Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Abstract

Kromatin etki alanlarının organizasyonu ve yapısı tek tek hücre soylarına özgüdür. Onların yanlış regülasyonu hücresel kimlik ve / veya hastalık kaybına yol açabilir. Muazzam çabalara rağmen, kromatin alanlarının oluşumu ve yayılması anlayışımız hala sınırlıdır. Kromatin etki alanları, kuruluşları sırasında ki ilk olayları takip etmeye elverişli olmayan sabit devlet koşullarında incelenmiştir. Burada, kromatin etki alanlarını inducibly yeniden inşa etmek ve zamanın bir fonksiyonu olarak yeniden oluşumunu takip etmek için bir yöntem salıyoruz. Her ne kadar ilk olarak ÇHC2 aracılı baskılayıcı kromatin etki alanı oluşumu olgusuna uygulansa da, diğer kromatin etki adlarına kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin genomik ve görüntüleme teknolojileri ile değiştirilmesi ve/veya kombinasyonu, kromatin alanlarının kurulmasını ayrıntılı olarak incelemek için paha biçilmez araçlar sağlayacaktır. Bu yöntemin kromatin alanlarının nasıl oluştuğu ve birbirleriyle nasıl etkileşimde olduğu anlayışımızda devrim olacağına inanıyoruz.

Introduction

Ökaryotik genomlar son derece organize ve kromatin erişilebilirlik değişiklikleri doğrudan gen transkripsiyonkontrol 1. Genom transkripsiyonel aktivite ve çoğaltma zamanlaması2,3ile ilişkili kromatin etki alanları, farklı türleri içerir. Bu kromatin etki alanları boyutu birkaç kilobases (kb) fazla 100 kb arasında değişir ve farklı histon modifikasyonları bir zenginleştirme ile karakterizedir4. Temel sorular şunlardır: bu etki alanları nasıl oluşur ve nasıl yayılır?

En iyi karakterize kromatin etki alanlarından biri Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) aktivitesi ile teşvik edilir. PRC2, Polycomb Group 'un (PcG)5,6proteinlerinin bir alt kümesinden oluşan ve histon H3 (H3K27me1/me2/me3) 27 lisenin mono-, di-ve trimethylation katalizler bir çok alt birim kompleksidir 7,8, 9,10. H3K27me2/me3 baskıcı kromatin durumu ile ilişkilidir, ancak H3K27me1 fonksiyonu belirsiz6,11. ÇHC2 temel bileşenlerinden biri, embriyonik ektoderm gelişimi (EED), çHC2 kataliz son ürün bağlanır, H3K27me3, aromatik kafes aracılığıyla ve bu özellik PRC2 allosteric stimülasyon sonuçları12,13. ÇHC2 enzimatik aktivitesi belirli bir soy için kontrendike olan bazı gelişimsel genlerin uygunsuz ifadesi olarak gelişim sırasında hücresel kimliğin korunması için çok önemlidir, zararlı olacaktır5,6 . Bu nedenle, PrC2'nin memelilerde baskıcı kromatin alanlarının oluşumunu teşvik ettiği mekanizmaların çözülmesi hücresel kimliğin anlaşılması için temel öneme sahiptir.

PrC2 aracılı kromatin etki alanları da dahil olmak üzere kromatin etki alanı oluşumunu araştırmak için tasarlanmış tüm deneysel sistemler, kromatin etki alanı oluşumunun gelişen olaylarını takip edemeyen sabit durum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hücre. Burada, kromatin alanadlarının ilk işe alımını ve yayılmasını izleyen indüklenebilir bir hücresel sistem oluşturmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Özellikle, H3K27me2/3'ü oluşturan ÇHC2 aracılı baskıcı kromatin etki alanlarının oluşumunu izlemeye odaklanıyoruz. Kromatin etki alanı oluşumunun mekanistik ayrıntılarını yakalayabilen bu sistem, H2AK119ub veya H3K9me'den oluşan yaygın olarak çalışılan etki alanları gibi diğer kromatin etki alanlarını da dahil etmek üzere uyarlanabilir. Genomik ve görüntüleme teknolojileri ile birlikte, bu yaklaşım kromatin biyolojisindeki çeşitli önemli soruları başarılı bir şekilde ele alma potansiyeline sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İndüklen EED kurtarma mESC'lerinin üretimi

1. Hücre kültürü

  1. 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT)13uygulanması üzerine çekirdeğe transkus transretobilen, koably entegre CreERT2 transgene sahip besleyicisiz C57BL/6 fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) kullanın.
  2. 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK inhibitörü PD0325901 ve 3 μM GSK3 inhibitörü CHIR99021 ile desteklenen konvansiyonel ESC orta14,15,mESK'lerde büyütün. Konvansiyonel ESC ortamı için %15 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penisilin/streptomisin ve 0.1 mM 2-mercaptoetanol içeren nakavt DMEM kullanın.
  3. MESC'ler için %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplanmış plakalar kullanın.

2. Klonal EED nakavt (KO) mESCs üretimi

  1. Tasarım kılavuzu RNA 'lar (gRNA'lar) Exon 10 ve Exon 11'i silmek için, Benchling16'dakiCRISPR tasarım aracını kullanarak mESC'lerde EED'nin endojen kopyalarını siler. EED-KO-gRNA-1, exon 10'un intron'u hemen yukarıya ve EED-KO-gRNA-2'yi Exon 11'in hemen aşağısına doğru hedefler. Bu gRNA'ların eşzamanlı uygulaması homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ile Hem Exon 10 hem de Exon 11'i siler.
  2. Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.
  3. 6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs her EED-KO-gRNA-1 ve EED-KO-gRNA-2 1 mg (Malzemeler Tablosubakınız) üreticinin talimatları na uyarak transfeksiyon reaktifi kullanarak. Transfeksiyondan sonra ortamı 24 saat değiştirin.
  4. Transfeksiyondan iki gün sonra, Floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin. Transfeksiyon veriminin %10-30 civarında değişmesini bekleyin. Kaplama için yeterli GFP pozitif hücreleri yakalamak için 5 x 105 hücreleri etrafında sıralayın.
  5. Koloni toplama için izole GFP pozitif mESC'leri %0,1 jelatin (plaka başına 10-20 x103 hücre) ile önceden kaplanmış 15 cm'lik plakalara plakalayın.
  6. Tek koloniler görünene kadar ESC ortamındaki hücreleri yaklaşık bir hafta büyütün. Her 2 günde bir ortamı değiştirin.
  7. 20 μL mikropipet ucu kullanarak en az 48 koloni seçin. Mikropipet ucuna aspire ederken koloninin üzerine kazıyın. Koloniyi tek bir hücreye ayırma. Koloniyi bir accutase içeren (20 mL) 96 kuyu plakasına aktarın.
  8. Tüm hücreler ayrıştırılıncaya kadar kolonileri 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 200 mL ESC ortam ekleyin.
  10. İyi bir şekilde karıştırın ve çok kanallı pipet kullanarak hücreleri iki ayrı 96 kuyu plakasına plakalayın.
  11. Genotipleme için 96 kuyu plakasından birini kullanın ve genotipleme sonuçlanana kadar diğerini büyütmeye devam edin. Üreticinin talimatlarına uyarak 96 kuyu plakasından DNA çıkarmak için DNA çıkarma solüsyonu kullanın.
  12. Silinen siteye yayılan ve üreticinin talimatları doğrultusunda Takdna polimeraz ile genotipleme pcr gerçekleştiren Gnt_EED-KO-up ve Gnt_EED-KO_downgenotyping astarları kullanın.
    NOT: Dna polimerazların diğer türleri de genotipleme için kullanılabilir, ancak, PCR reaksiyonu doğrudan renkli reaksiyon tampon kullanıldığında bir jel üzerine yüklenebilir gibi Taq DNA polimeraz kolaylık sağlar.
    1. Vahşi tip (WT) kasasına göre homozigot silme ile hücrelerde daha düşük molekül ağırlığına sahip bir DNA ürününün gözlemlein.
      NOT: PRC2 null hücreleri oluşturmak için, exons homozigot silme 10 ve 11 eed, çekirdek PRC213önemli bir alt birimi istikrarsızlaştırmak ve bozunmak için gereklidir. CRISPR hedefleme verimliliği %10 civarındadır.
  13. EED ekson 10 ve 11'in silinmesini ve Sırasıyla Sanger dizilimi ve Batı lekeleme ile EED protein kaybını doğrulayın.
  14. EED ve H3K27me2/me3'ün EED KO hücrelerindeki kromatinden H3K27me2/me3 ve EED'ye karşı antikorlar kullanarak ChIP-seq ile tükenmesini onaylayın. ChIP-seq deneyleri için Oksuz vd., 2017 15'te verilen protokolü kullanın.

3. Cre-ERT2 tabanlı indüklen EED ifadesini barındıracak EED nakavt mESC'lerini tasarlamak

  1. Tasarım gRNA (EED-gRNA-inducible) Benchling16'daki CRISPR tasarım aracını kullanarak EED'nin ekson 9'undan sonra intron içinde bir kesim tanıtmak için 16 (bkz.
  2. Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.
  3. Ekson 9'dan sonra EED cDNA dizisini ve T2A-GFP dizisinin C-terminal Flag-HA etiketini içeren bir donör şablonu DNA'sı tasarla, hepsi endojen gen dizisine göre ters yönde.
    1. Bir splice-acceptor ve heterolog ters loxP siteleri (lox66 ve lox71) 18 arasında yuvalanmışbir poliadeniletion dizisi ile kaset flank .
    2. Her iki ucundan en az 500 bp homoloji silah ekleyin. Donör şablonu gBlocks gen parçalarının 2 segmentine bölün (bkz. gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ve gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") PCR Blunt vektör üreticisinin talimatları aşağıdaki Gibson klonlama kullanarak.
      NOT: gblock-2 H3K27me312ile etkileşim için önemli olan EED kafes içinde bir aromatik kalıntı (Y365) içerir. gBlock-2-Wt yabani tip kalıntısı içerirken, gblock-2-cage-mutant, H3K27me3'e bağlanamayan EED (Y365A) kafes mutantını içerir. Indüklen WT EED kurtarma i-WT-r ve indüklen kafes mutant EED kurtarma kolaylık sağlamak için i-MT-r olarak gösterilir olarak gösterilir.
  4. 6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs gRNA 1 mg (EED-gRNA-inducible) ve 1 mg Donör şablonları (i-WT-r veya i-MT-r) transfeksiyon reaktif kullanarak ve FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole.
  5. Başarılı hedefleme için genotiplemeye hazır kolonileri izole etmek için 2.3-2.11 adımlarını izleyin.
  6. Genotyping astarlar Inducible_Genotype-FW-1 ve Inducible_Genotype-REV-1kullanın , hangi eklenen kaset yayılan ve Tak DNA polimeraz kullanarak genotipleme PCR gerçekleştirmek.
    NOT: CRISPR için hedefleme verimliliği %10 civarındadır.
    1. İnducible_Genotype-FW-2 ve Homoloji kollarının dışında olan Inducible_Geotype-REV-2 astarlarını kullanarak kasetin PCR ile doğru entegrasyonunu onaylayın.
      NOT: EED'nin verimli bir şekilde kurtarılması için kasetin homozigot entegrasyonu gereklidir. Homozigot entegrasyona sahip hücrelerin WT EED ile karşılaştırıldığında tek bir büyük DNA ürünü üreteceğini unutmayın, bu da kısa bir ürün üretecektir.
  7. Kasetin Sanger sıralaması ile entegrasyonunu onaylayın.
  8. Batı lekeleme tarafından 4-OHT yönetimi üzerine kaset ve EED ve diğer PRC2 temel bileşenleri (örneğin, EZH2 ve SUZ12) ifadesinin flipping onaylayın.
  9. T2A-GFP ifadesini ve akış sitometrisi ile çevirme yüzdesini doğrulayın. GFP ifadesinin kasetin çevrildiğini ve EED ifadesinin göstergesi olduğunu unutmayın.

4. Kromatin üzerinde ÇHC2 aktivitesinin çekirdekleşme ve yayılmasınıtaki takip

  1. I-WT-r ve i-MT-r mESC'lerin akış sitometrisi tarafından GFP'nin sızdıran ekspresyonuna sahip olmadığını doğrulayın. GFP'nin sızdıran ekspresyonu durumunda, denemeye başlamadan önce GFP negatif hücreleri FACS tarafından yalıtın.
  2. i-WT-r ve i-MT-r mm'leri beş adet 15 cm plakaya (plaka başına 5x 106 hücre) genişletin.
  3. 0 saat, 12 h, 24 saat, 36 saat ve 8 gün (her koşulda bir 15 cm plaka) için 0,5 mM 4-OHT uygulama ile WT veya kafes mutant EED indükleme ekspresyonu. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin. GFP kullanarak FACS tarafından başarılı bir şekilde yeniden birleştirilmiş hücreleri izole edin. Tüm koşulların aynı anda toplandığı tedavilerin zamanını ayarlayın.
  4. H3K27me2 için ChIP-seq gerçekleştirin, H3K27me3 WT veya kafes mutant EED yeniden ifade yanıt olarak kromatin onların zamansal birikimi araştırmak için. Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarak kullanılankütüphane hazırlama yı içeren ChIP-seq protokolünü kullanın.
  5. Farklı zaman noktaları arasında nicel karşılaştırma sağlamak için her örnekte başak-in denetim kullanın19.
    1. Başak kontrolü için, Drosophila melanogaster (mESC kaynaklı kromatin oranı 1:50 oranında) yanı sıra Drosophila spesifik H2Av antikor (1 μL H2Av antikor başına 4 μg Drosophila kromatin üreticinin talimatları) her örnekte.
    2. Drosophila'dan gelen kromatini Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarakbelirtilen protokolü kullanarak, MSK'lardan alınana benzer bir şekilde hazırlayın.
  6. Varsayılan parametreleri20kullanarak Bowtie 2 ile Mm10 genom chIP-seq için sıra okur Harita .
  7. Normalleştirmek fare ChIP-seq spike-drosophila okumak sayımları21okur . Aşağıdaki formülü kullanarak başak-in normalleştirme faktörü hesaplamak: 1 x 106/unique Drosophila okuma sayıları. Yaklaşık 1 x 106Drosophila okuma sayıları ve deneme başına 20 x 106 fare okuma sayıları almak için bekleyin.
    1. Giriş örneklerini sıralarken Drosophila kromatinini eklemeyin.
  8. Bam dosyasını bedgraph 22'ye dönüştürmekiçin bedtools genomecov aracını kullanın. Sonra, USCS23,24 bedGraphToBigWig aracını kullanarak bigwig dosyasına bedgraph dönüştürmek . Aşağıdaki komut dosyasına bakın:
    gen="mm10 genomuna giden yol"
    chr="mm10 kromozom boyutlarına giden yol"
    inp_bam="giriş yolu bam dosyası "
    multiply="başak-in normalleştirme faktörlerini hesapla"
    bedtools genomecov -bg -ölçek $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sıralama -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. USCS genom tarayıcı24bigwig dosyaları yükleyerek ChIP-seq okuma yoğunlukları görselleştirin.

5. MESC'lerin çekirdeklerinde H3K27me3 focisinin ortaya çıkışını ve büyümesini izleme

  1. Plaka 1x 104 mESCs içine 8-iyi oda slaytlar önceden% 0.1 jelatin ile kaplanmış.
  2. Ertesi gün, belirtilen zaman noktaları (0 saat, 12 saat, 24 h ve 36 saat) için EED ifade hücreleri toplamak için ardışık 4-OHT (0,5 mM) indüksiyonlar yapmaya başlayın. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin.
  3. 10 dakika oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit ile mESC'leri düzeltin.
  4. 30 dakika boyunca RT PBS/0.25% Triton X-100 ile hücreleri permeabilize.
  5. PBS/5% eşek serumu/0.1% Triton X-100 (engelleme tampon) ile HÜCRELERI 30 dakika boyunca RT'de bloke edin.
  6. Seyreltik H3K27me3 birincil antikor 1:500 engelleme tampon ve hücrelere ekleyin.
  7. Hücreleri bir gecede 4 °C'de primer antikorile kuluçkaya yatırın.
  8. Ertesi gün, PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkıntı gerçekleştirin.
  9. Sekonder antikor (Alexa flor 595) 1:1000 engelleme tampon seyreltmek ve hücrelere ekleyin.
    1. Alexa Fluor ile konjuge ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi aşağıdaki adımlarda karanlıkta tüm kuluçka gerçekleştirin.
  10. İkincil antikor2 saat RT'de kuluçkaya yatırın.
  11. PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkama gerçekleştirin.
  12. Seyreltik DAPI (1 mg/mL) PBS/0.1% Triton X-100 ile 1:4000 ve hücrelere ekleyin.
  13. RT'de 10 dakika boyunca DAPI ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
  14. Aqua montaj ile hücreleri monte edin.
  15. 63X büyütmede konfokal mikroskopi ile hücreleri görüntüleyin.
  16. ImageJ, Fiji 25'in dağıtımını kullanarakgörüntüleri işleme ve sözde renklendirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Koşullu kurtarma sisteminin genel bir şeması
Şekil 1 endojen EED locus ifade edilir Ya WT veya kafes mutant (Y365A) EED ile EED KO hücreleri koşullu kurtarmak için hedefleme şeması gösterir. Stabilitesi ve enzimatik aktivitesi için gerekli olan ÇHC2'nin çekirdek alt birimi olan EED'yi nakavt ettikten sonra, EED'nin ekson 9'unu takip eden intron içinde bir kaset tanıtılır (Şekil1). Kaset, endojen gen dizilimine göre ters yönde, EED'nin kalan 3' cDNA dizisinden oluşur.  Kaset heterolog ters loxP siteleri (lox66 ve lox71)18ile çevrilidir. H3K27me2/3 tam kaybı gözlenene kadar hücreler yayılır. Cre rekombinaz ifadesinin 4-OHT eklenmesiyle aktivasyonu üzerine, kaset, exon 9'un splice alıcı sırası kullanılarak kasete spliced olacak şekilde ters çevrilmiş tir (Şekil 1). Bu sistem ile, EED KO hücreleri artık her ikisi de C-terminal Bayrak-HA etiketine sahip olan EED'nin WT veya kafes mutant versiyonları tarafından kurtarılabilir. T2A-GFP, başarılı bir ters çevirme olayına maruz olan hücreler için seçmek için bir işaretçi sağlar. PolyA sinyali aşağı akım dizilerinin transkripsiyonuna engel oluyor. Bu sistem ile, ÇHC2 işe kinetik ve H3K27me etki alanlarının oluşumu artık takip edilebilir.

PrC2 aracılı H3K27me2/3'ün zamansal birikiminin izlenmesi
ÇHC2 aracılı kromatin etki alanı kurulmasının zamansal dinamiklerini takip etmek için, EED'nin WT veya kafes mutant versiyonu, 4-OHT tedavisi üzerine EED KO hücrelerinin arka planında yeniden ifade edilir (Şekil 2A,B). H3K27me2/3 işaretlerinin birikintiyi takip etmek için, H3K27me2/me3'ün ChIP-seq'ı, belirtilen zaman noktaları için WT veya kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesinden sonra gerçekleştirilir. H3K27me3'ün ortaya çıkışı, "nükleasyon bölgeleri" (Şekil2C) olarak gösterilen ayrık bölgelerde WT EED ekspresyonundan sonra 12 saat sonra ve daha sonra ilk çekirdekleşme bölgelerinden 24 saat13ile uzak bölgelerde görülür. Sonunda, H3K27me3 dağılımı neredeyse WT EED ifade sonra 36 h WT ebeveyn hücrelerinde görülen düzeyleri yaklaşık. H3K27me3 zamansal kurulan downstream siteleri "yayılan siteler"13denir. Bu sistem aynı zamanda H3K27me2'nin zamansal birikimini izleyebilir, bu da H3K27me3 birikiminden önce görünür (Şekil2C,D). Son olarak, kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesi WT EED'e göre farklı dinamikler sergiler (Şekil 2C,D). Bu durumda, H3K27me3 birikimi çok verimsiz ve bunun yerine, H3K27me2 belirgin hale gelir ve çekirdekleşme sitelerinde daha yoğun, kafes mutant EED komşu bölgelere değişiklik yaymak mümkün olmadığını gösteren.

H3K27me3 foci'nin ortaya çıkışı ve büyümeleri de mikroskopi ile görüntülenebilir (Şekil 2E)13. WT EED ekspresyonunun indüksiyonundan önce H3K27me3 boyama belirgin değildir. Ancak, WT EED ifadesinin 12 saat H3K27me3 foci oluşumukanıt gösterir. Bu foci sayısı ve boyutu 24 h artış, ve sonunda WT EED ifade 36 h tarafından çekirdeğin büyük bölgelere yayıldı. Bu sistem, ChIP-seq ve immünoresans tarafından izlenen PRC2 aracılı kromatin etki alanlarının de novo oluşumuna dair kanıt verir (Şekil 2C-E)13.

Figure 1
Şekil 1 : EED KO mESC'lerini WT veya cage-mt EED (Y365A) ile koşullu olarak kurtarmak için hedeflemeşeması. Ekson 10 ve 11'in silinmesi EED'nin istikrarsızlaşmasına ve bozulmasına ve h3K27me2/me3'ün küresel kaybına neden olur. Ekson 9 ile 10 arasında intron bir kaset belirtildiği gibi ters yönde eklenir. 4-OHT eklenmesi, kasirenin endojen exon 9 splices'ini, WT veya kafes mutantı EED'nin indüklenemez şekilde yeniden ifade edilmesine izin veren kasetin kafes mutantı veya yabani tip cDNA'sına dönüştürür. Bu rakam Oksuz ve ark., 201813. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 : İndüklen EED kurtarma sistemlerinin (i-WT-r ve i-MT-r) doğrulamaları ve temsili uygulamaları. (A). i-WT-r ve i-MT-r sistemleri, belirtilen zaman noktasında WT (i-WT-r) veya kafes mutantı (i-MT-r) EED ekspresyonu indüklemek için 4-OHT tedavisinden sonra tüm ekstrelerde belirtilen antikorlar kullanılarak Batı lekesi tarafından doğrulanır. (B). Ters kasetin başarılı bir şekilde takla attığınıgösteren T2A-GFP ifadesinin verimliliğini doğrulamak için i-WT-r hücrelerinde (0 saat) ve sonrası (36 saat) 4-OHT tedavisinde GFP'nin akış sitometri analizi. (C, D). H3K27me3 (C) ve H3K27me2 (D)için ChIP-seq parçaları WT'deki Emx1 geninin yakınında veya i-WT-r veya i-MT-r hücrelerinde, 4-OHT tedavisinin belirtilen süreleri için. Histon işaretlerinin tatılması için erken ve gecikmiş siteler belirtilir. (E). I-WT-r mESC'lerde WT EED ekspresyonunun kurtarılmasından sonra 0, 12, 24 ve 36 h'de H3K27me3 antikor kullanılarak immünoresans. 36 saat boyama düşük pozlamalarda gösterilir. En sağdaki panel, kırmızı okla etiketlenmiş hücrenin yakınlaştırılmış görüntüsüdür. Bu rakam Oksuz ve ark., 201813. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belirli bir kromatin etki alanının oluşumu sırasında mekanistik ayrıntıları anlamak için güçlü bir yaklaşım, ilk etki alanı bozmak ve daha sonra hücreler içinde devam eden yeniden izlemedir. Devam eden olayları ayrıntılı olarak analiz etmek için yeniden yapılanma sırasında herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir. Kromatin etki alanları üzerinde daha önce yapılan çalışmalar, bu tür olayları sabit durum koşullarında (örneğin, yabani tip ve gen nakavtı karşılaştırması) gerçekleştirdikleri için çözemedikleri için çözemedikleri için. Burada, hücrelerde ÇHC2 aracılı baskıcı etki alanlarının işe alınması ve yayılmasıyla vurgulandığı gibi, kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu değerlendirmek için bir sistem ana hatlar.

Bu indükleyici sistem için en kritik adım, DNA yapılarının istenilen proteinleri (veya RNA) hücrelerden silindikten sonra yeniden ifade etmek için doğru tasarımıdır. Bu yapılarda downstream uygulamalarına bağlı olarak çeşitli mutasyonlar, etiketler ve floresan belirteçler getirilebilir. Örneğin, GFP'den hemen önce kendi kendine cleaving T2A peptid kullanmak yerine, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve/veya tek parçacık izleme deneyleri için çeşitli floresan füzyon proteinleri canlı hücrelerde kromatin etki alanı oluşumunun ilk olayları izlemek.

Bu yöntem kromatin etki alanlarının oluşumu na ilişkin içgörüler sağlamak için birçok şekilde değiştirilebilir olsa da, bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, Cre-ERT2 genini barındıran bir hücre hattı gerektirir. İkinci olarak, 4-OHT tedavisinden sonraki zaman noktalarını belirlemek için optimizasyonlar gereklidir. Üçüncü olarak, bu sistem bir kromatin etki alanının yapısızlaştırılması sırasında ki olayları izlemek için geri döndürülemez. Degron tabanlı yöntemler burada açıklanan yönteme alternatif olarak kullanılabilir26,27. Bu sistemler proteinlerin geri dönüşümlü ve hızlı bozulmasını sağlar, ancak genellikle protein destabilizasyonu için pahalı moleküller gerektirir, örneğin auxin veya kalkan26,27. Ayrıca, bu degron tabanlı yöntemlerin sınırlamaları vardır. Onlar sadece bozulmadan sonra proteinin WT sürümünü yeniden ifade etmek için kullanılabilir. Buna karşılık, burada açıklanan sistem, WT muadili ek olarak ilgi proteinmutant sürümünün koşullu ifade sağlar. Böyle bir degron sisteminin burada açıklanan yöntemle birleştirilmesi, kromatin etki alanlarının oluşumunu tersine çevirmek için güçlü bir araç olacaktır. Kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için alternatif bir yöntem, kromatinden tanımlanmış bir kromatin modifikasyonunu tüketmek ve daha sonra de novo dekontiyasyonunu takip etmek için inhibitörü yıkamak için spesifik inhibitörlerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, EZH2 inhibitörü ve sonraki yıkama ile tedavi H3K27me etki 28yeniden oluşumunu izlemek için kullanılır. Ancak, EZH2 inhibitörü tamamen H3K27me tüketen etkili değildir, hatta 7 gün tedaviden sonra. Bu durumda, önceden varolan H3K27me varlığı işe ve PRC212etkinleştirmek olabilir , böylece sonuçların yorumlanması karmaşık. Yanı sıra, inhibitör ve yıkama stratejisinin kullanımı birçok kromatin etki alanları için özel ve güçlü inhibitörlerin yokluğu nedeniyle sınırlıdır.

Bu yöntemin hücresel sistemlere uygulanabilirliğine ek olarak, hayvanlarda istenilen proteinler üzerinde indüklenebilir mutasyonlar/etiketleme oluşturmak için de kullanılabilir. Bazı durumlarda, bir proteini mutasyona uğratarak veya bir etiket eklemek geliştirme sırasında ölümcül olabilir. Bu yöntem bu öldürücülüğü atlar ve dokuya özgü Cre-ERT2 fare suşları ile bağlantı sağlayarak proteinlerin mutasyonu/etiketlemesinin zamansal ve mekansal kontrolünü sağlar. Bu tür deneyler, bir mutasyonun belirli bir dokudaki ve/veya gelişimin belirli bir aşamasındaki etkisini belirlemek için değerli olacaktır. Daha da önemlisi, kaset içinde muhabir aracılığıyla başarılı bir rekombinasyon geçiren hücrelerin izolasyonunu sağlar. Bu biyokimyasal analizler kolaylaştırır, belirli dokulardan afinite saflaştırma gibi, belirli bir protein için dokuya özgü etkileşimizolasyon. Bu sistem herhangi bir hücresel süreç dinamik değişiklikleri izlemek için yönelik olabilir, ve bu nedenle kromatin etki alanı oluşumuizleme ile sınırlı değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.R. Constellation Pharmaceuticals ve Fulcrum Therapeutics'in kurucularındandır. Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Dr. L. Vales, D. Ozata ve H. Mou'ya makalenin revizyonu için teşekkür ederiz. D.R. Lab, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA199652 ve R01NS100897) tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Tags

Genetik Sayı 150 PrC2 kromatin etki alanları H3K27me2 H3K27me3 epigenetik nükleasyon yayılma indüklanabilir / koşullu kurtarma.
Kromatin Etki Alanlarının <em>De novo</em> Oluşumunu İnceleme Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to… More

Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter