओं की आवश्यकता होती है, जैसे औक्सिन या ढाल26,27. इसके अलावा, इन degron-आधारित तरीकों सीमाएं हैं. वे केवल अपनी गिरावट के बाद प्रोटीन के WT संस्करण फिर से व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, यहाँ वर्णित प्रणाली अपने WT समकक्ष के अलावा ब्याज की प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करण की सशर्त अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं. यहाँ वर्णित विधि के साथ इस तरह के एक degron प्रणाली का मेल एक शक्तिशाली का अर्थ है chromatin डोमेन के गठन reversibly modulate होगा. क्रोमैटिन डोमेन के गठन का पालन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि क्रोमैटिन से एक परिभाषित क्रोमैटिन संशोधन को कम करने के लिए विशिष्ट अवरोधकों के उपयोग पर जोर देती है और फिर संशोधन के नवो जमा करने का पालन करने के लिए अवरोधक को धोती है। उदाहरण के लिए, EHH2 अवरोध करनेवाला और बाद में washout के साथ उपचार H3K27me डोमेन28के पुन: गठन पर नज़र रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, इलाज के 7 दिनों के बाद भी एच3के27me को पूरी तरह से कम करने में ईजेडएच 2 अवरोधक प्रभावी नहीं है। इस मामले में, पूर्व मौजूदा H3K27me की उपस्थिति भर्ती और पीआरसी2 12को सक्रिय कर सकते हैं, जिससे परिणामों की व्याख्या जटिल. के रूप में अच्छी तरह से, अवरोध करनेवाला और washout रणनीति का उपयोग कई क्रोमैटिन डोमेन के लिए विशिष्ट और शक्तिशाली inhibitors की अनुपस्थिति के कारण सीमित है.

सेलुलर प्रणालियों के लिए इस विधि की प्रयोज्यता के अलावा, यह पशुओं में वांछित प्रोटीन पर प्रेरक उत्परिवर्तनों / टैगिंग उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ मामलों में, एक प्रोटीन mutating या एक टैग डालने के विकास के दौरान घातक हो सकता है. यह विधि इस घातकता को नजरअंदाज करती है और ऊतक विशिष्ट क्रे-ईआरटी2 माउस उपभेदों के साथ युग्मन द्वारा प्रोटीन के उत्परिवर्तन/टैगिंग का एक लौकिक और स्थानिक नियंत्रण प्रदान करती है। प्रयोगों के इन प्रकार के एक विशिष्ट ऊतक में एक उत्परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए मूल्यवान होगा और / महत्वपूर्ण बात, यह कोशिकाओं है कि कैसेट के भीतर रिपोर्टर के माध्यम से एक सफल पुनर्संयोजन से गुजरना के अलगाव के लिए अनुमति देता है. यह जैव रासायनिक विश्लेषण की सुविधा, इस तरह के विशिष्ट ऊतकों से आत्मीयता शुद्धि के रूप में, एक दिए गए प्रोटीन के लिए ऊतक-विशिष्ट interactome को अलग करने के लिए. इस प्रणाली को किसी भी सेलुलर प्रक्रिया में गतिशील परिवर्तन की निगरानी के लिए तैयार किया जा सकता है, और इसलिए क्रोमैटिन डोमेन गठन पर नज़र रखने तक ही सीमित नहीं है।

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Disclosures

डी.आर. तारामंडल फार्मास्यूटिकल्स और Fulcrum चिकित्सा के एक सह संस्थापक है. लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के संशोधन के लिए Drs. L Vales, D. Ozata और एच. डी.आर. लैब हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01CA199652 और R01NS100897) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

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References

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जेनेटिक्स अंक 150 पीआरसी 2 क्रोमैटिन डोमेन H3K27me2 H3K27me3 epigenetics नाभिकन प्रसार inducible /
क्रोमैटिन डोमेन के <em>नवो</em> के गठन का अध्ययन करने की एक विधि
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Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

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