Summary
Этот метод предназначен для последующего формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина в клеточных линиях, и метод может быть адаптирован ко многим другим системам.
Abstract
Организация и структура доменов хроматина уникальны для отдельных клеточных линий. Их неправильное регулирование может привести к потере клеточной идентичности и/или болезни. Несмотря на огромные усилия, наше понимание формирования и распространения хроматина по-прежнему ограничено. Хроматин домены были изучены в условиях стабильного состояния, которые не способствуют после первоначальных событий во время их создания. Здесь мы представляем метод индуцирования хроматинов доменов и следовать их реформированию как функции времени. Хотя, сперва приложенное к случаю PRC2-опосредованного репрессивного образования домена chromatin, оно смогло легко быть приспособлено к другим доменам хроматина. Модификация и/или сочетание этого метода с геномикой и технологиями визуализации предоставит бесценные инструменты для детального изучения создания доменов хроматина. Мы считаем, что этот метод произведет революцию в нашем понимании того, как хроматины образуют и взаимодействуют друг с другом.
Introduction
Эукариотические геномы хорошо организованы и изменения в доступностихроматина непосредственно контролируют транскрипцию генов 1. Геном содержит различные типы хроматиновых доменов, которые коррелируют с транскрипционной активностью и сроками репликации2,3. Эти хроматиндометы варьируются в размерах от нескольких килобаз (кб) до более чем 100 кб и характеризуются обогащением в различных модификациях гистона4. Главные вопросы: как формируются эти области и как они распространяются?
Один из наиболее хорошо охарактеризованных хроматина доменов поощряется через деятельность Поликомб репрессивного комплекса 2 (КНР2). КНР2 представляет собой многофункциональный комплекс, состоящий из подмножества Polycomb Group (PcG) белков5,6, и катализирует моно-, ди- и триметилирование лизина 27 гистон H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 связаны с репрессивным состоянием хроматина, но функция H3K27me1 неясна6,11. Один из основных компонентов PRC2, эмбрионального развития эктодерма (EED), связывает с конечным продуктом PRC2 катализ, H3K27me3, через его ароматические клетки, и эта функция приводит к аллостерической стимуляции PRC212,13. Ферментативная активность КНР2 имеет решающее значение для сохранения клеточной идентичности во время развития, так какнеуместное выражение определенных генов развития, которые противопоказаны для определенной линии, было бы пагубным 5,6 . Таким образом, распутывание механизмов, с помощью которых КНР2 способствует формированию репрессивных хроматинов у млекопитающих имеет основополагающее значение для понимания клеточной идентичности.
Все прошлые экспериментальные системы, предназначенные для исследования образования доменов хроматина, включая PRC2-опосредованные домены хроматина, были выполнены в условиях устойчивого состояния, которые не в состоянии отслеживать разворачивающиеся события образования доменов хроматина в Клетки. Здесь мы представляем подробный протокол для создания индуцируемой клеточной системы, которая отслеживает первоначальный набор и распространение хроматина доменов. В частности, мы фокусируемся на отслеживании формирования PRC2-опосредованных репрессивных доменов хроматина, которые составляют H3K27me2/3. Эта система, которая может захватить механистические детали образования доменов хроматина, может быть адаптирована для включения других областей хроматина, таких как широко изученные домены, включающие либо H2AK119ub или H3K9me. В сочетании с геномикой и технологиями визуализации, этот подход имеет потенциал для успешного решения различных, ключевых вопросов в биологии хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Поколение индуцируемого EED спасательных mESCs
1. Культура клеток
- Используйте feeder-free C57BL/6 мыши эмбриональных стволовых клеток (mESCs), обладающих застойно интегрированных TransERT2 трансген, который может перемещаться в ядро при администрации 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
- Выращивайте mESCs в обычной среде ESC14,15, дополненный 1000 U/mL LIF, 1 ингибиторОМ ERK PD0325901 и 3 ингибитором ММ GSK3 CHIR99021. Для обычной среды ESC используйте нокаутD-MMEM, содержащий 15% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 мМ L-глютамин, 1X пенициллин/стрептомицин и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол.
- Используйте пластины с покрытием 0,1% желатина раствор для культивирования mESC.
2. Поколение клональных EED нокаут (KO) mESCs
- Дизайн руководство РНК (gRNAs), чтобы удалить Exon 10 и Exon 11 эндогенной копии EED в mESCs с помощью инструмента дизайна CRISPR в Бенчлинг16. EED-KO-gRNA-1 цели интрон сразу вверх по течению exon 10 и EED-KO-gRNA-2 цели интрон непосредственно вниз по течению Exon 11. Одновременное применение этих gRNA удаляет как Exon 10, так и Exon 11 путем негомомного конечного присоединения (NHEJ).
- Клон gRNAs в pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) с использованием инструкций в Ран и др., 201317.
- В формате 6-колодцвой пластины, трансфект 2 х 105 mESCs с 1 мг каждого EED-KO-gRNA-1 и EED-KO-gRNA-2 (см. Таблица материалов) с использованием трансфекционного реагента, следуя инструкциям производителя. Измените медиа2 ч после трансфекции.
- Через два дня после трансфекции изолировать положительные клетки GFP с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией (FACS). Ожидать, что эффективность трансфекции варьироваться около 10-30%. Сортировать около 5 х 105 ячеек, чтобы захватить достаточно ЕФП положительные ячейки для покрытия.
- Плита изолированных GFP положительных mESCs в 15 см пластин предварительно покрытием с 0,1% желатин (10-20 x103 клетки на тарелку) для колонии сбор.
- Выращивайте клетки в среде ESC в течение примерно одной недели, пока не будут видны отдельные колонии. Меняйте средства массовой информации каждые 2 дня.
- Выберите как минимум 48 колоний, используя 20 наконечник микропипетты. Очистите над колонией, а усполивая в микропипетку наконечник. Не разбивайте колонию на единичные камеры. Перенесите колонию в аккутазу-содержащую (20 мл) 96 скважину.
- Инкубировать колонии в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия, пока все клетки не будут разобщены.
- Добавьте 200 мл средств esC в каждую скважину с помощью многоканального пипетка.
- Хорошо перемешайте и раздельно на две отдельные пластины из 96 колодцев с помощью многоканальных пипетков.
- Используйте одну из 96 пластин скважины для генотипирования и держать другие растет до генотипирования не будет заключен. Используйте раствор экстракции ДНК для извлечения ДНК из пластины 96 скважин, следуя инструкциям производителя.
- Используйте генотипирование грунтовки Gnt'EED-KO-Up и Gnt'EED-KO-down, которые охватывают удаленный сайт и выполнять генотипирование ПЦР с полимеразой ДНК Taq следуя инструкциям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы полимеразы ДНК также могут быть использованы для генотипирования, однако, Taq ДНК полимеразы предлагает удобство, как реакция ПЦР может быть непосредственно загружен на гель, когда его цветной буфер реакции используется.- Наблюдайте продукт дна более низкого молекулярного веса в клетках с гомозиготным удалением относительно случая дикого типа (WT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания КНР2 нулевых клеток, гомозиготное удаление экзонов 10 и 11 необходимо дестабилизировать и деградировать EED, существенное подразделение ядра PRC213. Эффективность таргетинга CRISPR составляет около 10%.
- Наблюдайте продукт дна более низкого молекулярного веса в клетках с гомозиготным удалением относительно случая дикого типа (WT).
- Проверить удаление EED экзон 10 и 11 и потеря белка EED Секан секвенирования и западного blotting, соответственно.
- Подтвердите истощение EED и H3K27me2/me3 из хроматина в клетках EED KO с помощью антител против H3K27me2/me3 и EED. Используйте протокол, приведенный в Oksuz et al., 201715 для экспериментов ChIP-seq.
3. Проектирование EED нокаут mESCs гавани Cre-ERT2 на основе индуцируемого eED выражение
- Дизайн gRNA (EED-gRNA-индуцируемых) ввести разрез в пределах интрона после экзон 9 EED с помощью инструмента дизайна CRISPR в Бенчлинг16 (см. Таблица материалов).
- Клон gRNAs в pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) с использованием инструкций в Ран и др., 201317.
- Дизайн донорского шаблона ДНК, который включает в себя EED cDNA последовательность после экзон 9 и C-терминал Флаг-HA тег вверх по течению последовательности T2A-GFP, все в обратной ориентации по отношению к эндогенной последовательности генов.
- Фланк кассеты с сращивания-приемителя и последовательность полиаденилации вложенных между гетерологическими перевернутые локс-сайтов (lox66 и lox71)18.
- Включите по крайней мере 500 bp оружия гомологии с каждого конца. Разделите шаблон донора на 2 сегмента фрагментов гена gBlocks (см. gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" и gBlock-2-клетка-мутант "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") и собрать их в PCR Blunt вектор с использованием клонирования Gibson в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: gblock-2 содержит ароматические остатки (Y365) в клетке EED, что важно для взаимодействия с H3K27me312. gBlock-2-Wt содержит остатки дикого типа, в то время как gblock-2-клетка-мутант содержит клетку-мутант EED (Y365A), неспособную связываться с H3K27me3. Индуцируемое спасение WT EED обозначается как i-WT-r и индуцируемая клетка-мутант EED спасения обозначается как i-MT-r для удобства.
- В 6-колодцном формате пластины, трансфект 2 х 105 mESCs с 1 мг гРНК (EED-gRNA-индуцированных) и 1 мг шаблонов донора (i-WT-r или i-MT-r) с использованием трансфекционного реагента и изолировать G положительные клетки с помощью FACS.
- Выполните шаги 2.3-2.11, чтобы изолировать отдельные колонии, готовые к генотипированию для успешного таргетинга.
- Используйте генотипии праймеры Inducible-Genotype-FW-1 и Inducible-Genotype-REV-1, которые охватывают вставленную кассету и выполняют генотипирование ПЦР с помощью полимеразы Taq ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность таргетинга для CRISPR составляет около 10%.- Подтвердите правильную интеграцию кассеты ПЦР с использованием Индуцируемого генотипа-FW-2 и индуцируемого генотипа-REV-2 праймеров, которые находятся за пределами оружия гомологии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготная интеграция кассеты необходима для эффективного спасения EED. Обратите внимание, что клетки с гомозиготной интеграции будет производить один большой продукт ДНК по сравнению с WT EED, который будет производить короткий продукт.
- Подтвердите правильную интеграцию кассеты ПЦР с использованием Индуцируемого генотипа-FW-2 и индуцируемого генотипа-REV-2 праймеров, которые находятся за пределами оружия гомологии.
- Подтвердите интеграцию кассеты секвенированием Сэнгера.
- Подтвердите листать кассеты и выражение EED и других компонентов PRC2 ядра (например,, E'H2 и SU12) на 4-OHT администрации западного blotting.
- Подтвердите выражение T2A-GFP и процент флип по течению цитометрии. Обратите внимание, что выражение GFP свидетельствует о переворачивании кассеты и выражении EED.
4. После нуклеации и распространения активности КНР2 на хроматин
- Подтвердите, что i-WT-r и i-MT-r mESCs не имеют вытекающей экспрессии GFP по цитометрии потока. В случае вытекающей экспрессии GFP, изолировать GFP-отрицательные ячейки FACS перед началом эксперимента.
- Расширьте i-WT-r и i-MT-r mESCs на пять 15 см пластин (5x 106 ячеек на тарелку).
- Индуцировать экспрессию WT или клетки-мутанта EED путем введения 0.5 mM 4-OHT для 0 h, 12 h, 24 h, 36 h и 8 дней (одна пластина 15 сантиметров в условии). Изменение носителя после 12 ч для лечения дольше, чем 12 ч. Изолировать успешно рекомбинированных клеток FACS с помощью GFP. Отрегулируйте время лечения так, чтобы все условия были собраны сразу.
- Выполните ChIP-seq для H3K27me2, H3K27me3, чтобы исследовать их височные осаждения хроматина в ответ на повторное выражение WT или клетки-мутант EED. Используйте протокол ChIP-seq, включая подготовку библиотеки, подробно описанные в Oksuz et al., 201715.
- Используйте контроль с шипами в каждой выборке, чтобы обеспечить количественное сравнение между различными точками времени19.
- Для контроля шипов, используйте хроматин из Drosophila melanogaster (в соотношении 1:50 к chromatin, полученным mESC), а также drosophila специфические антитела H2Av (1 Л антител H2Av на 4 мкг дрозофилы хроматина в соответствии с инструкции производителя) в каждом образце.
- Подготовка хроматина из Дрозофилы таким же образом, как от mESCs с использованием протокола, подробно описанного в Oksuz и др., 201715.
- Карта последовательности читает для ChIP-seq к mm10 геном а также Bowtie 2 с использованием параметров по умолчанию20.
- Нормализация мыши ChIP-seq читает шип в Drosophila читать рассчитывает21. Рассчитайте коэффициент нормализации с шипами, используя следующую формулу: 1 x 106/уникальная дрозофила считывает. Ожидать, чтобы получить около 1 х 106Drosophila читать рассчитывает и 20 х 106 мышь читать рассчитывает за эксперимент.
- Не включайте дрозофила хроматин при секвенировании входных образцов.
- Используйте инструмент genomecov от bedtools для преобразования файла бам в bedgraph22. Далее, преобразовать кровать в Bigwig файл с помощью bedGraphToBigWig инструмент от USCS23,24. Смотрите следующий сценарий:
gen'"путь к геному mm10"
chr'"путь к мм10 хромосомразмерных размеров"
inp'bam'"путь к вхотвому файлу бам "
умножить »вычислить фактор нормализации шипа в»
bedtools genomecov-bg-scale $multiply -ibam $inp'bam -g $gen
сортировка -k1,1 -k2,2n output.bedGraph
bedGraphToBigWig output'sorted.bedGraph $chr output.bw - Визуализируйте ChIP-seq читать плотности, загрузив Bigwig файлы на браузере генома USCS24.
5. Мониторинг появления и роста очагов H3K27me3 в ядрах mESC
- Плита 1x 104 mESCs в 8-колодцкамеры слайды предварительно покрытием с 0,1% желатина.
- На следующий день начните выполнять последовательные индукции 4-OHT (0,5 мм), чтобы собрать клетки, выражающие EED для указанных временных точек (0 ч, 12 ч, 24 ч и 36 ч). Изменение носителя после 12 ч для лечения дольше, чем 12 ч.
- Исправьте mESCs с 4% параформальдегидом в фосфатно-буферном сольнике (PBS) при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин.
- Пермяки клетки с PBS/0.25% Тритон X-100 на RT в течение 30 мин.
- Блокклетки с PBS/5% сыворотки осла / 0,1% Тритон X-100 (блокирующий буфер) на RT в течение 30 минут.
- Разбавить H3K27me3 первичного антитела 1:500 в блокирующем буфере и добавить на клетки.
- Инкубировать клетки с первичными антителами на ночь при 4 градусах Цельсия.
- На следующий день выполните 3 смая с PBS/0.1% Triton X-100.
- Разбавить вторичные антитела (Alexa fluor 595) 1:1000 в блокирующем буфере и добавить на клетки.
- Выполните все инкубационные работы в темноте в следующих шагах, как вторичные антитела, спряженные с Alexa Fluor светочувствительны.
- Инкубировать вторичное антитело в течение 2 ч на RT.
- Выполните 3 ямы с PBS/0.1% Triton X-100.
- Разбавить DAPI (1 мг/мл) 1:4000 с PBS/0,1% Triton X-100 и добавить на клетки.
- Инкубировать клетки с DAPI в течение 10 минут на RT.
- Смонтировать клетки с aqua горе.
- Изображение клеток с конфокальной микроскопией при увеличении 63X.
- Процесс и псевдо-цвет изображения с помощью распределения ImageJ, Фиджи25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая схема условной спасательной системы
На рисунке 1 показана схема таргетинга для условного спасения клеток EED KO с помощью WT или клетки-мутанта (Y365A) EED, который выражается в эндогенном локусе EED. После выбивания EED, основной подразделение PRC2, что имеет важное значение для его стабильности и ферментативной деятельности, кассета в интрон следующие экзон 9 EED вводится (Рисунок 1). Кассета состоит из оставшейся 3'cDNA последовательности EED, в обратной ориентации по отношению к эндогенной последовательности генов. Кассета окружена гетерологическими перевернутыми локс-сайтами (lox66 и lox71)18. Клетки размножаются до полной потери H3K27me2/3 наблюдается. При активации cre рекомбиназы выражение добавлением 4-OHT, кассета инвертируется таким образом, что экзон 9 сращивается в кассету с помощью последовательности сращивания приемок (Рисунок 1). С помощью этой системы, EED KO клетки теперь могут быть спасены либо WT или клетки-мутант версии EED оба из которых имеют C-терминал флаг-HA тег. Вниз по течению T2A-GFP обеспечивает маркер для выбора для ячеек, которые проходят успешное событие инверсии. Сигнал polyA предотвращает транскрипцию вниз по течению последовательностей. С помощью этой системы, кинетика НАБОРА PRC2 и формирование доменов H3K27me теперь можно следовать.
Отслеживание временного осаждения PRC2-опосредованного H3K27me2/3
Чтобы следовать временной динамике PRC2-опосредованного хроматина домена создания, WT или клетка-мутант версия EED вновь выражается в фоновом режиме EED KO клеток, на 4-OHT лечения(Рисунок 2A, B). Чтобы следить за осаждением h3K27me2/3 марок, ChIP-seq H3K27me2/me3 выполняется после повторного выражения WT или клетки-мутантE EED для указанных точек времени. Появление H3K27me3 наблюдается на 12 ч после wT EED выражение в дискретных регионах, которые обозначаются как "нуклеации сайтов"(рисунок 2C), а затем в регионах, удаленных от начальных участков ядер 24 ч13. В конце концов, распределение H3K27me3 почти приблизительно, что из уровней видели в ВТ родительских клеток на 36 ч после wT EED выражение. Временно установленные вниз по течению сайты H3K27me3 называются "распространяющимися сайтами"13. Эта система может также отслеживать височные осаждения H3K27me2, который, как представляется, предшествует H3K27me3 осаждения(Рисунок 2C,D). Наконец, повторное выражение клетки-мутант EED экспонатов различные динамики по отношению к WT EED(Рисунок 2C,D). В этом случае осаждение H3K27me3 является очень неэффективным и вместо этого, H3K27me2 становится очевидным и более концентрированным в нуклеации сайтов, что свидетельствует о том, что клетка-мутант EED не в состоянии распространить модификацию в соседних регионах.
Появление очагов H3K27me3 и их рост также могут быть визуализированы с помощью микроскопии(рисунок 2E)13. До индукции экспрессии WT EED, окрашивание H3K27me3 не очевидно. Тем не менее, 12 ч выражения WT EED показывает свидетельство образования foci H3K27me3. Эти очаги увеличиваются в количестве и размере на 24 ч и в конечном итоге распространяются на большие области ядра на 36 ч экспрессии WT EED. Эта система свидетельствует о де Ново формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина, как контролируется CHIP-seq и иммунофлуоресценции (Рисунок 2C-E)13.
Рисунок 1 : Целевая схема условно спасти EED KO mESCs либо с WT или клетки-mt EED (Y365A). Удаление экзона 10 и 11 вызывает дестабилизацию и деградацию EED и глобальную потерю H3K27me2/me3. Кассета в интроне между экзоном 9 и 10 вставляется в обратном направлении, как указано. Добавление 4-OHT инвертирует кассету таким образом, что эндогенные экзон 9 сращивания в клетку-мутант или дикий тип кДНК кассеты позволяет индуцируемого редуктора WT или клетки-мутант EED. Эта цифра была изменена с Oksuz и др., 201813. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Валидации и репрезентативные применения индуцированных спасательных систем EED (i-WT-r и i-MT-r). (A). i-WT-r и i-MT-r системы проверяются Западной пятно с использованием указанных антител на целом экстракты после 4-OHT лечения, чтобы вызвать выражение WT (i-WT-r) или клетки-мутант (i-MT-r) EED, в момент указано. (B) Анализ цитометрии потока GFP в клетках i-WT-r до (0 h) и после (36 h) 4-OHT обработки для подтверждать эффективность выражения T2A-GFP, который свидетельствует успешно сальто перевернутой кассеты. (C, D). ChIP-seq треки для H3K27me3 (C) и H3K27me2 (D) вблизи гена Emx1 в WT, или в i-WT-r или в клетках i-MT-r, для указанного времени 4-OHT лечения. Показаны ранние и отложенные участки для осаждения следов гистона. (E). Иммунофлуоресценция с использованием h3K27me3 антитела на 0, 12, 24 и 36 ч после спасения WT EED выражение в i-WT-R mESCs. Окрашивание при 36 ч показано при более низких воздействиях. Самая правая панель представляет собой увеличенное изображение ячейки, помеченной красной стрелкой. Эта цифра была изменена с Oksuz и др., 201813. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мощный подход к пониманию механистических деталей во время формирования данного домена хроматина, заключается в том, чтобы сначала нарушить домен, а затем отслеживать его реконструкцию в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время во время реконструкции, чтобы детально проанализировать происходящие события. Предыдущие исследования по области хроматина не могли разрешить такие события, поскольку они проводились в условиях стабильного состояния (например, сравнение дикого типа и генного нокаута). Здесь мы намечаем систему оценки динамического формирования хроматина доменов, о чем свидетельствует вербовка и распространение репрессивных доменов при посредничестве КНР в ячейках.
Наиболее важным шагом для этой индуцируемой системы является точный дизайн конструкций ДНК для повторного выражения желаемых белков (или РНК) после их удаления из клеток. Различные мутации, метки и флуоресцентные маркеры могут быть введены в этих конструкциях, в зависимости от приложений вниз по течению. Например, вместо того, чтобы использовать саморасклеивающийся пептид T2A непосредственно перед GFP, чтобы отключить его от интересующего белка, различные флуоресцентные белки могут быть созданы для визуализации с высоким разрешением и/или одночастицисных экспериментов по отслеживанию контролировать начальные события образования доменов хроматина в живых клетках.
Хотя этот метод может быть изменен во многих отношениях, чтобы дать представление о формировании доменов хроматина, он имеет некоторые ограничения. Во-первых, она требует клеточной линии, которая таит в себе ген Cre-ERT2. Во-вторых, оптимизация необходима для определения временных точек после 4-OHT лечения. В-третьих, эта система не обратима, чтобы отслеживать события во время деконструкции хроматина домена. Методы на основе Degron могут быть использованы в качестве альтернативы описанной здесь методу26,27. Эти системы позволяют обратимой и быстрой деградации белков, но обычно требуют дорогостоящих молекул для дестабилизации белка, таких как auxin или щит26,27. Кроме того, эти методы, основанные на дегроне, имеют ограничения. Они могут быть использованы только для повторного выражения Версии WT белка после его деградации. В отличие от этого, система, описанная в данном проекте, позволяет условно выражать мутантную версию интересующейся белка в дополнение к его аналогу WT. Сочетание такой системы дегронов с описанным здесь методом было бы мощным средством для обратной модулировать образование хроматинов. Альтернативный метод для следующих образования хроматина доменов влечет за собой использование конкретных ингибиторов для истощения определенной модификации хроматина из хроматина, а затем вымыть ингибитор следовать de novo осаждения модификации. Например, для отслеживания переформирования доменов H3K27me28используется лечение ингибитором E-H'2 и последующее вымывание. Тем не менее, ингибитор E'H'2 не эффективен в полностью истощении H3K27me, даже через 7 дней после лечения. В этом случае наличие уже существующих H3K27me может завербовать и активировать PRC212,тем самым усложняя интерпретацию результатов. Кроме того, использование ингибитора и стратегии вымывания ограничено из-за отсутствия специфических и мощных ингибиторов для многих областей хроматина.
В дополнение к применимости этого метода к клеточным системам, он может быть использован для генерации индуцирующих мутаций / пометки на желаемых белков у животных. В некоторых случаях мутация белка или вставка тега может быть смертельной во время развития. Этот метод обходит эту летальность и обеспечивает временный и пространственный контроль мутации / пометки белков путем соединения с тканью конкретных штаммов мыши Cre-ERT2. Эти типы экспериментов были бы полезны для определения влияния мутации в определенной ткани и/или на определенной стадии развития. Важно отметить, что это позволяет для изоляции клеток, которые проходят успешную рекомбинацию через репортера в кассете. Это облегчает биохимический анализ, такие как очищение сродства от конкретных тканей, чтобы изолировать ткани конкретных interactome для данного белка. Эта система может быть направлена на мониторинг динамических изменений в любом процессе клеток, и, следовательно, не ограничивается отслеживанием образования доменов хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д.Р. является соучредителем Constellation Pharmaceuticals и Fulcrum Therapeutics. Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Л. Валеса, Д. Озата и Х. Моу за пересмотр рукописи. D.R. Lab поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза и Национальными институтами здравоохранения (R01CA199652 и R01NS100897).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
