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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Abstract

L'organizzazione e la struttura dei domini della cromatina sono uniche per le singole linee cellulari. La loro cattiva regolamentazione potrebbe portare a una perdita di identità cellulare e/o malattia. Nonostante gli enormi sforzi, la nostra comprensione della formazione e della propagazione dei domini della cromatina è ancora limitata. I domini di cromatina sono stati studiati in condizioni stabili, che non sono favorevoli a seguire gli eventi iniziali durante la loro istituzione. Qui, presentiamo un metodo per ricostruire indebitamente i domini della cromatina e seguire la loro ri-formazione in funzione del tempo. Anche se, prima applicato al caso di formazione del dominio cromatina repressiva mediata da PRC2, potrebbe essere facilmente adattata ad altri domini di cromatina. La modifica di e/o la combinazione di questo metodo con la genomica e le tecnologie di imaging fornirà strumenti preziosi per studiare in dettaglio la creazione di domini di cromatina. Crediamo che questo metodo rivoluzionerà la nostra comprensione di come i domini della cromatina si formano e interagiscono tra loro.

Introduction

I genomi eucarioti sono altamente organizzati e i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina controllano direttamente la trascrizione genica1. Il genoma contiene diversi tipi di domini di cromatina, che sono correlati all'attività trascrizionale e alla temporizzazione della replicazione2,3. Questi domini di cromatina variano in dimensioni da pochi kilobase (kb) a più di 100 kb e sono caratterizzati da un arricchimento in distinte modifiche istoni4. Le domande centrali sono: come si formano questi domini e come vengono propagati?

Uno dei domini di cromatina più caratterizzati è favorito attraverso l'attività del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 è un complesso multi-sottounità composto da un sottoinsieme del Polycomb Group (PcG) delle proteine5,6, e catalizza la mono-, di- e trimetilazione di lisina 27 di istone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sono associati a uno stato di cromatina repressiva, ma la funzione di H3K27me1 non è chiara6,11. Uno dei componenti fondamentali della PRC2, sviluppo ectodernico embrionale (EED), si lega al prodotto finale della catalisi PRC2, H3K27me3, attraverso la sua gabbia aromatica e questa caratteristica si traduce nella stimolazione allosteric della PRC212,13. L'attività enzimatica PRC2 è cruciale per preservare l'identità cellulare durante lo sviluppo in quanto l'espressione inappropriata di alcuni geni dello sviluppo che sono controindicati per un lignaggio specifico, sarebbe dannosa5,6 . Pertanto, svelare i meccanismi attraverso i quali la RPC2 favorisce la formazione di domini di cromatina repressiva nei mammiferi è di fondamentale importanza per comprendere l'identità cellulare.

Tutti i sistemi sperimentali passati progettati per studiare la formazione di domini di cromatina, compresi i domini di cromatina mediati dalla RPC, sono stati eseguiti in condizioni stabili, che non sono in grado di monitorare gli eventi di svolgimento della formazione del dominio della cromatina Cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per generare un sistema cellulare inducibile che monitora il reclutamento iniziale e la propagazione dei domini di cromatina. In particolare, ci concentriamo sul monitoraggio della formazione di domini di cromatina repressiva mediati da PRC2 che comprendono H3K27me2/3. Questo sistema in grado di cogliere i dettagli meccanicistici della formazione del dominio della cromatina, potrebbe essere adattato per incorporare altri domini della cromatina, come i domini ampiamente studiati che comprendono H2AK119ub o H3K9me. In combinazione con la genomica e le tecnologie di imaging, questo approccio ha il potenziale per affrontare con successo varie domande chiave nella biologia della cromatina.

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Protocol

Generazione di mESC di salvataggio EED inducibili

1. Cultura cellulare

  1. Utilizzare cellule staminali embrionali C57BL/6 topo senza alimentatore (mESC) in possesso di un transgene CreERT2 opportunamente integrato, che può traslocare nel nucleo dopo la somministrazione di 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Crescere mESC in medio ESC convenzionale14,15, integrato con 1000 U/mL LIF, 1 inibitore ERK PD0325901 e 3 M GSK3 inibitore CHIR99021. Per il mezzo ESC convenzionale, utilizzare DMEM ad eliminazione diretta contenente 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicillina/streptomicina e 0,1 mM 2-mercaptoetanolo.
  3. Utilizzare piastre rivestite con soluzione di gelatina dello 0,1% per la coltura di mESC.

2. Generazione di mESC ePEC e EED clonale (KO)

  1. Guida di progettazione RNA (gRNA) per eliminare Exon 10 e Exon 11 di copia endogena di EED in mESC utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16. EED-KO-gRNA-1 bersaglio dell'intron e'1 immediatamente a monte dell'esone 10 e dell'EED-KO-gRNA-2 bersaglia l'introne immediatamente a valle dell'Exon 11. L'applicazione simultanea di questi gRNA elimina sia Exon 10 che Exon 11 con un'unione finale non omologa (NHEJ).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. In un formato a 6 piani, transfect 2 x 105 mESC con 1 mg di ogni EED-KO-gRNA-1 e EED-KO-gRNA-2 (vedi Tabella dei materiali) utilizzando il reagente di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 h dopo la trasfezione.
  4. Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive GFP utilizzando lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Aspettatevi che l'efficienza della trasfezione vari intorno al 10-30 %. Ordinare circa 5 x 105 celle per catturare sufficienti cellule positive GFP per la placcatura.
  5. Piastra i mESC positivi GFP isolati in piastre da 15 cm pre-rivestite con 0,1% di gelatina (10-20 x103 cellule per piastra) per la raccolta delle coccie.
  6. Far crescere le cellule in mezzo ESC per circa una settimana fino a quando le singole colonie sono visibili. Cambiare i media ogni 2 giorni.
  7. Scegli un minimo di 48 colonie utilizzando la punta di micropipetta da 20 . Raschiare la colonia mentre si aspira nella punta della micropipetta. Non suddividere la colonia in singole cellule. Trasferire la colonia in un piatto di accutasi contenente (20 mL) 96.
  8. Incubare le colonie per 10 min a 37 gradi centigradi fino a quando tutte le cellule sono dissociate.
  9. Aggiungere 200 mL di supporti ESC in ogni pozzo utilizzando pipetta multicanale.
  10. Mescolare bene e placcare le celle in due lastre di pozzo 96 separate utilizzando pipetta multicanale.
  11. Utilizzare una delle 96 lastre di pozzo per la genotipizzazione e mantenere l'altro in crescita fino a quando la genotipizzazione è conclusa. Utilizzare la soluzione di estrazione del DNA per estrarre il DNA dalla piastra da 96 pozzo seguendo le istruzioni del produttore.
  12. Utilizzare i numeri primi genotipizzati Gnt_EED-KO-up e Gnt_EED-KO_down, che si estendono sul sito eliminato ed eseguono la genotipizzazione della PCR con la polimerasi del DNA Taq seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Altri tipi di polimerasi del DNA possono essere utilizzati anche per la genotipizzazione, tuttavia, la polimerasi del DNA Taq offre comodità in quanto la reazione PCR può essere caricata direttamente su un gel quando viene utilizzato il suo buffer di reazione colorato.
    1. Osservare un prodotto di DNA con minore peso molecolare nelle cellule con una delezione omozia rispetto al caso wild-type (WT).
      NOTA: Per generare celle nulle PRC2, è necessaria la cancellazione omoziana degli esoni 10 e 11 per destabilizzare e degradare EED, una sottounità essenziale del core PRC213. L'efficienza mirata AL CRISPR è di circa il 10 %.
  13. Convalidare la cancellazione di EED exon 10 e 11 e la perdita di proteina EED da parte del sequenziamento e del gonfiamento occidentale, rispettivamente.
  14. Confermare l'esaurimento di EED e H3K27me2/me3 dalla cromatina nelle cellule EED KO da ChIP-seq utilizzando anticorpi contro H3K27me2/me3 ed EED. Utilizzare il protocollo indicato in Oksuz et al., 201715 per gli esperimenti ChIP-seq.

3. Ingegneria degli eED knockout mESC per ospitare l'espressione EED inducibile basata su Cre-ERT2

  1. Progettare gRNA (EED-gRNA-inducible) per introdurre un taglio all'interno dell'intron seguendo l'esone 9 di EED utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16 (vedere Tabella dei materiali).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. Progettare un DNA modello donatore che comprenda la sequenza EED cDNA dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena.
    1. Affiancare la cassetta con un accettatore di giunzione e una sequenza poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti etelologi (lox66 e lox71)18.
    2. Includere almeno 500 bp di bracci di omologia da ogni estremità. Dividere il modello donatore in 2 segmenti di frammenti genici gBlocks (vedere gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e assemblarli in vettore PCR Blunt utilizzando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: gblock-2 contiene un residuo aromatico (Y365) all'interno della gabbia di EED che è importante per l'interazione con H3K27me312. gBlock-2-Wt contiene residui di tipo selvaggio, mentre gblock-2-gabbia-mutante contiene la gabbia-mutante di EED (Y365A), incapace di legarsi a H3K27me3. Il salvataggio inducibile di WT EED è indicato come i-WT-r e il salvataggio EED indotbile in gabbia-mutante è indicato come i-MT-r per comodità.
  4. In un formato a 6 piani, trasfect 2 x 105 mESC con 1 mg di gRNA (EED-gRNA-inducibile) e 1 mg dei modelli donatore (i-WT-r o i-MT-r) utilizzando la reagente di trasfezione e isolare le cellule positive GFP utilizzando FACS.
  5. Segui i passaggi 2.3-2.11 per isolare le singole colonie pronte per la genotipizzazione per il targeting di successo.
  6. Utilizzare i primer di genotipizzazione Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-REV-1, che si estendono sulla cassetta inserita ed eseguono la genotipizzazione PCR utilizzando la polimerasi del DNA Taq.
    NOTA: l'efficienza di targeting per CRISPR è di circa il 10 %.
    1. Confermare la corretta integrazione della cassetta da PCR utilizzando i primer Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-REV-2, che si trovano al di fuori dei bracci omeologia.
      NOTA: L'integrazione omozigotale della cassetta è necessaria per realizzare un salvataggio efficiente di EED. Si noti che le cellule con integrazione omozio produrranno un singolo prodotto di DNA di grandi dimensioni rispetto a WT EED, che produrrà un prodotto corto.
  7. Confermare l'integrazione della cassetta da parte del sequenziamento Sanger.
  8. Confermare il lancio della cassetta e l'espressione di EED e di altri componenti di base PRC2 (ad es., E-H-2 e SU-12) sull'amministrazione 4-OHT mediante gonfiore occidentale.
  9. Confermare l'espressione di T2A-GFP e la percentuale di capovolgimento per citometria di flusso. Si noti che l'espressione di GFP è indicativa di capovolgimento della cassetta e l'espressione di EED.

4. A seguito della nucleazione e della diffusione dell'attività della RPC2 sulla cromatina

  1. Verificare che i-WT-r e i-MT-r mESC non abbiano un'espressione perdente di GFP per citometria di flusso. In caso di espressione perdente di GFP, isolare le cellule GFP-negative da FACS prima di iniziare l'esperimento.
  2. Espandere i mESC i-WT-r e i-MT-r in cinque piastre da 15 cm (5x 106 celle per piastra).
  3. Indurre l'espressione di WT o gabbia-mutante EED per somministrazione di 0,5 mM 4-OHT per 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 giorni (una piastra di 15 cm per condizione). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h. Isolare le cellule ricombinate con successo utilizzando GFP. Regolare il tempo dei trattamenti in modo che tutte le condizioni siano raccolte contemporaneamente.
  4. Eseguire ChIP-seq per H3K27me2, H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla riequisetta di WT o EED a gabbia-mutante. Utilizzare il protocollo ChIP-seq, inclusa la preparazione della libreria descritta in Oksuz et al., 201715.
  5. Utilizzare il controllo spike-in in ogni campione per consentire il confronto quantitativo tra diversi punti temporali19.
    1. Per il controllo del picco, utilizzare la cromatina dalla Drosophila melanogaster (in un rapporto 1:50 rispetto alla cromatina derivata da mESC) e l'anticorpo H2Av specifico di Drosophila (1 Luna di anticorpo H2Av per 4 g di istruzioni del produttore) in ogni campione.
    2. Preparare la cromatina dalla Drosophila in un modo simile a quello da mESC utilizzando il protocollo dettagliato in Oksuz et al., 201715.
  6. Mappare la sequenza di ChIP-seq al genoma di mm10 con Bowtie 2 utilizzando i parametri di default20.
  7. Normalizzare le letture di ChIP-seq del mouse in Drosophila read conta21. Calcolare il fattore di normalizzazione spike-in utilizzando la seguente formula: 1 x 106/univoco Drosophila read conta. Aspettatevi di ottenere circa 1 x 106Drosophila conteggio delle letture e 20 x 106 conteggi di lettura del mouse per esperimento.
    1. Non includere la cromatina di Drosophila durante il sequenziamento dei campioni di input.
  8. Utilizzare lo strumento genomecov dei bedtools per convertire il file bam nel bedgraph22. Successivamente, convertire il bedgrafa in file bigwig utilizzando lo strumento bedGraphToBigWig da USCS23,24. Vedere lo script seguente:
    "percorso al genoma di mm10"
    "percorso verso le dimensioni dei cromosomi mm10"
    inp_bam"percorso del file bam di input "
    multiply: "calcola il fattore di normalizzazione del picco"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Visualizza le densità di lettura ChIP-seq caricando i file bigwig sul browser genoma USCS24.

5. Monitoraggio dell'emergere e della crescita dei foci H3K27me3 nei nuclei mESC

  1. Piatto 1x 104 mESC in scivoli a camera 8-well pre-rivestiti con gelatina dello 0,1%.
  2. Il giorno successivo, iniziare a eseguire induzioni consecutive 4-OHT (0,5 mM) per raccogliere le cellule che esprimono EED per i punti temporali indicati (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h.
  3. Fissare i mESC con 4% paraformaldeide in salina tamponati di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
  4. Permeabilizzare le celle con PBS/0.25% Triton X-100 a RT per 30 min.
  5. Bloccare le celle con siero d'asino PBS/5%/0,1% Triton X-100 (buffer di blocco) a RT per 30 min.
  6. Diluire l'anticorpo primario H3K27me3 1:500 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
  7. Incubare le cellule con anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi.
  8. Il giorno successivo, eseguire 3 lavatori con PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Diluire l'anticorpo secondario (Alexa fluor 595) 1:1000 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
    1. Eseguire tutte le incubazioni al buio nei passaggi successivi come anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor sono sensibili alla luce.
  10. Incubare l'anticorpo secondario per 2 h a RT.
  11. Esegui 3 lavamenti con PBS/0,1% Triton X-100.
  12. Diluire DAPI (1 mg/mL) 1:4000 con PBS/0.1% Triton X-100 e aggiungere alle celle.
  13. Incubare le cellule con DAPI per 10 min a RT.
  14. Montare le celle con Aqua mount.
  15. Immagina le cellule con microscopia confocale con ingrandimento 63X.
  16. Elaborare e pseudo-colorare le immagini utilizzando una distribuzione di ImageJ, Fiji25.

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Representative Results

Un sistema generale del sistema di salvataggio condizionato
La figura 1 mostra lo schema di targeting per salvare in modo condizionale le cellule EED KO con WT o EED (Y365A) echeggiato dal locus EED endogeno. Dopo aver eliminato EED, viene introdotta una sottounità centrale di PRC2 essenziale per la sua stabilità e attività ezimatica, viene introdotta una cassetta all'interno dell'intron dopo l'esone 9 di EED (Figura 1). La cassetta è costituita dalla restante sequenza cDNA 3' di EED, in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena.  La cassetta è fiancheggiata da siti loxP invertiti eterologi (lox66 e lox71)18. Le cellule vengono propagate fino a quando non viene osservata la perdita completa di H3K27me2/3. Al momento dell'attivazione dell'espressione ricombinante Cre con l'aggiunta di 4-OHT, la cassetta viene invertita in modo tale che l'esone 9 venga unito alla cassetta utilizzando la sequenza di accettazione della giunzione (Figura 1). Con questo sistema, le cellule EED KO possono ora essere salvate da WT o versioni a gabbia-mutante di EED, entrambe dotate di un tag Flag-HA c-terminale. Il T2A-GFP a valle fornisce un marcatore per selezionare per le cellule che subiscono un evento di inversione di successo. Il segnale polyA impedisce la trascrizione delle sequenze a valle. Con questo sistema, la cinetica del reclutamento della RPC 2 e la formazione dei domini H3K27me possono ora essere seguite.

Tracciamento della deposizione temporale di H3K27me2/3 mediata dalla RPC2
Per seguire la dinamica temporale dell'istituzione del dominio della cromatina mediata da PRC2, la versione WT o cage-mutant di EED è riesprimeta sullo sfondo delle cellule EED KO, su trattamento 4-OHT (Figura 2A,B). Per seguire la deposizione di H3K27me2/3 marchi, ChIP-seq di H3K27me2/me3 vengono eseguiti dopo la rieluttura di WT o EED a gabbia per i punti temporali indicati. L'emergere di H3K27me3 si osserva a 12 h dopo l'espressione WT EED in regioni discrete che sono indicate come "siti di nucleazione" (Figura 2C), e quindi in regioni lontane dai siti di nucleazione iniziali da 24 h13. Alla fine, la distribuzione di H3K27me3 si avvicina quasi a quella dei livelli osservati nelle cellule parentali WT a 36 h dopo l'espressione WT EED. I siti a valle consolidati temporalmente di H3K27me3 sono definiti "siti di diffusione"13. Questo sistema può anche tenere traccia della deposizione temporale di H3K27me2, che sembra precedere la deposizione H3K27me3 (Figura 2C,D). Infine, la ri-espressione dell'EED a gabbia mostra dinamiche diverse rispetto a WT EED (Figura 2C,D). In questo caso, la deposizione di H3K27me3 è molto inefficiente e invece, H3K27me2 diventa evidente e più concentrata nei siti di nucleazione, indicando che l'EdEd a gabbia-mutante non è in grado di diffondere la modifica alle regioni vicine.

L'emergere di H3K27me3 foci e la loro crescita possono anche essere visualizzati dalla microscopia (Figura 2E)13. Prima dell'induzione dell'espressione WT EED, la colorazione H3K27me3 non è evidente. Tuttavia, 12 h di espressione WT EED mostra la prova della formazione di foci H3K27me3. Questi foci aumentano di numero e dimensioni di 24 h, e alla fine si diffondono in vaste regioni del nucleo di 36 h di espressione WT EED. Questo sistema dimostra la formazione de novo di domini di cromatina mediati dalla PRC2 monitorati da ChIP-seq e immunofluorescenza (Figura 2C-E)13.

Figure 1
Figura 1 : il programma di salvataggio condizionale di EED KO con WT o EED (Y365A). L'eliminazione degli esoni 10 e 11 causa destabilizzazione e degrado di EED e la perdita globale di H3K27me2/me3. Una cassetta nell'intron tra exon 9 e 10 viene inserita nella direzione inversa come indicato. L'aggiunta di 4-OHT inverte la cassetta in modo tale che endogeni esone 9 giunzioni nel cage-mutant o wild tipo cDNA della cassetta permettendo inducibile ri-espressione di WT o gabbia-mutante EED. Questa cifra è stata modificata da Oksuz et al., 201813. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : convalide e applicazioni rappresentative dei sistemi di salvataggio EED inducibili (i-WT-r e i-MT-r). ( I sistemiA) i-WT-r e i-MT-r sono convalidati dalla macchia occidentale utilizzando anticorpi indicati su estratti interi dopo il trattamento 4-OHT per indurre l'espressione di WT (i-WT-r) o eED gabbia-mutante (i-MT-r), nel momento indicato. (B). Analisi della citometria di flusso della GFP nelle cellule i-WT-r prima (0 h) e dopo (36 h) 4-OHT per confermare l'efficienza dell'espressione di T2A-GFP, che è indicativa di un successo nel lancio della cassetta invertita. (C, D). Tracce ChIP-seq per H3K27me3 (C) e H3K27me2 (D) vicino al gene Emx1 nel WT, o in i-WT-r o nelle cellule i-MT-r, per i tempi indicati del trattamento 4-OHT. Sono indicati i siti precoci e ritardati per la deposizione dei marchi itoni. (E). Immunofluorescenza con anticorpi H3K27me3 a 0, 12, 24 e 36 h dopo il salvataggio dell'espressione WT EED nei mESC i-WT-r. La colorazione a 36 h è mostrata a esposizioni più basse. Il pannello più a destra è un'immagine ingrandita della cella etichettata con una freccia rossa. Questa cifra è stata modificata da Oksuz et al., 201813. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un approccio potente per comprendere i dettagli meccanicistici durante la formazione di un dato dominio cromatico, è quello di interrompere prima il dominio e poi monitorare la sua ricostruzione in corso all'interno delle cellule. Il processo può essere sospeso in qualsiasi momento durante la ricostruzione per analizzare in dettaglio gli eventi in corso. Studi precedenti sui domini di cromatina non sono stati in grado di risolvere tali eventi in quanto sono stati eseguiti in condizioni di stato costante (ad esempio, confrontando il tipo selvaggio e il knockout genico). Qui, delineamo un sistema per valutare la formazione dinamica dei domini di cromatina, come evidenziato dal reclutamento e dalla diffusione di domini repressivi mediati da PRC2 nelle cellule.

Il passo più critico per questo sistema inducibile è la progettazione accurata dei costrutti di DNA per riesprimere le proteine desiderate (o RNA) dopo la loro rispettiva eliminazione dalle cellule. Vari mutazioni, tag e marcatori fluorescenti potrebbero essere introdotti all'interno di questi costrutti, a seconda delle applicazioni a valle. Ad esempio, invece di usare il peptide T2A auto-fessura immediatamente prima della GFP per scollegarlo dalla proteina di interesse, varie proteine di fusione fluorescente potrebbero essere generate per esperimenti di imaging e/o tracciamento di particelle singole ad alta risoluzione monitorare gli eventi iniziali di formazione del dominio della cromatina nelle cellule viventi.

Anche se questo metodo potrebbe essere modificato in molti modi per fornire approfondimenti sulla formazione dei domini di cromatina, ha alcune limitazioni. In primo luogo, richiede una linea cellulare che ospita il gene Cre-ERT2. In secondo luogo, le ottimizzazioni sono necessarie per determinare i punti temporali dopo il trattamento 4-OHT. In terzo luogo, questo sistema non è reversibile in modo da monitorare gli eventi durante la decostruzione di un dominio cromatina. I metodi basati su Degron potrebbero essere utilizzati come alternativa al metodo descritto qui26,27. Questi sistemi consentono una degradazione reversibile e rapida delle proteine, ma di solito richiedono molecole costose per la destabilizzazione delle proteine, come l'auxina o lo scudo26,27. Inoltre, questi metodi basati su degron hanno limitazioni. Essi potevano essere utilizzati solo per riesprimere la versione WT della proteina solo dopo la sua degradazione. Al contrario, il sistema qui descritto consente l'espressione condizionale della versione mutante della proteina di interesse oltre alla sua controparte WT. Combinando un tale sistema degron con il metodo qui descritto sarebbe un potente mezzo per modulare in modo reversibilmente la formazione dei domini di cromatina. Un metodo alternativo per seguire la formazione di domini di cromatina comporta l'uso di inibitori specifici per esaurire una modifica della cromatina definita dalla cromatina e poi lavare l'inibitore per seguire la deposizione de novo della modificazione. Ad esempio, il trattamento con inibitore di E-H2 e il successivo lavaggio viene utilizzato per monitorare la ri-formazione dei domini H3K27me28. Tuttavia, l'inibitore di E-H2 non è efficace nell'esaurire completamente H3K27me, anche 7 giorni dopo il trattamento. In questo caso, la presenza di H3K27me preesistente potrebbe reclutare e attivare il PRC212,complicando così l'interpretazione dei risultati. Inoltre, l'uso dell'inibitore e la strategia di lavaggio è limitato a causa dell'assenza di inibitori specifici e potenti per molti domini di cromatina.

Oltre all'applicabilità di questo metodo ai sistemi cellulari, può essere utilizzato per generare mutazioni inducibili/tagging sulle proteine desiderate negli animali. In alcuni casi, la mutazione di una proteina o l'inserimento di un tag potrebbe essere letale durante lo sviluppo. Questo metodo bypassa questa letalità e fornisce un controllo temporale e spaziale della mutazione/tagging delle proteine accoppiandosi con ceppi di topo Cre-ERT2 specifici del tessuto. Questi tipi di esperimenti sarebbero preziosi per determinare l'effetto di una mutazione in un tessuto specifico e/o in una fase specifica dello sviluppo. È importante sottolineare che permette l'isolamento delle cellule che subiscono una ricombinazione di successo tramite il reporter all'interno della cassetta. Ciò facilita le analisi biochimiche, come la purificazione dell'affinità da tessuti specifici, per isolare l'interoma specifico del tessuto per una determinata proteina. Questo sistema potrebbe essere orientato a monitorare i cambiamenti dinamici in qualsiasi processo cellulare dato, e quindi non è limitato al monitoraggio della formazione del dominio della cromatina.

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Disclosures

D.R. è co-fondatore di Constellation Pharmaceuticals e Fulcrum Therapeutics. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo i dottori L. Vales, D. Ozata e H. Mou per la revisione del manoscritto. Il D.R. Lab è supportato dall'Howard Hughes Medical Institute e dal National Institutes of Health (R01CA199652 e R01NS100897).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

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References

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Genetica Numero 150 PRC2 domini di cromatina H3K27me2 H3K27me3 epigenetica nucleazione diffusione salvataggio inducibile/condizionale.
Un metodo per studiare la formazione de <em>novo</em> dei domini della cromatina
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Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

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