Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En metode for å studere de Novo dannelse av kromatin Domains

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

Denne metoden er utformet for å følge dannelsen av PRC2-mediert kromatin domener i cellelinjer, og metoden kan tilpasses til mange andre systemer.

Abstract

Organiseringen og strukturen av kromatin domener er unike for individuelle cellelinjene. Deres misregulation kan føre til et tap i mobilnettet identitet og/eller sykdom. Til tross for enorm innsats, er vår forståelse av dannelsen og utbredelsen av kromatin domener fortsatt begrenset. Kromatin-domener har blitt studert under steady-state forhold, som ikke bidrar til å følge de første hendelsene under opprettelsen. Her presenterer vi en metode for å inducibly rekonstruere kromatin domener og følge deres re-formasjon som en funksjon av tid. Selv om, først brukt på saken av PRC2-mediert undertrykkende kromatin domene formasjon, kan det være lett tilpasses andre kromatin domener. Endringen av og/eller kombinasjonen av denne metoden med Genomics og Imaging teknologier vil gi uvurderlig verktøy for å studere etablering av kromatin domener i stor detalj. Vi tror at denne metoden vil revolusjonere vår forståelse av hvordan kromatin domener form og samhandle med hverandre.

Introduction

Eukaryote genomer er svært organisert og endringer i kromatin tilgjengelighet direkte styrer gen transkripsjon1. Det Genova behersker adskilt typer av kromatin domenen, hvilke relatere med transcriptional aktivitet og Replication beregner2,3. Disse kromatin domener varierer i størrelse fra noen kilobases (KB) til mer enn 100 KB og er preget av en berikelse i distinkte histone modifikasjoner4. De sentrale spørsmålene er: hvordan er disse domenene dannet og hvordan er de spredte?

En av de mest godt preget kromatin domener er fostret gjennom aktiviteten til Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2). PRC2 er et multi-delenhet kompleks bestående av en undergruppe av Polycomb gruppen (GF) av proteiner5,6, og katalyserer mono-, di-og trimethylation av lysin 27 av histone H3 (H3K27me1/Me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 er assosiert med en undertrykkende kromatin tilstand, men funksjonen til H3K27me1 er uklart6,11. En av de viktigste komponentene i PRC2, embryonale ektoderm utvikling (EED), binder seg til sluttproduktet av PRC2 katalyse, H3K27me3, gjennom sin aromatiske buret og denne funksjonen resulterer i nukleosid stimulering av PRC212,13. Den PRC2 enzymatisk aktivitet er avgjørende for å bevare mobilnettet identitet under utvikling som upassende uttrykk for visse utviklingsmessige gener som er kontraindisert for en bestemt avstamning, ville være skadelig5,6 . Derfor unraveling mekanismene som PRC2 fremmer dannelsen av undertrykkende kromatin domener i pattedyr er av fundamental betydning for å forstå mobilnettet identitet.

Alle de siste eksperimentelle systemer utviklet for å undersøke kromatin domene formasjon inkludert PRC2-mediert kromatin domener, ble utført under steady-state forhold, som ikke er i stand til å spore de utfolder hendelsene i kromatin domene formasjon i Celler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å generere en induserbart Cellular system som overvåker den første rekruttering og forplantning av kromatin domener. Nærmere bestemt fokuserer vi på å spore dannelsen av PRC2-mediert undertrykkende kromatin domener som omfatter H3K27me2/3. Dette systemet som kan fange opp mekanistisk detaljer om kromatin domene formasjon, kan tilpasses til å innlemme andre kromatin-domener, slik som utbredt studert domener bestående enten H2AK119ub eller H3K9me. I kombinasjon med Genomics og Imaging teknologier, denne tilnærmingen har potensial til å lykkes adresse ulike, viktige spørsmål i kromatin biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Generering av induserbart EED redning mESCs

1. cellekultur

  1. Bruk mater-gratis C57BL/6 mus embryonale stamceller (mESCs) besitter en stabilt integrert CreERT2 transgene, som kan translocate til kjernen ved administrering av 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Grow mESCs i konvensjonelle ESC medium14,15, supplert med 1000 U/ml LIF, 1 μM erk inhibitor PD0325901 og 3 μM GSK3 inhibitor CHIR99021. For konvensjonelle ESC medium, bruk knockout DMEM inneholder 15% fosterets storfe serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penicillin/Streptomycin og 0,1 mM 2-mercaptoethanol.
  3. Bruk plater belagt med 0,1% gelatin løsning for dyrking mESCs.

2. generering av klonal EED knockout (KO) mESCs

  1. Design guide RNAs (gRNAs) for å slette ekson 10 og ekson 11 av endogene kopi av EED i mESCs ved hjelp av CRISPR design verktøyet i Benchling16. EED-KO-gRNA-1 mål Intronets opprinnelse umiddelbart oppstrøms av ekson 10 og EED-KO-gRNA-2 mål Intronets opprinnelse umiddelbart nedstrøms av ekson 11. Samtidige anvendelsen av disse gRNAs sletter både ekson 10 og ekson 11 ved ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ).
  2. Klon gRNAs i pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) ved hjelp av instruksjoner i ran et al., 201317.
  3. I et 6-brønn plateformat transfect 2 x 105 mESCs med 1 mg hver EED-ko-gRNA-1 og EED-ko-gRNA-2 (se tabell over materialer) ved hjelp av transfeksjoner reagens ved å følge produsentens anvisninger. Endre mediet 24 h etter transfeksjoner.
  4. To dager etter transfeksjoner, isolere GFP positive celler ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Forvent transfeksjoner effektivitet å variere rundt 10-30%. Sorter rundt 5 x 105 -celler for å fange tilstrekkelig GFP positive celler for plating.
  5. Plate den isolerte GFP positive mESCs i 15 cm plater pre-belagt med 0,1% gelatin (10-20 x103 celler per plate) for koloni plukking.
  6. Vokse cellene i ESC medium i ca en uke til enkelt kolonier er synlige. Endre Media hver 2 dager.
  7. Velg minimum 48 kolonier med 20 μL micropipette spiss. Skrap over kolonien mens aspirating inn i micropipette spissen. Ikke bryte opp kolonien i enkeltceller. Overfør kolonien til en accutase som inneholder (20 mL) 96 brønn plate.
  8. Ruge koloniene for 10 min ved 37 ° c til alle cellene er dissosiert.
  9. Tilsett 200 mL ESC-medier i hver brønn ved hjelp av flerkanals pipette.
  10. Bland godt og plate cellene i to separate 96 brønn plater ved hjelp av flerkanals pipette.
  11. Bruk en av 96 brønn platene for genotyperingteknologi og hold den andre i vekst til genotyperingteknologi er avsluttet. Bruk DNA-ekstraksjon løsning for å trekke ut DNA fra 96 brønn plate ved å følge produsentens instruksjoner.
  12. Bruk genotyperingteknologi primere Gnt_EED-ko-up og Gnt_EED-KO_down, som spenner over det slettede nettstedet og utfører GENOTYPERINGTEKNOLOGI PCR med Taq DNA polymerase følge produsentens instruksjoner.
    Merk: andre typer DNA-polymerases kan også brukes til genotyperingteknologi, men Taq DNA polymerase tilbyr bekvemmelighet som PCR reaksjonen kan direkte lastes på en gel når den fargede reaksjonsbuffer brukes.
    1. Observer et DNA-produkt av lavere molekylvekt i celler med en homozygote sletting i forhold til den ville-type (WT) saken.
      Merk: for å generere PRC2 nullceller, homozygote sletting av exoner 10 og 11 er nødvendig for å destabilisere og forringe EED, en essensiell delenhet av kjerne PRC213. Den CRISPR målretting effektivitet er rundt 10%.
  13. Valider slettingen av EED ekson 10 og 11 og tap av EED-protein ved henholdsvis sanger sekvensering og vestlig blotting.
  14. Bekrefte tømming av EED og H3K27me2/me3 fra kromatin inne EED KO celler av flis-SEQ benytter Antistoffene imot H3K27me2/me3 og EED. Bruk protokollen som er angitt i Oksuz et al., 201715 for eksperimenter med ChIP-SEQ.

3. engineering EED knockout mESCs å havne grobunn-ERT2 basert induserbart EED uttrykk

  1. Design gRNA (EED-gRNA-induserbart) for å innføre et kutt i Intronets opprinnelse følgende ekson 9 av EED ved hjelp av CRISPR design verktøy i Benchling16 (se tabell over materialer).
  2. Klon gRNAs i pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) ved hjelp av instruksjoner i ran et al., 201317.
  3. Design en donor mal DNA som består av EED cDNA sekvens etter ekson 9 og en C-terminal Flag-HA tag oppstrøms av en T2A-GFP sekvens, alt i revers orientering med hensyn til den endogene genet sekvensen.
    1. Flanke kassetten med en skjøte-Acceptor og en polyadenylation sekvens nestet mellom heterologous invertert loxP nettsteder (lox66 og lox71)18.
    2. Ta med minst 500 BP av homologi armer fra hver ende. Del donor malen i to segmenter av gBlocks gen fragmenter (se gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" og gBlock-2-Cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") og Monter dem i PCR Blunt vektor ved hjelp av Gibson kloning følge produsentens instruksjoner.
      Merk: gblock-2 inneholder en aromatisk rester (Y365) i buret av EED som er viktig for interaksjon med H3K27me312. gBlock-2-WT inneholder vill type rester, mens gBlock-2-Cage-mutant inneholder buret-mutant av EED (Y365A), ute av stand til binding til H3K27me3. Induserbart WT EED redning er betegnet som i-WT-r og induserbart bur-mutant EED redning er betegnet som i-Mt-r for enkelhets skyld.
  4. I en 6-brønn plateformat, transfect 2 x 105 mESCs med 1 mg av GRNA (EED-gRNA-induserbart) og 1 mg av donor maler (i-WT-r eller i-Mt-r) ved hjelp av transfeksjoner reagens og isolere GFP positive celler ved hjelp FACS.
  5. Følg trinn 2.3-2.11 for å isolere enkelt kolonier som er klare for genotyperingteknologi for vellykket målretting.
  6. Bruk genotyperingteknologi primere Inducible_Genotype-FW-1 og Inducible_Genotype-rev-1, som spenner over den innsatte KASSETTEN og utføre genotyperingteknologi PCR ved hjelp av Taq DNA polymerase.
    Merk: målrettings effektiviteten for CRISPR er på rundt 10%.
    1. Bekreft riktig integrering av kassetten ved PCR ved hjelp av Inducible_Genotype-FW-2 og Inducible_Genotype-rev-2 primere, som er utenfor homologi armer.
      Merk: Homozygote integrering av kassetten er nødvendig for å oppnå effektiv redning av EED. Merk at celler med homozygote integrering vil produsere et enkelt stort DNA-produkt sammenlignet med WT EED, som vil produsere et kort produkt.
  7. Bekreft integreringen av kassetten ved sanger sekvensering.
  8. Bekreft vending av kassetten og uttrykk for EED og andre PRC2 kjernekomponenter (f. eks EZH2 og SUZ12) ved 4-OHT administrasjon av vestlig blotting.
  9. Bekreft uttrykket for T2A-GFP og prosent av flip ved flyt flowcytometri. Merk at uttrykk for GFP er en indikasjon på vending av kassetten og uttrykk for EED.

4. etter kjernedannelse og spredning av PRC2 aktivitet på kromatin

  1. Bekreft at i-WT-r og i-MT-r mESCs ikke har Leaky uttrykk for GFP ved flyt flowcytometri. Når det gjelder Leaky uttrykk for GFP, isolere GFP-negative celler ved FACS før eksperimentet.
  2. Utvid i-WT-r og i-MT-r mESCs til 5 15 cm plater (5x 106 celler per plate).
  3. Indusere uttrykk for WT eller bur-mutant EED ved administrering av 0,5 mM 4-OHT for 0 h, 12 h, 24 h, 36 h og 8 dager (1 15 cm plate per tilstand). Endre Media etter 12 h for behandlinger lengre enn 12 h. isolere vellykket saman cellene ved FACS bruker GFP. Juster tiden for behandlingene slik at alle betingelsene samles inn samtidig.
  4. Utfør ChIP-SEQ for H3K27me2, H3K27me3 å undersøke deres timelige avsetning til kromatin som svar på re-uttrykk for WT eller bur-mutant EED. Bruk ChIP-SEQ protokollen inkludert biblioteket forberedelse detaljert i Oksuz et al., 201715.
  5. Bruk toppkontroll i hver prøve for å tillate kvantitativ sammenligning mellom ulike tids punkt19.
    1. For toppkontroll, bruk kromatin fra Drosophila melanogaster (i en 1:50 ratio til mESC-avledet kromatin) samt Drosophila spesifikt H2Av antistoff (1 μL av H2Av antistoff per 4 μg av Drosophila kromatin i henhold til produsentens instruksjoner) i hver prøve.
    2. Forbered kromatin fra Drosophila på en måte som ligner på det fra mESCs bruker protokollen beskrevet i Oksuz et al., 201715.
  6. Kart sekvensen leser for ChIP-SEQ til mm10 Genova med Bowtie 2 bruker standard parametere20.
  7. Normalisere musen ChIP-SEQ leser til Spike-in Drosophila Les teller21. Beregn topp-i normalisering faktor ved hjelp av følgende formel: 1 x 106/Unique Drosophila Les teller. Forvent å få rundt 1 x 106Drosophila lese teller og 20 x 106 mus lese teller per eksperiment.
    1. Ikke ta med Drosophila kromatin ved sekvensering av inn data prøvene.
  8. Bruk genomecov verktøyet fra bedtools å konvertere Bam arkiv i bedgraph22. Neste, konvertere bedgraph i bigwig fil ved hjelp av bedGraphToBigWig verktøyet fra USCS23,24. Se følgende skript:
    Gen = "bane til mm10-Genova"
    Chr = "bane til mm10 kromosom størrelser"
    inp_bam = "bane til inntasting av Bam-fil"
    Multipliser = "beregne Spike-in normalisering faktor"
    bedtools genomecov-BG-skala $multiply-ibam $inp _bam-g $gen > output. bedGraph
    sortere-K1, 1-K2, 2n output. bedGraph > output_sorted. bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw
  9. Visualisere det flis-SEQ lese tettheten av sender det bigwig fil-størrelse på USCS Genova kikker24.

5. overvåking fremveksten og veksten av H3K27me3 fokus i mESCs kjerner

  1. Plate 1x 104 mESCs i 8-brønn kammer lysbilder pre-belagt med 0,1% gelatin.
  2. Neste dag, begynne å utføre påfølgende 4-OHT (0,5 mM) inductions å samle cellene uttrykker EED for indikert tid punkter (0 h, 12 h, 24 h og 36 h). Endre Media etter 12 h for behandlinger lengre enn 12 h.
  3. Fest mESCs med 4% paraformaldehyde i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur (RT) i 10 min.
  4. Permeabilize cellene med PBS/0,25% Triton X-100 ved RT i 30 min.
  5. Blokker cellene med PBS/5% esel serum/0,1% Triton X-100 (blokkerende buffer) ved RT i 30 min.
  6. Fortynne H3K27me3 primære antistoff 1:500 i blokkering buffer og legge til cellene.
  7. Ruge cellene med primær antistoff over natten ved 4 ° c.
  8. Neste dag, Utfør 3 vasker med PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Fortynne sekundære antistoff (Alexa fluor 595) 1:1000 i blokkerings bufferen og legge til celler.
    1. Utfør alle incubations i mørket i følgende trinn som sekundære antistoffer som bøyes likt med Alexa fluor er lysfølsomme.
  10. Ruge det sekundære antistoff for 2 h ved RT.
  11. Utfør 3 vasker med PBS/0.1% Triton X-100.
  12. Fortynne DAPI (1 mg/mL) 1:4000 med PBS/0.1% Triton X-100 og legge til celler.
  13. Ruge cellene med DAPI for 10 min ved RT.
  14. Monter cellene med Aqua Mount.
  15. Bilde cellene med konfokalmikroskopi mikroskopi ved 63X forstørrelse.
  16. Prosess og pseudo-fargebildene ved hjelp av en fordeling av ImageJ, Fiji25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En generell ordning av det betingede rednings systemet
Figur 1 viser målretting ordningen til betinget redning EED ko celler med enten WT eller bur-MUTANT (Y365A) EED som uttrykkes fra den endogene EED geometriske. Etter banket ut EED, en kjerne delenhet av PRC2 som er avgjørende for sin stabilitet og enzymatisk aktivitet, en kassett i Intronets opprinnelse følgende ekson 9 av EED er innført (figur 1). Kassetten består av de resterende 3 ' cDNA sekvensen av EED, i motsatt retning med hensyn til endogene gen sekvensen.  Kassetten er flankert av heterologous invertert loxP nettsteder (lox66 og lox71)18. Cellene overføres til fullstendig tap av H3K27me2/3 er observert. Ved aktivering av grobunn recombinase uttrykk ved tilsetning av 4-OHT, kassetten er invertert slik at ekson 9 er skjøtes inn i kassetten ved hjelp av skjøte Acceptor sekvensen (figur 1). Med dette systemet kan EED KO celler nå bli reddet av enten WT eller bur-mutant versjoner av EED som begge har en C-terminal Flag-HA tag. Den nedstrøms T2A-GFP gir en markør for å velge for celler som gjennomgår en vellykket inversjon hendelse. PolyA-signalet forhindrer transkripsjon av nedstrøms sekvenser. Med dette systemet kan Kinetics av PRC2 rekruttering og dannelse av H3K27me-domener nå følges.

Sporing av Tinning deponering av PRC2-mediert H3K27me2/3
Å følge den timelige dynamikken i PRC2-mediert kromatin domene etablering, den WT eller bur-mutant versjon av EED er re-uttrykt i bakgrunnen av EED KO celler, på 4-OHT behandling (figur 2A, B). Å følge avsetning av H3K27me2/3 merkene, flis-SEQ av H3K27me2/me3 er utført etter re-gjengivelsen av WT eller bur-mutant EED for det angitt tid meningene. Fremveksten av H3K27me3 er observert ved 12 h etter WT EED uttrykk i atskilte områder som er betegnet som "kjerneområder" (figur 2C), og deretter i regioner fjernt fra de første kjerneområder med 24 h13. Til slutt, fordelingen av H3K27me3 nesten tilnærmet at nivået sett i WT foreldrenes celler på 36 h etter WT EED uttrykk. Den timelig etablerte nedstrøms nettsteder av H3K27me3 kalles "sprer steder"13. Dette systemet kan også spore den timelige deponering av H3K27me2, som synes å komme før H3K27me3 deponering (figur 2C, D). Til slutt, re-uttrykk for bur-mutant EED utstillinger ulike dynamikk i forhold til WT EED (figur 2C, D). I dette tilfellet er deponering av H3K27me3 svært ineffektiv, og i stedet blir H3K27me2 tydelig og mer konsentrert på kjerneområdene, noe som indikerer at buret-mutant EED ikke er i stand til å spre endringen til naboregionene.

Fremveksten av H3K27me3 fokus og deres vekst kan også bli visualisere av mikroskopi (figur 2E)13. H3K27me3 farging er ikke synlig før induksjon av WT EED uttrykk. 12 h av WT EED-uttrykket viser imidlertid tegn på H3K27me3 fokus dannelse. Disse fokus øker i antall og størrelse med 24 h, og til slutt spredte seg til store områder av kjernen ved 36 h av WT EED uttrykk. Dette systemet gir bevis for de Novo DANNELSEN av PRC2-mediert kromatin domener som overvåkes av ChIP-SEQ og Immunofluorescence (figur 2C-E)13.

Figure 1
Figur 1 : Målretting ordningen til betinget redning EED ko mESCs enten med WT eller bur-Mt EED (Y365A). Sletting av ekson 10 og 11 forårsaker destabilisering og nedbrytning av EED og globalt tap av H3K27me2/me3. En kassett i Intronets opprinnelse mellom ekson 9 og 10 settes inn i motsatt retning som indikert. Tilsetting av 4-OHT Inverterer kassetten slik at endogene ekson 9 skjøter inn i buret-mutant eller vill type cDNA av kassetten slik at induserbart re-uttrykk for WT eller bur-mutant EED. Dette tallet har blitt modifisert fra Oksuz et al., 201813. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Valideringer og representative anvendelser av INDUSERBART EED rednings systemer (i-WT-r og i-Mt-r). (A). i-WT-r og i-Mt-r systemer blir validert av Western Blot ved hjelp av indikerte antistoffer på hele ekstrakter etter 4-OHT behandling for å indusere uttrykk for WT (i-WT-r) eller bur-mutant (i-Mt-r) EED, på tidspunktet indikert. (B). Flow flowcytometri analyse av GFP i i-WT-r celler før (0 h) og etter (36 h) 4-OHT behandling for å bekrefte effektiviteten av uttrykk for T2A-GFP, som er en indikasjon på vellykket flip av den omvendte kassetten. (C, D). ChIP-SEQ spor for H3K27me3 (C) og H3K27me2 (D) nær Emx1 genet i WT, eller i i-WT-r eller i i-Mt-r celler, for de angitte tider av 4-OHT behandling. Tidlige og utsatte steder for deponering av histone merker er indikert. (E). Immunofluorescence bruker H3K27me3-antistoff ved 0, 12, 24 og 36 h etter redning av WT EED-uttrykk i i-WT-r mESCs. Farging på 36 h er vist ved lavere eksponeringer. Panelet lengst til høyre er et zoomet bilde av cellen merket med en rød pil. Dette tallet har blitt modifisert fra Oksuz et al., 201813. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En mektig tilnærming til å forstå mekanistisk detaljer under dannelsen av et gitt kromatin domene, er først å forstyrre domenet og deretter spore sin rekonstruksjon i fremgang i cellene. Prosessen kan stanses midlertidig når som helst under gjenoppbyggingen for å analysere i detalj hendelsene som pågår. Tidligere studier på kromatin domener var ikke i stand til å løse slike hendelser som de ble utført under steady-state forhold (for eksempel sammenligne vill-type og gen knockout). Her skisserer vi et system for å vurdere den dynamiske dannelsen av kromatin domener, som fremhevet av rekruttering og spredning av PRC2-mediert undertrykkende domener i celler.

Det mest kritiske steget for dette induserbart systemet er den nøyaktige utformingen av DNA-konstruksjoner for å re-uttrykke de ønskede proteiner (eller RNA) etter deres respektive sletting fra cellene. Ulike mutasjoner, koder og fluorescerende markører kan innføres i disse konstruksjoner, avhengig av nedstrøms søknadene. For eksempel, i stedet for å bruke selv-spalte T2A peptid umiddelbart før GFP å koble den fra protein av interesse, kan ulike fluorescerende Fusion proteiner bli generert for høyoppløselig bilde og/eller single-partikkel sporing eksperimenter for å overvåke de første hendelsene i kromatin domene dannelse i levende celler.

Selv om denne metoden kan endres på mange måter å gi innsikt i dannelsen av kromatin domener, har det noen begrensninger. Først, det krever en cellelinje som havner i grobunn-ERT2 genet. For det andre er optimaliseringer nødvendig for å bestemme tids punktene etter 4-OHT behandling. For det tredje er dette systemet ikke reversibel, slik som å overvåke hendelsene under dekonstruksjon av et kromatin domene. Degron-baserte metoder kan brukes som et alternativ til metoden som er beskrevet her26,27. Disse systemene muliggjør reversibel og rask nedbrytning av proteiner, men krever vanligvis kostbare molekyler for protein destabilisering, slik som auxin eller skjold26,27. Videre, disse degron-baserte metoder har begrensninger. De kan bare brukes til å re-uttrykke WT versjon av proteinet etter sin degradering. I kontrast, systemet beskrevet her tillate betinget uttrykk for den muterte versjonen av protein av interesse i tillegg til sin WT motstykke. Kombinere en slik degron system med metoden beskrevet her ville være en kraftig måte å reverserbart modulere dannelse av kromatin domener. En alternativ metode for å følge dannelsen av kromatin domener innebærer bruk av spesifikke hemmere å tømme en definert kromatin modifikasjon fra kromatin og deretter bleke inhibitor å følge de Novo deponering av modifikasjon. For eksempel brukes behandling med EZH2-hemmere og etterfølgende bleke for å spore re-formasjonen av H3K27me domener28. Imidlertid er EZH2 inhibitor ikke effektiv i helt tappe H3K27me, selv 7 dager etter behandling. I dette tilfellet, tilstedeværelsen av pre-eksisterende H3K27me kan rekruttere og aktivere PRC212, og dermed kompliserer tolkning av resultatene. I tillegg er bruken av hemmer og bleke strategien begrenset på grunn av fravær av spesifikke og potente hemmere for mange kromatin domener.

I tillegg til anvendelsen av denne metoden til cellulære systemer, kan den brukes til å generere induserbart mutasjoner/tagging på ønsket proteiner hos dyr. I noen tilfeller kan mutere et protein eller sette inn en kode være dødelig under utvikling. Denne metoden omgår denne dødeligheten og gir en timelig og romlig kontroll av mutasjon/merking av proteiner ved kopling med vev spesifikke grobunn-ERT2 mus stammer. Disse typer eksperimenter vil være verdifullt å fastslå effekten av en mutasjon i et bestemt vev og/eller på et bestemt Stadium i utviklingen. Viktigere, gjør det for isolering av celler som gjennomgår en vellykket rekombinasjon via reporteren i kassetten. Dette forenkler biokjemiske analyser, slik som affinitet rensing fra spesifikke vev, for å isolere den vev-spesifikke interactome for et gitt protein. Dette systemet kan være rettet til å overvåke dynamiske endringer i en gitt cellulær prosess, og dermed er ikke begrenset til sporing kromatin domene formasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.R. er en av grunnleggerne av Constellation Pharmaceuticals og Fulcrum legemiddel selskap. Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker DRS. L. Vales, D. Ozata og H. MoU for revisjon av manuskriptet. Den D.R. Lab støttes av Howard Hughes Medical Institute og National Institutes of Health (R01CA199652 og R01NS100897).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Tags

Genetikk PRC2 kromatin domener H3K27me2 H3K27me3 epigenetikk kjernedannelse spredning induserbart/betinget redning.
En metode for å studere <em>de Novo</em> dannelse av kromatin Domains
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter