Summary
Denna metod är utformad för att följa bildandet av PRC2-medierade kromatin domäner i cellinjer, och metoden kan anpassas till många andra system.
Abstract
Organisationen och strukturen av kromatin domäner är unika för enskilda celllineages. Deras felaktig kan leda till en förlust i cellulära identitet och/eller sjukdom. Trots enorma ansträngningar, vår förståelse av bildandet och spridningen av kromatin domäner är fortfarande begränsad. Kromatin domäner har studerats under steady-state villkor, som inte bidrar till att följa de inledande händelserna under sin etablering. Här presenterar vi en metod för att inducibly rekonstruera kromatin domäner och följa deras re-formation som en funktion av tiden. Även om, först tillämpas på fallet med PRC2-medierade repressiva kromatin domän formation, det kan lätt anpassas till andra kromatin domäner. Modifieringen av och/eller kombinationen av denna metod med Genomics och Imaging Technologies kommer att ge ovärderliga verktyg för att studera inrättandet av kromatin domäner i detalj. Vi tror att denna metod kommer att revolutionera vår förståelse för hur kromatin domäner form och interagera med varandra.
Introduction
Eukaryota genom är mycket organiserad och förändringar i kromatin Accessibility direkt styr gentranskription1. Genomet innehåller olika typer av kromatin domäner, som korrelerar med transkriptionell aktivitet och replikering timing2,3. Dessa kromatin domäner varierar i storlek från några kilobases (KB) till mer än 100 KB och kännetecknas av en berikning i distinkta Histon ändringar4. De centrala frågorna är: hur bildas dessa domäner och hur sprids de?
En av de mest välkarakteriserade kromatin domänerna främjas genom aktiviteten av Polycomb repressiva Complex 2 (PRC2). PRC2 är en multi-subunit komplex består av en delmängd av polycomb gruppen (PCG) av proteiner5,6, och katalyserar mono-, di-och trimetylering av lysin 27 av Histon H3 (H3K27me1/ME2/ME3)7,8, 9,10. H3K27me2/ME3 är förknippade med en repressiv kromatin tillstånd, men funktionen av H3K27me1 är oklart6,11. En av de viktigaste komponenterna i PRC2, embryonal ektoderm utveckling (Eed), binder till slutprodukten av PRC2 katalys, H3K27me3, genom sin aromatiska bur och denna funktion resulterar i Alloster stimulering av PRC212,13. Den PRC2 enzymatiska aktiviteten är avgörande för att bevara cellulära identitet under utvecklingen som olämpligt uttryck för vissa utvecklingsgener som är kontraindicerat för en viss härstamning, skulle vara skadligt5,6 . Därför, reda ut de mekanismer genom vilka PRC2 främjar bildandet av repressiva kromatin domäner hos däggdjur är av grundläggande betydelse för att förstå cellulära identitet.
Alla de tidigare experimentella system för att undersöka kromatin domän formation inklusive PRC2-medierad kromatin domäner, utfördes under steady-state villkor, som inte kan spåra de pågående händelserna i kromatin domän formation i Celler. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att generera en inducerbara cellulära system som övervakar den inledande rekryteringen och spridningen av kromatin domäner. Specifikt fokuserar vi på att spåra bildandet av PRC2-medierade repressiva kromatin domäner som utgör H3K27me2/3. Detta system som kan fånga de mekanistiska detaljerna i kromatin domän formation, kan anpassas för att införliva andra kromatin domäner, såsom de allmänt studerade domäner som omfattar antingen H2AK119ub eller H3K9me. I kombination med genomik och Imaging Technologies, denna strategi har potential att framgångsrikt ta itu med olika, viktiga frågor i kromatin biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generering av inducerbara EED Rescue mESCs
1. cell odling
- Använd matar fria C57BL/6-möss embryonala stamceller (mESCs) som har en stabilt integrerad CreERT2 Transgene, som kan translocate till kärnan vid administrering av 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
- Odla mescs i konventionella ESC-medium14,15, kompletterat med 1000 U/ml lif, 1 μm erk-hämmare PD0325901 och 3 μm GSK3-hämmare CHIR99021. För konventionella ESC-medium, Använd knockout DMEM som innehåller 15% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penicillin/streptomycin och 0,1 mM 2-merkaptoetanol.
- Använd plattor belagda med 0,1% gelatin lösning för odling mESCs.
2. generering av klonala EED knockout (KO) mESCs
- Design Guide RNAs (gRNAs) för att radera exon 10 och exon 11 av endogen kopia av EED i mESCs med hjälp av CRISPR design Tool i Benchling16. EED-KO-gRNA-1 riktar intron omedelbart uppströms exon 10 och EED-KO-gRNA-2 riktar sig intron omedelbart nedströms exon 11. Samtidig tillämpning av dessa gRNAs tar bort både exon 10 och exon 11 genom icke-homolog sammanfogning (NHEJ).
- Klona gRNAs till pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) med instruktioner i ran et al., 201317.
- I ett 6-bra plattformat, transfect 2 x 105 mescs med 1 mg varje Eed-Ko-grna-1 och Eed-Ko-grna-2 (se tabell över material) med hjälp av transfektionsreagens genom att följa tillverkarens instruktioner. Ändra Media 24 h efter transfektion.
- Två dagar efter transfektion, isolera GFP positiva celler med Fluorescensaktiverad cell sortering (FACS). Räkna med att transfektionseffektiviteten varierar runt 10-30%. Sortera runt 5 x 105 celler för att fånga tillräckligt GFP positiva celler för plätering.
- Platta den isolerade GFP positiva mESCs i 15 cm plattor pre-belagda med 0,1% gelatin (10-20 X103 celler per tallrik) för koloni plockning.
- Odla cellerna i ESC-medium i ungefär en vecka tills enstaka kolonier är synliga. Ändra mediet var 2: a dag.
- Välj minst 48 kolonier med 20 μL mikropipettspets. Skrapa över kolonin medan aspirera i mikropipettspetsen. Bryt inte upp kolonin i enstaka celler. Överföra kolonin till en accutase-innehållande (20 mL) 96 väl tallrik.
- Inkubera kolonierna i 10 min vid 37 ° c tills alla celler dissocieras.
- Tillsätt 200 mL ESC-media i varje brunn med Multichannel-pipett.
- Blanda väl och platta cellerna i två separata 96 väl plattor med Multichannel pipett.
- Använd en av 96 väl plattor för genotypning och hålla den andra växer tills genotypning avslutas. Använd DNA-extraktion lösning för att extrahera DNA från 96 väl plattan genom att följa tillverkarens anvisningar.
- Använd genotypning primers Gnt_EED-Ko-up och Gnt_EED-KO_down, som spänner över den borttagna webbplatsen och utför genotypning PCR med Taq DNA polymeras enligt tillverkarens anvisningar.
Notera: andra typer av DNA-polymeraser kan också användas för genotypning, men Taq DNA polymeras erbjuder bekvämlighet eftersom PCR-reaktionen direkt kan lastas på en gel när dess färgade reaktionsbuffert används.- Observera en DNA-produkt av lägre molekylvikt i celler med en homozygot radering i förhållande till Wild-Type (WT) fall.
Anmärkning: för att generera PRC2 null celler, homozygot borttagande av exonerna 10 och 11 är nödvändigt att destabilisera och försämra Eed, en viktig subenhet av Core PRC213. CRISPR-inriktningen är cirka 10%.
- Observera en DNA-produkt av lägre molekylvikt i celler med en homozygot radering i förhållande till Wild-Type (WT) fall.
- Validera borttagningen av EED exon 10 och 11 och förlusten av EED protein genom Sanger sekvensering och Western blotting, respektive.
- Bekräfta utarmningen av EED och H3K27me2/ME3 från kromatin i EED KO-celler med ChIP-SEQ med antikroppar mot H3K27me2/ME3 och EED. Använd protokollet som ges i Oksuz et al., 201715 för chip-SEQ experiment.
3. Engineering den Eed knockout mescs till Harbor CRE-ERT2 baserat inducerbara Eed uttryck
- Design gRNA (EED-gRNA-inducible) att införa ett snitt inom intron efter exon 9 av EED med hjälp av CRISPR design Tool i Benchling16 (se tabell över material).
- Klona gRNAs till pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) med instruktioner i ran et al., 201317.
- Designa en givarmall DNA som omfattar EED cDNA sekvens efter exon 9 och en C-Terminal flagga-HA tagg uppströms en T2A-GFP sekvens, alla i omvänd orientering med avseende på endogena gensekvens.
- Flanera kassetten med en splice-acceptor och en polyadenylation sekvens kapslas mellan heterologa inverterade loxP platser (lox66 och lox71)18.
- Inkludera minst 500 BP av homologi armar från varje ände. Dela upp givar mal len i två segment av gBlocks gen fragment (se gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" och gBlock-2-Cage-Mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") och montera dem i PCR Blunt Vector med hjälp av Gibson kloning enligt tillverkarens anvisningar.
Anmärkning: gblock-2 innehåller en aromatisk rester (Y365) i bur av EED som är viktigt för interaktion med H3K27me312. gBlock-2-WT innehåller vildtyp rester, medan gblock-2-Cage-Mutant innehåller bur-Mutant av EED (Y365A), oförmögen att binda till H3K27me3. Inducerbar WT Eed Rescue betecknas som i-WT-r och inducerbara Cage-Mutant Eed Rescue betecknas som i-MT-r för enkelhetens skull.
- I en 6-väl tallrik format, transfect 2 x 105 mescs med 1 mg av GRNA (Eed-grna-inducible) och 1 mg av donator mallar (i-WT-r eller i-MT-r) med hjälp av transfektion reagens och isolera GFP positiva celler med FACS.
- Följ steg 2.3-2.11 för att isolera enskilda kolonier som är klara för genotypning för lyckad inriktning.
- Använd genotypning primers Inducible_Genotype-FW-1 och Inducible_Genotype-Rev-1, som spänner över den insatta kassetten och utföra genotypning PCR med Taq DNA-polymeras.
Observera: inriktnings effektiviteten för CRISPR är cirka 10%.- Bekräfta korrekt integrering av kassetten med PCR med Inducible_Genotype-FW-2 och Inducible_Genotype-rev-2 primers, som är utanför homologi armar.
Anmärkning: homozygot integration av kassetten är nödvändig för att åstadkomma effektiv räddning av EED. Observera att celler med homozygot integration kommer att producera en enda stor DNA-produkt jämfört med WT EED, som kommer att producera en kort produkt.
- Bekräfta korrekt integrering av kassetten med PCR med Inducible_Genotype-FW-2 och Inducible_Genotype-rev-2 primers, som är utanför homologi armar.
- Bekräfta integrationen av kassetten med Sanger sekvensering.
- Bekräfta vändning av kassetten och uttrycket av EED och andra PRC2 kärnkomponenter (t. ex. EZH2 och SUZ12) vid 4-OHT administrering av Western blotting.
- Bekräfta uttrycket av T2A-GFP och procent av vänd flödescytometri. Observera att uttrycket av GFP är indikativt för vändning av kassetten och uttrycket av EED.
4. efter nukleation och spridning av PRC2 aktivitet på kromatin
- Bekräfta att i-WT-r och i-MT-r mESCs inte har läckande uttryck av GFP med flödescytometri. När det gäller läckande uttryck av GFP, isolera GFP-negativa celler med FACS innan experimentet.
- Expandera i-WT-r och i-MT-r mESCs till 5 15 cm plattor (5x 106 celler per tallrik).
- Inducera uttryck av WT eller bur-Mutant EED genom administrering av 0,5 mM 4-OHT för 0 h, 12 h, 24 h, 36 h och 8 dagar (1 15 cm tallrik per skick). Ändra media efter 12 h för behandlingar längre än 12 h. isolera de framgångsrikt rekombinerat cellerna genom FACS med GFP. Justera tiden för behandlingarna så att alla villkor samlas på en gång.
- Utför ChIP-SEQ för H3K27me2, H3K27me3 att undersöka deras temporala avsättning till kromatin som svar på nytt uttryck av WT eller Cage-Mutant EED. Använd ChIP-SEQ protokoll inklusive bibliotek beredning beskrivs i Oksuz et al., 201715.
- Använd Spike-in kontroll i varje prov för att möjliggöra kvantitativ jämförelse mellan olika tidpunkter19.
- För Spike-in-kontroll, Använd kromatin från Drosophila melanogaster (i förhållandet 1:50 till mesc-härledd kromatin) samt Drosophila Specific H2Av antikropp (1 μl H2Av antikropp per 4 μg Drosophila kromatin enligt tillverkarens anvisningar) i varje prov.
- Bered kromatin från Drosophila på ett sätt som liknar det från mescs med hjälp av det protokoll som beskrivs i Oksuz et al., 201715.
- Mappa sekvensen läsningar för ChIP-SEQ till MM10 genom med bowtie 2 med standardparametrar20.
- Normalisera musen ChIP-SEQ läser att Spike-i Drosophila läsa räknas21. Beräkna Spike-in normaliserings faktorn med hjälp av följande formel: 1 x 106/Unique Drosophila Läs antal. Räkna med att ta sig runt 1 x 106Drosophila läsa räknas och 20 x 106 mus läsa räknas per experiment.
- Ta inte med Drosophila kromatin när du sekvenserar indatavärden.
- Använd genomecov verktyg från bedtools att konvertera BAM-fil till bedgraph22. Nästa, konvertera bedgraph till pamp fil med bedgraphtobigwig verktyg från uscs23,24. Se följande skript:
gen = "väg till MM10 genomet"
Chr = "sökväg till MM10 kromosom storlekar"
inp_bam = "sökväg för att mata in BAM-fil"
multiplicera = "beräkna en normaliserings faktor för Spike-in"
bedtools genomecov-BG-skala $multiply-ibam $inp _bam-g $gen > output. bedGraph
sort-K1, 1-K2, 2n utgång. bedGraph > output_sorted. bedGraph
bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw - Visualisera chip-SEQ Läs densiteter genom att ladda upp pamp filer på uscs Genoms webbläsare24.
5. övervakning uppkomst och tillväxt av H3K27me3 Foci i mESCs kärnor
- Platta 1x 104 mescs i 8-brunn kammare diabilder pre-belagda med 0,1% gelatin.
- Nästa dag, börja utföra på varandra följande 4-OHT (0,5 mM) induktioner för att samla in de celler som uttrycker EED för indikerade tidpunkter (0 h, 12 h, 24 h och 36 h). Byt media efter 12 timmar för behandlingar som är längre än 12 timmar.
- Fixera mESCs med 4% PARAFORMALDEHYD i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur (RT) i 10 min.
- Permeabilize cellerna med PBS/0,25% Triton X-100 vid RT för 30 min.
- Blockera cellerna med PBS/5% Donkey serum/0,1% Triton X-100 (blockerande buffert) vid RT för 30 min.
- Späd H3K27me3 primär antikropp 1:500 i blockeringsbufferten och tillsätt på cellerna.
- Inkubera cellerna med primär antikropp över natten vid 4 ° c.
- Nästa dag, utför 3 tvättar med PBS/0,1% Triton X-100.
- Späd sekundär antikropp (Alexa fluor 595) 1:1000 i blockeringsbufferten och Lägg till celler.
- Utför alla inkuberingar i mörker i följande steg eftersom sekundära antikroppar konjugerat med Alexa fluor är ljuskänsliga.
- Inkubera den sekundära antikroppen i 2 timmar vid RT.
- Utför 3 tvättar med PBS/0,1% Triton X-100.
- Späd DAPI (1 mg/mL) 1:4000 med PBS/0,1% Triton X-100 och tillsätt på celler.
- Inkubera cellerna med DAPI i 10 minuter vid RT.
- Montera cellerna med Aqua Mount.
- Bildcellerna med konfokalmikroskopi vid 63X förstoring.
- Process och pseudo-Color bilderna med hjälp av en fördelning av ImageJ, Fiji25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generell ordning för det villkorade räddningssystemet
Figur 1 visar inriktnings systemet att villkorslöst rädda Eed Ko celler med antingen WT eller Cage-Mutant (Y365A) Eed som uttrycks från ENDOGENA Eed Locus. Efter att ha knackat ut EED, en kärn subenhet av PRC2 som är nödvändig för dess stabilitet och enzymatisk aktivitet, en kassett inom intron efter exon 9 av EED introduceras (figur 1). Kassetten består av resterande 3 ' cDNA sekvens av EED, i omvänd orientering med avseende på endogena gensekvens. Kassetten är flankerad av heterologa inverterade loxP platser (lox66 och lox71)18. Cellerna sprids tills fullständig förlust av H3K27me2/3 observeras. Vid aktivering av CRE driver uttryck genom tillsats av 4-OHT, är kassetten inverterad så att exon 9 är skarvas in i kassetten med splice acceptor sekvens (figur 1). Med detta system, EED KO celler kan nu räddas av antingen WT eller bur-Mutant versioner av EED som båda har en C-Terminal flagga-HA tagg. Nedströms T2A-GFP ger en markör för att välja för celler som genomgår en lyckad inversion-händelse. PolyA-signalen förhindrar transkription av nedströms sekvenser. Med detta system, kinetik av PRC2 rekrytering och bildandet av H3K27me domäner kan nu följas.
Spårning av temporala deposition av PRC2-medierad H3K27me2/3
För att följa den temporala dynamiken i PRC2-medierad kromatin domän etablering, WT eller bur-Mutant version av EED är åter uttrycks i bakgrunden av EED KO celler, vid 4-OHT behandling (figur 2A, B). För att följa deposition av H3K27me2/3 märken, ChIP-SEQ av H3K27me2/ME3 utförs efter åter uttryck av WT eller bur-Mutant EED för den angivna tiden punkter. Uppkomsten av H3K27me3 observeras vid 12 h efter WT Eed uttryck på diskreta regioner som betecknas som "nukleation platser" (figur 2C), och sedan på regioner långt från den ursprungliga nukleation platser av 24 h13. Så småningom, fördelningen av H3K27me3 nästan approximerar den av de nivåer som ses i WT föräldra celler på 36 h efter WT EED uttryck. De temporally etablerade downstream platserna av H3K27me3 kallas "fördelning platser"13. Detta system kan också spåra den temporala deposition av H3K27me2, som tycks föregå H3K27me3 deposition (figur 2C, D). Slutligen, re-uttryck av bur-Mutant EED uppvisar olika dynamik i förhållande till WT EED (figur 2C, D). I detta fall är avsättning av H3K27me3 mycket ineffektiv och i stället, H3K27me2 blir uppenbar och mer koncentrerad till kärnbildning platser, vilket tyder på att bur-Mutant EED inte kan sprida förändringen till grannregioner.
Uppkomsten av H3K27me3 Foci och deras tillväxt kan också visualiseras genom mikroskopi (figur 2E)13. Före induktion av WT-uttryck är H3K27me3 färgning inte uppenbar. Emellertid, 12 h av WT EED uttryck visar tecken på H3K27me3 Foci formation. Dessa Foci ökar i antal och storlek med 24 h, och så småningom sprids till stora regioner i kärnan med 36 h WT EED uttryck. Detta system ger belägg för de Novo bildandet av PRC2-medierade kromatin domäner som övervakas av chip-SEQ och immunofluorescens(figur 2C-E)13.
Figur 1 : Inriktning system för att villkorslöst rädda Eed Ko mESCs antingen med WT eller Cage-MT Eed (Y365A). Borttagande av exon 10 och 11 orsakar destabilisering och försämring av EED och global förlust av H3K27me2/ME3. En kassett i intron mellan exon 9 och 10 sätts i motsatt riktning enligt indikerad. Tillsats av 4-OHT inverterar kassetten så att endogena exon 9 skarvar i bur-Mutant eller Wild typ cDNA av kassetten möjliggör inducerbara nytt uttryck av WT eller bur-Mutant EED. Denna siffra har modifierats från Oksuz et al., 201813. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Valideringar och representativa tillämpningar av inducerbara Eed-räddningssystem (i-WT-r och i-MT-r). A) i-WT-r och i-MT-r-systemval IDE ras av Western blot med hjälp av indikerade antikroppar på hela extrakt efter 4-oht-behandling för att inducera uttryck av WT (i-WT-r) eller bur-Mutant (i-MT-r) Eed, vid den tidpunkt som anges. (B) flödescytometri analys av GFP i i-WT-r celler före (0 h) och efter (36 h) 4-oht behandling för att bekräfta effektiviteten i uttrycket av T2A-GFP, vilket är ett tecken på framgångsrik flip av den inverterade kassetten. (C, D). ChIP-SEQ spår för H3K27me3 (C) och H3K27me2 (D) nära Emx1 genen i WT, eller i-WT-r eller i-MT-r-celler, för de angivna tider av 4-oht behandling. Tidiga och försenade platser för deponering av histonmärken indikeras. (E). immunofluorescens med H3K27me3 antikropp vid 0, 12, 24 och 36 h efter räddning av WT Eed Expression i i-WT-r mescs. Färgning vid 36 h visas vid lägre exponeringar. Panelen längst till höger är en zoomad bild av cellen som är märkt med en röd pil. Denna siffra har modifierats från Oksuz et al., 201813. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kraftfull strategi för att förstå de mekanistiska detaljerna under bildandet av en given kromatin domän, är att först störa domänen och sedan spåra dess återuppbyggnad pågår inom celler. Processen kan pausas när som helst under återuppbyggnaden för att analysera i detalj de händelser som pågår. Tidigare studier på kromatin domäner kunde inte lösa sådana händelser som de utfördes under steady-state villkor (t. ex., jämföra Wild-typ och Gene knockout). Här skisserar vi ett system för att bedöma den dynamiska bildandet av kromatin domäner, vilket belystes av rekrytering och spridning av PRC2-medierade repressiva domäner i celler.
Det mest kritiska steget för detta inducerbara system är den exakta utformningen av DNA konstruktioner för att åter uttrycka de önskade proteiner (eller RNA) efter deras respektive radering från cellerna. Olika mutationer, taggar och fluorescerande markörer kan införas inom dessa konstruktioner, beroende på nedströms program. Till exempel, istället för att använda självklyva T2A peptid omedelbart innan GFP för att koppla bort den från proteinet av intresse, olika fluorescerande fusions proteiner kan genereras för högupplösta Imaging och/eller Single-partikel tracking experiment för att övervaka de inledande händelserna i kromatin domän bildning i levande celler.
Även om denna metod kan ändras på många sätt att ge insikter i bildandet av kromatin domäner, det har vissa begränsningar. Först, det kräver en cellinjer som hamnar CRE-ERT2 genen. För det andra är optimeringar nödvändiga för att bestämma tids punkterna efter 4-OHT behandling. För det tredje är detta system inte reversibel så att övervaka händelserna under dekonstruktion av en kromatin domän. Degron-baserade metoder skulle kunna användas som ett alternativ till den metod som beskrivs här26,27. Dessa system möjliggör reversibel och snabb nedbrytning av proteiner, men kräver vanligtvis kostsamma molekyler för proteindestabilisering, såsom auxin eller sköld26,27. Dessutom har dessa degron-baserade metoder har begränsningar. De kunde bara användas för att åter uttrycka WT-versionen av proteinet efter dess nedbrytning. I motsats, det system som beskrivs häri tillåter villkorligt uttryck för den mutanta versionen av proteinet av intresse utöver sin WT motsvarighet. Kombinera ett sådant degron system med den metod som beskrivs här skulle vara ett kraftfullt sätt att reversibelt modulera bildandet av kromatin domäner. En alternativ metod för att följa bildandet av kromatin domäner innebär användning av specifika hämmare för att tömma en definierad kromatin modifiering från kromatin och sedan blekt inhibitor att följa de Novo deposition av förändringen. Till exempel, behandling med EZH2-hämmare och efterföljande blekt används för att spåra ombildandet av H3K27me domäner28. Emellertid, EZH2 inhibitor är inte effektivt i fullständigt nedbrytande H3K27me, även 7 dagar efter behandling. I detta fall kan närvaron av redan existerande H3K27me rekrytera och aktivera PRC212, vilket komplierar tolkningen av resultaten. Liksom, användningen av hämmaren och blekt strategi är begränsad på grund av avsaknaden av specifika och potenta hämmare för många kromatin domäner.
Förutom tillämpligheten av denna metod till cellulära system, det kan användas för att generera inducerbara mutationer/märkning på önskade proteiner i djur. I vissa fall kan muterar ett protein eller infoga en tagg vara dödliga under utvecklingen. Denna metod kringgår denna dödlighet och ger en tidsmässig och rumslig kontroll av mutation/märkning av proteiner genom koppling med vävnadsspecifika CRE-ERT2 mus stammar. Dessa typer av experiment skulle vara värdefullt att fastställa effekten av en mutation i en specifik vävnad och/eller i ett visst skede av utvecklingen. Viktigt, det gör det möjligt för isolering av celler som genomgår en lyckad rekombination via reportern i kassetten. Detta underlättar biokemiska analyser, såsom affinitetsrening från specifika vävnader, för att isolera den vävnadsspecifika interactome för ett givet protein. Detta system kan vara inriktad på att övervaka dynamiska förändringar i en given cellulära process, och därmed är inte begränsad till spårning kromatin domän formation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.R. är en av grundarna av Constellation Pharmaceuticals och Fulcrum Therapeutics. Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar DRS. L. Vales, D. OZATA och H. MOU för revidering av manuskriptet. Den D.R. Lab stöds av Howard Hughes Medical Institute och National Institutes of Health (R01CA199652 och R01NS100897).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
