Summary
Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.
Abstract
A organização e a estrutura dos domínios da cromatina são exclusivas para linhagens de células individuais. Sua desregulação pode levar a uma perda na identidade celular e/ou doença. Apesar dos esforços enormes, nosso entendimento da formação e propagação dos domínios da cromatina ainda é limitado. Os domínios da cromatina foram estudados em condições de estado estacionário, o que não é propício para seguir os acontecimentos iniciais durante o seu estabelecimento. Aqui, apresentamos um método para reconstruir os domínios da cromatina inducivelmente e seguir sua re-formação em função do tempo. Embora, aplicado primeiramente ao exemplo da formação repressivas PRC2-negociada do domínio da cromatina, poderia facilmente ser adaptado a outros domínios do cromatina. A modificação e/ou a combinação deste método com a genômica e as tecnologias de imagem fornecerá ferramentas inestimáveis para estudar o estabelecimento de domínios de cromatina em grande detalhe. Acreditamos que esse método irá revolucionar nossa compreensão de como os domínios da cromatina se formam e interagem uns com os outros.
Introduction
Os genomas eucarióticos são altamente organizados e as mudanças na acessibilidade da cromatina controla diretamente a transcrição do gene1. O genoma contém tipos distintos de domínios de cromatina, que se correlacionam com a atividade transcricional e o tempo de replicação2,3. Estes domínios da cromatina variam no tamanho de alguns kilobases (KB) a mais de 100 KB e são caracterizados por um enriquecimento em modificações distintas do histona4. As questões centrais são: como esses domínios são formados e como eles são propagados?
Um dos domínios mais bem caracterizados da cromatina é promovido através da atividade do complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 é um complexo de múltiplas subunidades composto por um subconjunto do grupo polycomb (PcG) de proteínas5,6, ecatalisa a mono-, di-e trimetilação de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/ME2/ME3)7,8, 9,10. H3K27me2/ME3 estão associados a um Estado repressivo da cromatina, mas a função de H3K27me1 é obscura6,11. Um dos componentes centrais do PRC2, o desenvolvimento embrionário do ectoderma (EED), liga-se ao produto final da catálise PRC2, H3K27me3, através de sua gaiola aromática e esta característica resulta na estimulação alosterica de PRC212,13. A atividade enzimática PRC2 é crucial para preservar a identidade celular durante o desenvolvimento como a expressão inadequada de certos genes de desenvolvimento que são contraindicados para uma linhagem específica, seria prejudicial5,6 . Assim, desvendar os mecanismos pelos quais o PRC2 promove a formação de domínios de cromatina repressiva em mamíferos é de fundamental importância para a compreensão da identidade celular.
Todos os sistemas experimentais passados projetados investigar a formação do domínio da cromatina que inclui domínios PRC2-negociados da cromatina, foram executados condições de estado estacionário, que são incapazes de seguir os eventos de desdobramento da formação do domínio da cromatina em Células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para gerar um sistema celular induzível que monitora o recrutamento inicial e a propagação de domínios de cromatina. Especificamente, nós nos concentramos em rastrear a formação de domínios de cromatina repressiva mediada por PRC2 que compõem H3K27me2/3. Esse sistema que pode captar os detalhes mecanísticos da formação do domínio da cromatina, pode ser adaptado para incorporar outros domínios da cromatina, como os domínios amplamente estudados, compreendendo H2AK119ub ou H3K9me. Em combinação com a genômica e as tecnologias de imagem, essa abordagem tem o potencial de abordar com sucesso várias questões-chave na biologia da cromatina.
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Protocol
Geração de mESCs induzível do salvamento de eed
1. cultura celular
- Use pilhas de haste embrionárias do rato C57BL/6 livre de alimentador (mESCs) que possuem um transgene CreERT2 estàvel integrado, que possa translocate ao núcleo em cima da administração de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
- Cresça os mESCs no meio ESC convencional14,15, suplementado com 1000 U/ml LIF, inibidor de 1 μm Erk PD0325901 e 3 μm GSK3 inibidor CHIR99021. Para o meio ESC convencional, use DMEM Knockout contendo 15% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicilina/estreptomicina e 0,1 mM 2-Mercaptoetanol.
- Use placas revestidas com 0,1% de solução de gelatina para cultivo de mESCs.
2. geração de clonal EED Knockout (KO) mESCs
- Guia de design RNAs (gRNAs) para excluir exon 10 e exon 11 de cópia endógena de EED em mESCs usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling16. EED-KO-gRNA-1 atinge o intron imediatamente a montante do exon 10 e EED-KO-gRNA-2 atinge o intron imediatamente a jusante de exon 11. A aplicação simultânea destes gRNAs exclui o exon 10 e o exon 11 pela junção de extremidade não-homologous (NHEJ).
- Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 201317.
- Num formato de placa de 6 poços, transfecção 2 x 105 mESCs com 1 mg de cada eed-ko-grna-1 e eed-ko-grna-2 (ver tabela de materiais) utilizando o reagente de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Mude a mídia 24 h após a transfecção.
- Dois dias após o transfection, isolam pilhas positivas de GFP usando a classificação fluorescência-ativada da pilha (FACS). Espere que a eficiência do transfection varie em torno de 10-30%. Classifique em torno de 5 x 105 células para capturar suficiente GFP células positivas para o chapeamento.
- Placa os isolados GFP positivo mESCs em 15 placas do cm pre-Coated com gelatina 0,1% (10-20 X103 pilhas por a placa) para a colheita da colônia.
- Cresça as pilhas no meio do ESC por aproximadamente uma semana até que as únicas colônias sejam visíveis. Mude a mídia a cada 2 dias.
- Escolha um mínimo de 48 colônias usando 20 μL de ponta de micropipeta. Raspe sobre a colônia ao aspirar na ponta da micropipeta. Não quebre a colônia em células simples. Transfira a colônia para uma placa de poço contendo accutase (20 mL) 96.
- Incubar as colônias por 10 min a 37 ° c até que todas as células sejam dissociadas.
- Adicione 200 mL de mídia ESC em cada poço usando pipeta multicanal.
- Misture bem e placa as células em duas placas separadas 96 bem usando pipeta multicanal.
- Use uma das placas de 96 poços para genotipagem e manter o outro crescendo até que a genotipagem seja concluída. Use a solução de extração de DNA para extrair o DNA da placa de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.
- Use os primers de genotipagem Gnt_EED-ko-up e Gnt_EED-KO_down, que abrangem o site excluído e executam a genotipagem PCR com Taq DNA polymerase seguindo as instruções do fabricante.
Nota: outros tipos de DNA polymerases também podem ser usados para genotipagem, no entanto, Taq DNA polimerase oferece conveniência como a reação de PCR pode ser diretamente carregada em um gel quando seu buffer de reação colorida é usado.- Observar um produto de DNA de menor peso molecular em células com um apagamento homozygous relativo ao Wild-Type (WT) caso.
Nota: para gerar PRC2 células nulas, a deleção homozygous de exons 10 e 11 é necessária para destabilizar e degradar EED, uma subunidade essencial do núcleo PRC213. A eficiência de segmentação CRISPR é de cerca de 10%.
- Observar um produto de DNA de menor peso molecular em células com um apagamento homozygous relativo ao Wild-Type (WT) caso.
- Valide a supressão do exon 10 e 11 de EED e da perda de proteína de EED pelo sequenciamento de Sanger e pela mancha ocidental, respectivamente.
- Confirme a depleção de EED e H3K27me2/ME3 de cromatina em células EED KO por ChIP-Seq usando anticorpos contra H3K27me2/ME3 e EED. Use o protocolo dado em Oksuz et al., 201715 para experimentos com chip-Seq.
3. Engenharia de eed Knockout mESCs para abrigar CRE-ERT2 based induzível eed expressão
- Design gRNA (EED-gRNA-inducible) para introduzir um corte dentro do intron seguinte exon 9 de EED usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling16 (ver tabela de materiais).
- Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 201317.
- Projete um ADN modelo doador que compreenda a seqüência do cDNA do EED após o exon 9 e uma etiqueta do C-terminal Flag-HA a montante de uma seqüência do T2A-GFP, tudo na orientação reversa com respeito à seqüência endógena do gene.
- Flanqueando a gaveta com um Splice-Acceptor e uma sequência de poliadenilação aninhada entre os locais de loxP invertidos heterólogos (lox66 e lox71)18.
- Inclua pelo menos 500 BP de braços de homologia de cada extremidade. Divida o molde do doador em 2 segmentos de fragmentos do gene de gBlocks (veja gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-Cage-Mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e monte-os em Vetor de PCR Blunt usando a clonagem de Gibson seguindo as instruções do fabricante.
Nota: gblock-2 contém um resíduo aromático (Y365) dentro da gaiola de EED que é importante para a interação com H3K27me312. gBlock-2-WT contém resíduo tipo selvagem, enquanto gblock-2-Cage-Mutant contém a gaiola-mutante de EED (Y365A), incapaz de ligar a H3K27me3. Induzível WT eed resgate é denotado como i-WT-r e induzível gaiola-mutante eed resgate é denotado como i-MT-r para a conveniência.
- Em um formato da placa de 6 poços, transfecção 2 x 105 mESCs com 1 magnésio do grna (eed-grna-inducible) e 1 magnésio dos moldes do doador (i-WT-r ou i-MT-r) usando o reagente do transfection e isole pilhas positivas do GFP usando FACS.
- Siga as etapas 2.3-2.11 para isolar colônias individuais prontas para genotipagem para direcionamento bem-sucedido.
- Use os primers de genotipagem Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-Rev-1, que abrangem a gaveta inserida e executam a PCR genotipagem usando Taq DNA polymerase.
Nota: a eficiência de segmentação para CRISPR é de cerca de 10%.- Confirme a integração correta da gaveta pelo PCR usando os primers Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-Rev-2 , que são fora dos braços da homologia.
Nota: a integração homozygous da gaveta é necessária para realizar o salvamento eficiente de EED. Anote que as pilhas com integração homozygous produzirão um único produto grande do ADN em comparação ao WT EED, que produzirá um produto curto.
- Confirme a integração correta da gaveta pelo PCR usando os primers Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-Rev-2 , que são fora dos braços da homologia.
- Confirme a integração do cassette pelo sequenciamento de Sanger.
- Confirme a inversão da gaveta e a expressão de EED e outros componentes do núcleo PRC2 (por exemplo, EZH2 e SUZ12) em cima da administração 4-OHT pelo western blotting.
- Confirme a expressão de T2A-GFP e percentual de flip por citometria de fluxo. Observe que a expressão de GFP é indicativa de inversão da gaveta e a expressão de EED.
4. após a nucleação e disseminação da atividade PRC2 na cromatina
- Confirme que os mESCs i-WT-r e i-MT-r não têm expressão com vazamento de GFP por citometria de fluxo. No caso de expressão com vazamento de GFP, isole células GFP-negativas por FACS antes de iniciar o experimento.
- Expanda os mESCs i-WT-r e i-MT-r em placas de 5 15 cm (5x 106 células por placa).
- Induzir a expressão de WT ou Cage-Mutant EED pela administração de 0,5 mM 4-OHT para 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 dias (placa de 1 15 cm por condição). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h. isolar as células recombinadas com êxito por FACS usando GFP. Ajuste o tempo dos tratamentos de forma que todas as condições sejam coletadas de uma só vez.
- Executar ChIP-Seq para H3K27me2, H3K27me3 para investigar o seu depósito temporal para cromatina em resposta à re-expressão de WT ou Cage-Mutant EED. Use o protocolo ChIP-Seq, incluindo a preparação da biblioteca detalhada em Oksuz et al., 201715.
- Use o controle de pico em cada amostra para permitir a comparação quantitativa entre os diferentes pontos temporais19.
- Para o controle de espiga, use a cromatina da Drosophila melanogaster (em uma proporção de 1:50 para a cromatina derivada de mesc), bem como o anticorpo H2Av específico de Drosophila (1 μL de anticorpo H2Av por 4 μg de cromatina de Drosophila de acordo com instruções do fabricante) em cada amostra.
- Prepare a cromatina da Drosophila de forma semelhante à dos mESCs usando o protocolo detalhado em Oksuz et al., 201715.
- Mapeie a seqüência de leituras para ChIP-Seq para mm10 genoma com bowtie 2 usando parâmetros padrão20.
- Normalize o mouse ChIP-Seq lê para Spike-em Drosophila ler contagens21. Calcule o fator de normalização de Spike-in usando a seguinte fórmula: 1 x 106/Unique Drosophila ler contagens. Esperar para obter cerca de 1 x 106Drosophila ler contagens e 20 x 106 mouse ler contagens por experimento.
- Não inclua a cromatina da Drosophila ao sequenciamento das amostras de entrada.
- Use genomecov ferramenta de bedtools para converter arquivo Bam em bedgraph22. Em seguida, converta o bedgraph no arquivo Bigwig usando a ferramenta bedgraphtobigwig de USCS23,24. Consulte o seguinte script:
Gen = "caminho para o genoma mm10"
Chr = "trajeto aos tamanhos do cromossoma mm10"
inp_bam = "caminho para o arquivo Bam de entrada"
Multiply = "calcula o fator de normalização de Spike-in"
bedtools genomecov-BG-Scale $multiply-IBAM $inp _ Bam-g $gen > Output. bedGraph
classificar-K1, 1-K2, 2n output. bedGraph > output_sorted. bedGraph
Método bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw - Visualize as densidades de leitura do ChIP-Seq carregando os arquivos Bigwig no navegador do genoma USCS24.
5. monitoramento da emergência e crescimento dos focos H3K27me3 nos núcleos do mESCs
- Placa 1x 104 mESCs em corrediças de câmara de 8 poços pré-revestidas com 0,1% de gelatina.
- No dia seguinte, começar a realizar 4-OHT consecutivos (0,5 mM) induções para recolher as células expressando EED para pontos de tempo indicados (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h.
- Fixar os mESCs com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (RT) por 10 min.
- Permeabilize as células com PBS/0,25% Triton X-100 em RT por 30 min.
- Bloqueie as células com PBS/5% de burro sérico/0,1% Triton X-100 (buffer de bloqueio) em RT por 30 min.
- Diluir H3K27me3 anticorpo primário 1:500 no buffer de bloqueio e adicionar sobre as células.
- Incubar as células com anticorpo primário durante a noite a 4 ° c.
- No dia seguinte, realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.
- Diluir o anticorpo secundário (Alexa fluor 595) 1:1000 no buffer de bloqueio e adicionar às células.
- Realize todas as incubações no escuro nos seguintes passos como anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor são sensíveis à luz.
- Incubar o anticorpo secundário durante 2 h na RT.
- Realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.
- Diluir DAPI (1 mg/mL) 1:4000 com PBS/0,1% Triton X-100 e adicionar às células.
- Incubar as células com DAPI por 10 min em RT.
- Monte as células com o Aqua Mount.
- Imagem das células com microscopia confocal na ampliação de 63X.
- Processar e pseudocolorir as imagens usando uma distribuição de ImageJ, Fiji25.
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Representative Results
Um esquema geral do sistema de resgate condicional
Figura 1 mostra o esquema de segmentação para resgatar condicionalmente células eed ko com WT ou Cage-Mutant (Y365A) eed que é expressa a partir do locus eed endógeno. Depois de bater para fora EED, uma subunidade de núcleo de PRC2 que é essencial para sua estabilidade e atividade enzimática, uma gaveta dentro do intron que segue o exon 9 de EED é introduzida (Figura 1). A gaveta consiste na sequência de 3 ' cDNA restante de EED, em orientação inversa em relação à sequência genética endógena. A gaveta é ladeada por sítios loxP invertidos heterologosos (lox66 e lox71)18. As células são propagadas até que a perda completa de H3K27me2/3 seja observada. Em cima da ativação da expressão do recombinase de CRE pela adição de 4 OHT, a gaveta é invertida tal que o exon 9 é emendar na gaveta usando a seqüência do Acceptor da tala (Figura 1). Com este sistema, as pilhas de EED KO podem agora ser resgatadas pelo WT ou por versões do Cage-Mutant de EED ambos de que têm uma etiqueta do C-terminal Flag-HA. O downstream T2A-GFP fornece um marcador para selecionar para células que passam por um evento de inversão bem-sucedida. O sinal polyA impede a transcrição de sequências downstream. Com este sistema, a cinética do recrutamento PRC2 e a formação de domínios H3K27me podem agora ser seguidas.
Rastreamento da deposição temporal de H3K27me2/3 mediadas por PRC2
Para seguir a dinâmica temporal do estabelecimento do domínio da cromatina mediada por PRC2, o WT ou a versão Cage-mutante de EED são reexpressos no fundo de pilhas de EED KO, em cima do tratamento 4-OHT (Figura 2A, B). Para seguir a deposição de H3K27me2/3 marcas, ChIP-Seq de H3K27me2/ME3 são executadas após a re-expressão de WT ou Cage-Mutant EED para os pontos de tempo indicados. O surgimento de H3K27me3 é observado aos 12 h após a expressão de WT eed em regiões discretas que são denotadas como "sítios de nucleação" (Figura 2C) e, em seguida, em regiões distantes dos locais de nucleação inicial por 24 h13. Eventualmente, a distribuição de H3K27me3 aproxima quase aquela dos níveis vistos em pilhas de parental do WT em 36 h após a expressão de WT EED. Os locais provisoriamente estabelecidos do downstream de H3K27me3 são denominados "locais espalhando"13. Este sistema também pode rastrear a deposição temporal de H3K27me2, que parece preceder H3K27me3 deposição (Figura 2C, D). Por fim, a re-expressão da EED gaiola-mutante apresenta diferentes dinâmicas em relação ao WT EED (Figura 2C, D). Neste caso, a deposição de H3K27me3 é muito ineficiente e, em vez disso, H3K27me2 torna-se aparente e mais concentrada nos locais de nucleação, indicando que o EED de gaiola-mutante é incapaz de espalhar a modificação para as regiões vizinhas.
O surgimento de H3K27me3 focos e seu crescimento também podem ser visualizados por microscopia (Figura 2e)13. Antes da indução da expressão de WT EED, a coloração H3K27me3 não é aparente. No entanto, 12 h de expressão de WT EED mostra evidência de formação de focos de H3K27me3. Esses focos aumentam em número e tamanho por 24 h e, eventualmente, se espalham para grandes regiões do núcleo por 36 h de expressão de WT EED. Este sistema evidencia a formação de de novo de domínios de cromatina mediada por PRC2 como monitorado por chip-Seq e imunofluorescência (Figura 2C-e)13.
Figura 1 : Esquema de segmentação para resgatar condicionalmente eed ko mESCs ou com WT ou Cage-MT eed (Y365A). O apagamento do exon 10 e 11 causa a desestabilização e a degradação de EED e a perda global de H3K27me2/ME3. Uma gaveta no intron entre o exon 9 e 10 é inserida no sentido inverso como indicado. A adição de 4 OHT inverte a gaveta tal que o exon endógeno 9 emendas no tipo gaiola-mutante ou selvagem cDNA da gaveta permitindo a re-expressão induzível do WT ou da gaiola-mutante EED. Este número foi modificado de Oksuz et al., 201813. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Validações e aplicações representativas de sistemas de resgate induzível eed (i-WT-r e i-MT-r). (A) os sistemas i-WT-r e i-MT-r são validados pelo Western blot usando anticorpos indicados em extratos inteiros após tratamento com 4 OHT para induzir a expressão de WT (i-WT-r) ou Cage-Mutant (i-MT-r) eed, no momento indicado. (B). análise citométrica de fluxo de GFP em células i-WT-r antes (0 h) e após (36 h) 4-OHT tratamento para confirmar a eficiência da expressão de T2A-GFP, que é indicativo de sucesso flip da gaveta invertida. (C, D). Faixas de ChIP-Seq para H3K27me3 (C) e H3K27me2 (D) perto do gene Emx1 no peso, ou em i-WT-r ou em células i-MT-r, para os tempos indicados de tratamento 4-OHT. Os locais adiantados e atrasados para o depósito das marcas do histona são indicados. (E). immunofluorescence usando o anticorpo H3K27me3 em 0, 12, 24 e 36 h após o salvamento da expressão de WT eed em i-WT-r mESCs. A coloração a 36 h é mostrada em exposições inferiores. O painel mais à direita é uma imagem ampliada da célula rotulada com uma seta vermelha. Este número foi modificado de Oksuz et al., 201813. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma abordagem poderosa para entender os detalhes mecanísticos durante a formação de um determinado domínio da cromatina, é primeiro interromper o domínio e, em seguida, rastrear sua reconstrução em andamento dentro das células. O processo pode ser pausado a qualquer momento durante a reconstrução para analisar detalhadamente os eventos em andamento. Estudos prévios sobre os domínios da cromatina não conseguiram resolver tais eventos, pois foram realizados em condições de estado estacionário (por exemplo, comparando o tipo selvagem e o nocaute genético). Aqui, Delineamos um sistema para avaliar a formação dinâmica dos domínios da cromatina, como destacado pelo recrutamento e disseminação de domínios repressivos mediados por PRC2 nas células.
A etapa a mais crítica para este sistema induzível é o projeto exato de construções do ADN para re-Express as proteínas desejadas (ou o RNA) após seu apagamento respectivo das pilhas. Várias mutações, Tags e marcadores fluorescentes podem ser introduzidos dentro dessas construções, dependendo das aplicações downstream. Por exemplo, em vez de usar o peptídeo Self-cleaving T2A imediatamente antes da GFP para desligá-lo da proteína de interesse, várias proteínas de fusão fluorescente podem ser geradas para imagens de alta resolução e/ou experimentos de rastreamento de partículas únicas para monitorar os eventos iniciais da formação de domínio da cromatina em células vivas.
Embora esse método possa ser modificado de várias maneiras para fornecer insights sobre a formação de domínios de cromatina, ele tem algumas limitações. Primeiro, requer uma linha celular que abriga o gene CRE-ERT2. Em segundo lugar, as otimizações são necessárias para determinar os pontos temporais após o tratamento com 4 OHT. Em terceiro lugar, este sistema não é reversível de modo a monitorar os eventos durante a desconstrução de um domínio da cromatina. Métodos baseados em degron poderiam ser usados como uma alternativa ao método descrito aqui26,27. Estes sistemas permitem a degradação reversível e rápida de proteínas, mas geralmente requerem moléculas dispendiosas para desestabilização de proteínas, como auxina ou escudo26,27. Além disso, esses métodos baseados em degron têm limitações. Eles só podiam ser usados para re-expressar a versão WT da proteína após a sua degradação. Em contrapartida, o sistema descrito neste documento permite a expressão condicional da versão mutante da proteína de interesse, além de sua contraparte WT. Combinando tal sistema de degron com o método descrito aqui seria um meio poderoso para modular reversivelmente a formação de domínios de cromatina. Um método alternativo para seguir a formação de domínios da cromatina implica o uso de nervos inibidores específicos para esgotar uma modificação definida da cromatina da cromatina e então washout o inibidor para seguir o depósito de de novo da modificação. Por exemplo, o tratamento com inibidor EZH2 e subsequente washout é usado para rastrear a re-formação de H3K27me domínios28. No entanto, EZH2 inibidor não é eficaz em esgotar completamente H3K27me, mesmo 7 dias após o tratamento. Neste caso, a presença de H3K27me pré-existentes pode recrutar e ativar PRC212, complicando assim a interpretação dos resultados. Também, o uso da estratégia do inibidor e do washout é limitado devido à ausência de nervos inibidores específicos e potentes para muitos domínios da cromatina.
Além da aplicabilidade deste método aos sistemas celulares, pode ser usado para gerar mutações induzível/etiquetar em proteínas desejadas nos animais. Em alguns casos, mutação uma proteína ou inserir uma etiqueta pode ser letal durante o desenvolvimento. Este método ignora esta letalidade e fornece um controle temporal e espacial da mutação/etiquetagem das proteínas acoplando com as tensões específicas do rato do CRE-ERT2 do tecido. Esses tipos de experimentos seriam valiosos para determinar o efeito de uma mutação em um tecido específico e/ou em um estágio específico de desenvolvimento. Importante, ele permite o isolamento de células que passam por uma recombinação bem-sucedida através do repórter dentro do cassette. Isto facilita Análises bioquímicas, tais como a purificação da afinidade dos tecidos específicos, para isolar o de tecido-específico para uma proteína dada. Este sistema poderia ser engrenado para monitorar mudanças dinâmicas em todo o processo celular dado, e daqui não é limitado a formação do domínio da cromatina do seguimento.
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Disclosures
D.R. é co-fundador da Constellation Pharmaceuticals e da Fulcrum Therapeutics. Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos Drs. L. vales, D. Ozata e H. mou a revisão do manuscrito. O laboratório de D.R. é apoiado pelo Instituto médico de Howard Hughes e pelos institutos nacionais da saúde (R01CA199652 e R01NS100897).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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