Summary
この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。
Abstract
クロマチンドメインの組織および構造は、個々の細胞系統に固有である。彼らの誤った規制は、細胞同一性および/または病気の損失につながる可能性があります。多大な努力にもかかわらず、クロマチンドメインの形成と伝播に関する我々の理解は依然として限られている。クロマチンドメインは、確立中の最初の事象に従うことを助長しない定常状態条件下で研究されている。ここでは、クロマチンドメインを誘導的に再構築し、時間の関数として再形成する方法を提示する。しかし、最初にPRC2媒介性抑圧クロマチンドメイン形成の場合に適用されるが、それは容易に他のクロマチンドメインに適応することができる。この方法をゲノミクスおよびイメージング技術と組み合わせることで、クロマチンドメインの確立を詳細に研究する貴重なツールが提供されます。この方法は、クロマチンドメインがどのように形成され、相互作用するかについての我々の理解に革命をもたらすと信じています。
Introduction
真核生物ゲノムは高度に組織化されており、クロマチンアクセシビリティの変化は遺伝子転写1を直接制御する。ゲノムには、転写活性および複製タイミング2、3と相関する異なるタイプのクロマチンドメインが含まれている。これらのクロマチンドメインのサイズは数キロベース(kb)から100kb以上の範囲であり、異なるヒストン修飾4の濃縮によって特徴付けられます。中心的な問題は、これらのドメインがどのように形成され、どのように伝播されるかということです。
最もよく特徴付けられたクロマチンドメインの1つは、ポリコム抑圧複合体2(PRC2)の活性を通じて促進される。PRC2は、タンパク質5、6のポリコムグループ(PcG)のサブセットで構成されるマルチサブユニット複合体であり、ヒストンH3(H3K27me1/me2/me3)7、8、リジン27のモノ、ディ、トリメチル化を触媒する。 9,10.H3K27me2/me3は抑圧的なクロマチン状態に関連しているが、H3K27me1の機能は不明6,11である。PRC2のコアコンポーネントの1つである胚性エクトダーム開発(EED)は、その芳香族ケージを介してPRC2触媒、H3K27me3の最終産物に結合し、この特徴はPRC212、13のアロステリック刺激をもたらす。PRC2酵素活性は、特定の系統に対して禁忌である特定の発達遺伝子の不適切な発現が有害であるとして、発達中に細胞同一性を維持するために重要である5,6.したがって、中国が哺乳類における抑圧的なクロマチンドメインの形成を促進するメカニズムを解明することは、細胞同一性を理解する上で根本的に重要である。
PRC2媒介クロマチンドメインを含むクロマチンドメイン形成を調査するように設計された過去の実験システムのすべては、クロマチンドメイン形成の展開イベントを追跡することができない定常状態条件下で行われた。細胞。ここでは、クロマチンドメインの初期募集と伝播を監視する誘導性細胞系を生成するための詳細なプロトコルを提示する。具体的には、H3K27me2/3を含むPRC2媒介性抑圧クロマチンドメインの形成を追跡することに焦点を当てる。クロマチンドメイン形成の機械的詳細を捕捉できるこのシステムは、H2AK119ubまたはH3K9meのいずれかを含む広く研究されたドメインのような他のクロマチンドメインを組み込むことに適合させることができる。ゲノミクスやイメージング技術と組み合わせることで、クロマチン生物学における様々な重要な問題にうまく対処する可能性があります。
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Protocol
誘導性EEDレスキューMESCの生成
1. 細胞培養
- 4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)13の投与時に核に転移することができる安定に統合されたCreERT2トランスジーンを有するフィーダーフリーC57BL/6マウス胚性幹細胞(MESC)を使用する。
- 従来のESC培地14,15でMESCを成長させ、1000 U/mL LIF、1μM ERK阻害剤PD0325901および3μM GSK3阻害剤CHIR99021を補充した。従来のESC培地では、15%の胎児ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1Xペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.1mM 2-メルカプトエタノールを含むノックアウトDMEMを使用する。
- mESCを培養するための0.1%ゼラチン溶液でコーティングされたプレートを使用してください。
2. クローンEEDノックアウト(KO)MESCの生成
- 設計ガイドRNA(gRNA)は、ベンチリング16のCRISPR設計ツールを使用して、MESCでEEDの内因性コピーのエクソン10とエキソン11を削除します。EED-KO-gRNA-1は、エキソン10の直下流のイントロンを標的とし、EED-KO-gRNA-2はエキソン11の直下流のイントロンを標的とする。これらのgRNAの同時適用は、非相同エンド結合(NHEJ)によってExon 10とExon 11の両方を削除する。
- ran et al., 201317.
- 6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を使用して、各EED-KO-gRNA-1およびEED-KO-gRNA-2(材料の表を参照)の1mgを持つトランスフェクト2 x 105 MESCを、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用します。トランスフェクション後にメディアを24時間変更します。
- トランスフェクションの2日後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてGFP陽性細胞を単離する。トランスフェクションの効率は10~30%程度変化すると予想されます。5 x 105セルの周りを並べ替えて、めっきに十分な GFP 陽性細胞をキャプチャします。
- 単離されたGFP陽性MESCを15cmプレートにプレートし、コロニーピッキング用に0.1%ゼラチン(1皿あたり10~20 x 103細胞)をあらかじめコーティングします。
- 単一のコロニーが見えるまで約1週間ESC培地で細胞を成長させる。2 日ごとにメディアを変更します。
- 20 μL マイクロピペットチップを使用して、48個以上のコロニーを選びます。マイクロピペット先端に吸気しながらコロニーの上にこすりつけます。コロニーを単一の細胞に分割しないでください。コロニーをアキュターゼ含有(20mL)96ウェルプレートに移す。
- すべての細胞が解離されるまで、37°Cで10分間コロニーをインキュベートします。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにESCメディアの200 mLを追加します。
- よく混合し、マルチチャンネルピペットを使用して2つの別々の96ウェルプレートに細胞をプレート。
- ジェノタイピングに 96 のウェルプレートのいずれかを使用し、ジェノタイピングが終了するまでもう 1 つを成長させ続けます。DNA抽出溶液を使用して、製造元の指示に従って96ウェルプレートからDNAを抽出します。
- ジェノタイピングプライマーGnt_EED-KO-upとGnt_EED-KO_downを使用して、削除されたサイトにまたがるし、メーカーの指示に従ってTaq DNAポリメラーゼでジェノタイピングPCRを実行します。
注:他のタイプのDNAポリメラーゼもジェノタイピングに使用できますが、着色反応バッファーを使用するとPCR反応をゲルに直接ロードできるため、Taq DNAポリメラーゼは利便性を提供します。- 野生型(WT)の場合に対してホモ接合性欠失を有する細胞における低分子量のDNA産物を観察する。
注:PRC2ヌル細胞を生成するには、コアPRC2 13の必須サブユニットであるEEDを不安定化および分解するために、エキソン10および11のホモ接性欠失が必要である。CRISPRのターゲティング効率は約10%です。
- 野生型(WT)の場合に対してホモ接合性欠失を有する細胞における低分子量のDNA産物を観察する。
- EEDエキソン10および11の欠失と、サンガーシーケンシングおよびウェスタンブロッティングによるEEDタンパク質の喪失をそれぞれ検証する。
- H3K27me2/me3およびEEDに対する抗体を用いたChIP-seqによるEED KO細胞中のクロマチンからのEEDおよびH3K27me2/me3の枯渇を確認する。2017年15月のOksuz et al.で与えられたプロトコルを使用して、ChIP-seq実験を行います。
3. EEDノックアウトMESCをエンジニアリングし、Cre-ERT2ベースの誘導性EED式を保有する
- ベンチリング16のCRISPR設計ツールを用いてEEDのエキソン9に続くイントロン内のカットを導入するgRNA(EED-gRNA誘導性)を設計する(材料の表を参照)。
- ran et al., 201317.
- エキソン9の後にEED cDNA配列を含むドナーテンプレートDNAを設計し、T2A-GFP配列の上流にC末端フラグ-HAタグを、内因性遺伝子配列に対してすべて逆方向に設計する。
- カセットをスプライスアクセプターと、不一葉のloxPサイト(lox66およびlox71)18の間にネストされたポリアデニル化配列で側面にする。
- 両端から少なくとも500 bpの相同兵器を含める。ドナーテンプレートをgBlocks遺伝子断片の2つのセグメントに分割します(gBlock-1、gBlock-2-WT「https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI」およびgBlock-2-ケージ変異体「https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM」を参照)製造元の指示に従ってギブソンのクローンを使用する PCR ブラント ベクトル。
注:gblock-2は、H3K27me312との相互作用に重要なEEDのケージ内に芳香族残基(Y365)を含んでいます。gBlock-2-Wtには野生型残渣が含まれていますが、gblock-2-ケージ変異体にはEED(Y365A)のケージ変異体が含まれており、H3K27me3に結合することができません。誘導性WT EED救助はi-WT-rとして示され、誘導可能なケージ変異体EED救助は便宜上i-MT-rとして示される。
- 6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を用いてgRNA(EED-gRNA誘導性)およびドナーテンプレートの1mg(i-WT-rまたはi-MT-r)を1mgのトランスフェクト2 x 105 MESCをトランスフェクトし、FACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。
- 手順 2.3-2.11 に従って、ターゲティングを成功させるためにジェノタイピングの準備ができている個々のコロニーを分離します。
- 挿入されたカセットにまたがるジェノタイピングプライマー誘導可能_遺伝子型FW-1および誘導可能なジェノタイプ-REV-1を使用し、Taq DNAポリメラーゼを使用してジェノタイピングPCRを実行します。
注: CRISPR のターゲティング効率は約 10% です。- 相同アームの外側にある誘導可能な_遺伝子型-FW-2および誘導可能な_ジェノタイプ-REV-2プライマーを使用して、PCR によるカセットの正しい統合を確認します。
注:カセットのホモ接性統合は、EEDの効率的な救助を達成するために必要です。ホモ接合体を有する細胞は、WT EEDと比較して単一の大きなDNA産物を産生し、短い製品を生成することに注意してください。
- 相同アームの外側にある誘導可能な_遺伝子型-FW-2および誘導可能な_ジェノタイプ-REV-2プライマーを使用して、PCR によるカセットの正しい統合を確認します。
- サンガーシーケンシングによるカセットの統合を確認します。
- カセットの反転とEEDおよびその他のPRC2コアコンポーネント(例えば、EZH2およびSUZ12)の発現を、ウェスタンブロッティングによる4-OHT投与時に確認する。
- T2A-GFPの発現とフローサイトメトリーによるフリップの割合を確認する。なお、GFPの発現はカセットの反転とEEDの発現を示す。
4. クロマチンに対する中国の核化と拡散に続く
- i-WT-r および i-MT-r MESC がフローサイトメトリーによる GFP の漏れやすい発現を持たないことを確認します。GFPの漏れ発現の場合、実験を開始する前にFACSによりGFP陰性細胞を単離する。
- i-WT-r および i-MT-r MESC を 5 つの 15 cm プレート (プレートあたり 5x 106セル) に展開します。
- 0.5mM 4-OHTを0h、12h、24h、36hおよび8日間(条件当たり15cmプレート)の投与によりWTまたはケージ変異EEDの発現を誘導する。12時間を超える治療のために12時間後に培方を変更し、GFPを用いてFACSによって正常に再結合された細胞を分離する。すべての条件が一度に収集されるような治療の時間を調整します。
- H3K27me2,H3K27me3のChIP-seqを実行し、WTまたはケージ変異EEDの再発現に応答してクロマチンへの経時的沈着を調べる。Oksuz et al., 201715.
- 各サンプルでスパイクインコントロールを使用して、異なるタイムポイント19間の定量的な比較を可能にします。
- スパイクインコントロールでは、ショウジョウバエメラノガスター(mESC由来クロマチンに対する1:50比)およびショウジョウバエ特異的H2Av抗体(ドロソフィラクロマチンの4μg当たりH2Av抗体の1μL)を使用します。各サンプルの製造元の指示)。
- Oksuz et al., 201715.
- デフォルトパラメータ20を使用して、Bowtie 2を使用してChIP-seqの読み取りシーケンスをmm10ゲノムにマッピングします。
- ChIP-seqが読み込みしたマウスを正規化して、ショウジョウバエの読み取りカウントを21にする。次の式を使用してスパイクイン正規化係数を計算します: 1 x 106/ユニークなショウジョウバエ読み取りカウント。1 x 106ショウジョウバエ読み取りカウントと 20 x 106マウス読み取り回数を実験ごとに取得することを期待します。
- 入力サンプルをシーケンシングする際には、ショウジョウバエクロマチンを含めません。
- ベッドツールからゲノムコフツールを使用して、bamファイルをベッドグラフ22に変換します。次に、USCS23、24からbedGraphToBigWigツールを使用して、ベッドグラフを bigwig ファイルに変換します。次のスクリプトを参照してください。
gen=「mm10ゲノムへの道」
chr=「mm10染色体サイズへの道」
inp_bam="入力バムファイルへのパス"
乗算=「スパイクイン正規化係数を計算する」
ベッドツールゲノムコフ -bg -スケール $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
並べ替え -k1,1 -k2,2n 出力.bedGraph > 出力ソート.bedGraph
bedGraphToBigWig出力_ソート.bedGraph $chroutput.bw - USCSゲノムブラウザ24にビッグウィッグファイルをアップロードすることにより、ChIP-seq読み取り密度を視覚化します。
5. MESC核におけるH3K27me3病巣の出現と増殖のモニタリング
- プレート1x 104 mESCを8ウェルチャンバースライドに0.1%ゼラチンであらかじめコーティング。
- 翌日、示された時点(0時間、12時間、24時間および36時間)に対してEEDを発現する細胞を集集めるために連続した4-OHT(0.5mM)誘導を行い始める。12時間より長い治療のために12時間後にメディアを変更します。
- 室温(RT)でリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%のパラホルムアルデヒドを4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定します。
- PBS/0.25% トリトンX-100で細胞を透過化し、RTで30分間使用します。
- PBS/5%ロバ血清/0.1%トリトンX-100(ブロッキングバッファー)で30分間RTで細胞をブロックします。
- ブロッキングバッファー中のH3K27me3一次抗体1:500を希釈し、細胞に添加する。
- 一次抗体で細胞を一晩4°Cでインキュベートします。
- 翌日、PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。
- 希釈二次抗体(Alexa fluor 595)1:1000をブロッキングバッファーに含め、細胞に添加する。
- Alexa Fluorと共役した二次抗体は光に敏感であるため、次のステップで暗闇の中ですべてのインキュベーションを実行します。
- RTで2時間二次抗体をインキュベートする。
- PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。
- 希釈 DAPI (1 mg/mL) 1:4000 PBS/0.1% トリトン X-100 と細胞に追加します。
- RTで10分間DAPIで細胞をインキュベートします。
- アクアマウントでセルをマウントします。
- 63倍の倍率で共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。
- ImageJ、フィジー25の分布を使用して画像を処理し、擬似色を付けます。
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Representative Results
条件付き救助システムの一般的なスキーム
図1は、内因性EED遺伝子座から発現されるWTまたはケージ変異体(Y365A)EEDを用いたEED KO細胞を条件付きで救出するターゲティングスキームを示す。その安定性と酵素活性に不可欠なPRC2のコアサブユニットであるEEDをノックアウトした後、EEDのエキソン9に続くイントロン内のカセットが導入される(図1)。カセットは、EEDの残りの3'cDNA配列から構成され、内因性遺伝子配列に対して逆方向である。 カセットは、奇数逆loxPサイト(lox66およびlox71)18によって側面付けされています。細胞は、H3K27me2/3の完全な損失が観察されるまで伝播される。4-OHTを添加してCre組換え発現を活性化すると、カセットは、スプライスアクセプタ配列を用いてエキソン9がカセットにスプライスされるように反転される(図1)。このシステムにより、EED KOセルは、C末端フラグ-HAタグを持つ両方のEEDのWTまたはケージ変異バージョンのいずれかによって救出できるようになりました。ダウンストリーム T2A-GFP は、反転イベントが成功したセルを選択するためのマーカーを提供します。ポリA信号は下流のシーケンスの転写を防ぐ。このシステムにより、PRC2募集の動態とH3K27meドメインの形成が可能になりました。
PRC2媒介H3K27me2/3の経時的堆積の追跡
PRC2媒介クロマチンドメイン確立の時間的ダイナミクスに従うために、EEDのWTまたはケージ変異バージョンは、4-OHT処理時にEED KO細胞の背景に再発現される(図2A,B)。H3K27me2/3マークの堆積に続くため、H3K27me2/me3のChIP-seqは、指定された時間点に対してWTまたはケージ変異EEDを再発現した後に行われる。H3K27me3の出現は、「核化部位」(図2C)として示される離散領域におけるWT EED発現後12時間で観察され、次いで24時間13によって初期核化部位から離れた領域で観察される。最終的に、H3K27me3の分布は、WT EED発現後36時間でWT親細胞に見られるレベルとほぼ同じである。H3K27me3の一時的に確立された下流サイトは「拡散部位」と呼ばれています 13.このシステムは、H3K27me3堆積(図2C,D)の前に見えるH3K27me2の時間的堆積を追跡することもできます。最後に、ケージ変異型EEDの再発現は、WT EED(図2C,D)に対して異なるダイナミクスを示す。この場合、H3K27me3の堆積は非常に非効率的であり、代わりに、H3K27me2が明らかになり、核系部位に集中し、ケージ変異体EEDが隣接領域に改変を広げることができないことを示す。
H3K27me3病巣の出現とその成長は、顕微鏡検査(図2E)13によっても可視化することができる。WT EED発現の誘導前に、H3K27me3染色は明らかではない。しかしながら、WT EED発現の12時間はH3K27me3病巣形成の証拠を示す。これらの病巣は24時間増加し、最終的にはWT EED発現の36時間によって核の大領域に広がる。このシステムは、ChIP-seqおよび免疫蛍光(図2C-E)13によって監視されるPRC2媒介クロマチンドメインのデノボ形成の証拠を与える。
図 1: WT またはケージ mt EED (Y365A) のいずれかを条件付きで EED KO MESCを救出するターゲットスキーム。エキソン10および11の削除は、EEDの不安定化と劣化を引き起こし、H3K27me2/me3のグローバル損失を引き起こす。エキソン9と10の間のイントロン内のカセットは、示されているように逆方向に挿入される。4-OHTの添加は、内因性エキソン9スプライスがカセットのケージ変異体または野生型cDNAにスプライスするようなカセットを反転させ、WTまたはケージ変異体EEDの誘導可能な再発現を可能にする。この図は、Oksuz et al., 201813.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 誘導性EED救助システム(i-WT-rおよびi-MT-r)の検証および代表的な適用。(A) i-WT-rおよびi-MT-rシステムは、4-OHT処理後に全抽出物に示された抗体を用いてウェスタンブロットによって検証され、WT(i-WT-r)またはケージ変異体(i-MT-r)EEDの発現を誘導し、示された時点で示された。(B)i-WT-r細胞におけるGFPのフローサイトメトリー解析(0h)前及び後(36時間)4-OHT処理は、反転カセットの反転の成功を示すT2A-GFPの発現の効率を確認した。(C, D)ChIP-seqは、WTのEmx1遺伝子の近くにあるH3K27me3(C)およびH3K27me2(D)、またはi-WT-rまたはi-MT-r細胞において、4-OHT処理の示された時間について追跡する。ヒストンマークの堆積のための早期および遅延部位が示される。(E)i-WT-r MESCにおけるWT EED発現の救助後0、12、24および36時間におけるH3K27me3抗体を用いた免疫蛍光。36時間での染色は、より低い露光で示される。右端のパネルは、赤い矢印でラベル付けされたセルの拡大表示されたイメージです。この図は、Oksuz et al., 201813.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
特定のクロマチンドメインの形成中に機械的な詳細を理解するための強力なアプローチは、最初にドメインを破壊し、細胞内で進行中のその再構成を追跡することです。プロセスは、再構築中にいつでも一時停止して、進行中のイベントを詳細に分析できます。クロマチンドメインに関する以前の研究では、このような事象を解決することはできず、安定した状態下で行われました(例えば、野生型と遺伝子ノックアウトを比較する)。ここでは、細胞内のPRC2媒介性抑圧ドメインの募集と広がりによって強調されているように、クロマチンドメインの動的形成を評価するシステムを概説する。
この誘導可能なシステムの最も重要なステップは、細胞からのそれぞれの欠失後に所望のタンパク質(またはRNA)を再発現するDNA構築物の正確な設計です。下流のアプリケーションに応じて、これらの構造内に様々な変異、タグ、蛍光マーカーが導入される可能性があります。例えば、GFPの直前に自己切断T2Aペプチドを使用して目的のタンパク質から切り離す代わりに、高解像度イメージングおよび/または単粒子追跡実験のために様々な蛍光融合タンパク質を生成することができ、生細胞におけるクロマチンドメイン形成の初期事象を監視する。
この方法は、クロマチンドメインの形成に関する洞察を提供するために多くの方法で変更することができるが、いくつかの制限がある。まず、Cre-ERT2遺伝子を持つ細胞株が必要です。第二に、4-OHT処理後の時間点を決定するために最適化が必要です。第三に、このシステムは、クロマチンドメインの解体中の事象を監視するようにリバーシブルではない。デグロンベースのメソッドは、ここで説明する方法の代替として使用することができます26,27.これらのシステムは、タンパク質の可逆的かつ迅速な分解を可能にするが、通常、オーキシンまたはシールド26、27などのタンパク質不安定化のための高価な分子を必要とする。さらに、これらのデグロンベースの方法には限界があります。彼らは、その分解後にタンパク質のWTバージョンを再発現するためにのみ使用することができました。対照的に、ここに記載されるシステムは、そのWT対応に加えて目的のタンパク質の変異バージョンの条件式発現を可能にする。このようなデグロン系をここに記載する方法と組み合わせることは、クロマチンドメインの形成を可逆的に調節する強力な手段となるであろう。クロマチンドメインの形成に続く別の方法は、クロマチンから定義されたクロマチン修飾を枯渇させ、その後、修飾のデノボ堆積に続く阻害剤を洗い流すために、特定の阻害剤を使用することを伴う。例えば、EZH2阻害剤およびその後の洗浄による治療は、H3K27meドメイン28の再形成を追跡するために使用される。しかしながら、EZH2阻害剤は、H3K27meを完全に枯渇させるには有効ではなく、治療後7日目であっても有効である。この場合、既存のH3K27meの存在は、PRC212を募集して活性化し、結果の解釈を複雑にする可能性があります。同様に、阻害剤および洗い流し戦略の使用は、多くのクロマチンドメインに対する特異的かつ強力な阻害剤の欠如のために制限される。
この方法を細胞系に適用できることに加えて、動物の所望のタンパク質に対する誘導性変異/タグ付けを生成するために使用することができる。場合によっては、タンパク質を突然変異したり、タグを挿入したりすると、開発中に致命的になる可能性があります。この方法は、この致死性をバイパスし、組織特異的Cre-ERT2マウス株と結合することにより、タンパク質の突然変異/タグ付けの時間的および空間的制御を提供する。これらのタイプの実験は、特定の組織および/または発達の特定の段階における変異の効果を決定するのに有益であろう。重要なことは、カセット内のレポーターを介して正常に組み換えを受ける細胞の単離を可能にする。これにより、特定の組織からのアフィニティ精製などの生化学的分析が容易に、特定のタンパク質に対する組織特異的相互作用を単離します。このシステムは、任意の特定の細胞プロセスにおける動的変化を監視するように設定することができ、したがって、クロマチンドメイン形成の追跡に限定されません。
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Disclosures
D.R.は、コンステレーション医薬品とフルクラム治療薬の共同創設者です。著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
原稿の改訂に感謝します。D.R.ラボは、ハワードヒューズ医学研究所と国立衛生研究所(R01CA199652およびR01NS100897)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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