Præsenteret her er en protokol til udførelse af Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel til at studere HJ opløsning. To-farve alternerende excitation bruges til bestemmelse af dissociations konstanter. Enfarvet tidsforskydning smFRET påføres derefter i realtid spaltning assays for at opnå den pause tidsfordeling før HJ opløsning.
Bulk metoder måle ensemblet opførsel af molekyler, hvor individuelle reaktions rater af de underliggende trin er gennemsnit i hele befolkningen. Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel (smFRET) giver en registrering af de konformationsmæssige ændringer, der finder sted af individuelle molekyler i realtid. Derfor er smFRET stærk til at måle strukturelle ændringer i enzymet eller substratet under binding og katalyse. Dette arbejde præsenterer en protokol for single-molekyle billeddannelse af samspillet mellem en fire-vejs Holliday Junction (HJ) og Gap endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homologe rekombination enzym. Også præsenteret er enkelt-farve og to-farve alternerende excitation (ALEX) smFRET eksperimentelle protokoller til at følge opløsningen af HJ af GEN1 i realtid. Kinetikken af GEN1-denne bestemmes på HJ, som er blevet foreslået at spille en central rolle i opløsningen af HJ og er forblevet undvigende indtil nu. De teknikker, der beskrives her, kan anvendes bredt for at opnå værdifuld mekanistisk indsigt i mange enzym-DNA-systemer.
Enkelt molekyle metoder baseret på fluorescens detektering giver høje signal-støj-nøgletal1. FRET er en spektroskopisk teknik, der kan måle afstande i intervallet 1 – 10 nm, hvilket gør denne teknik som en molekylær lineal til måling af afstande i nanometer området2,3. Acceptors absorptionsspektrum har en delvis spektral overlapning med donorens emissions spektrum ved den kortere bølgelængde. FRET er medieret af stråling-mindre energioverførsel mellem en donor og acceptor par, mens effektiviteten af energioverførsel er afhængig af afstanden og retningen af acceptoren4.
Flere tilgange er blevet implementeret for at minimere baggrunden og forbedre detekterings effektiviteten af fluorescens signalet5,6. En fremgangsmåde er Konfokal mikroskopi, hvor et hul begrænser excitation stedet til en størrelse under diffraktionen grænse7. En anden fremgangsmåde er total intern refleksion fluorescens (TIRF), som er en bred-felt belysning teknik, hvor lyset er rettet off-akse over en kritisk vinkel8. Lyset er derefter helt internt afspejlet i grænsefladen mellem glas og vandig opløsning, genererer en passive bølge, der kun oplyser de fluorophorer fastgjort til glasoverfladen og forhindrer baggrunden fra fluorophorerne i resten af løsningen.
I Konfokal mikroskopi kan molekylerne enten være frit sprede eller overflade immobiliseret. Den opnåede tidsmæssige opløsning kan være inden for mikrosekunder til flere millisekunder9. Konfokal detektering for et enkelt molekyle udføres af Single-photon Avalanche Diode (SPAD) og punkt-for-punktscanning af regionen af interesse10. I TIRF, en tidsserie af et par hundredvis af molekyler immobiliseret på overfladen er registreret af en positions-følsom to-dimensionel ladning koblet detektor (CCD). CCD forstærker fluorescens signalet enten ved intensiveret fosfor-skærm og mikrokanal plade eller på-chip-multiplikation af fotoelektroner (emccd). Den tidsmæssige opløsning er afhængig af udlæsningshastigheden og kvante effektiviteten af CCD og normalt på rækkefølgen af få snesevis af millisekunder6.
HJ er et centralt mellemprodukt i DNA-reparation og rekombination11,12,13,14. HJ har to kontinuerlige og to krydsning tråde, der forbinder mellem de kontinuerlige tråde uden at krydse hinanden. HJ findes i opløsning som X-stacked konformatorer, som undergår kontinuerlig isomerisering af de kontinuerlige tråde bliver krydser og passage tråde bliver kontinuerlig i den anden konformer15. Isomer præference af HJ er afhængig af kernen sekvens og ionisk miljø og er blevet grundigt undersøgt af Fret16,17,18,19.
GEN120 er et monomerisk protein i løsning21 og kræver denne for at kløve HJ, hvilket giver mulighed for korrekt adskillelse af de rekombinerede tråde22,23. Den stabling konformer præference af HJ påvirker resultatet af genetisk rekombination ved at indstille retningen af opløsningen af HJ resolvases24. Forstå hvordan GEN1 binder HJ, koordinerer de to snit, og sikrer sin fulde opløsning har alle været under intensiv undersøgelse21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denne undersøgelse anvendes en objektiv baseret TIRF-opsætning som beskrevet tidligere31. To-farve alternerende excitation (Alex) anvendes til at bestemme de konformationsmæssige ændringer på interaktionen af GEN1 med fluoroforet mærket HJ. Alex producerer 2D histogrammer baseret på to ratiometriske parametre fret effektivitet E, som er donor-acceptor distance-afhængige, og støkiometri parameter S, som måler donor-acceptor støkiometri32. ALEX tillader sortering af fluorescerende arter baseret på de støkiometries af fluorophorerne, herunder donor-only, acceptor-only, og blandede delpopulationer. Alex kan udvide brugen af Fret til hele spektret og kan detektere forskelle i fluoroforet lysstyrke og oligomerisering samt overvåge makromolekyle-ligand interaktioner33.
Det er konstateret, at GEN1 konsekvent lykkes at løse HJ inden for levetiden af GEN1-HJ-komplekset. De tidsafhængige konformationsmæssige ændringer er afledt af tids-spor af individuelle molekyler, mens histogrammer repræsenterer fordelingen af de underliggende populationer. Ved hjælp af time-lapse enkelt-farve fret, hurtig on-rate og langsom off-satser for GEN1 dimer er demonstreret, som øger affiniteten af den samlede GEN1 dimer på det første indsnit produkt.
I denne undersøgelse, forskellige smFRET teknikker blev implementeret for at bestemme kinetikken af HJ resolution af GEN130. Lignende smfret tilgange blev brugt til at følge dobbelt-flap DNA konformationsmæssige krav og spaltning af DNA replikation og reparation flap endonuklease 142,43,44. Her diskuteres kritiske trin i denne protokol. Den silanisering reaktion bør være fri for ethvert spor af fugt. Pegylations opløsningen skal anvendes hurtigt på det silaniserede glas, når PIND er opløst for at undgå hydrolyse. I multikanal flowcellen skal enhver fanget luft i klæbe arket fjernes for at undgå lækage mellem tilstødende kanaler. PCA-løsningen skal være frisk tilberedt, da den oxiderer over tid. Tilføjelsen af 10 N NaOH bør være dropwise, med vortexning i mellem. Fluorescens baggrund i dæksedlen skal være minimal, før den flyder fluorescently mærket HJ. Billedbehandlings forløbet i flowcellen skal udføres i én retning for at undgå, at der opstår blegede områder. I ALEX eksperimenter, kraften i den røde laser bør reduceres for at undgå hurtig blegning af acceptoren. I tidsforskudt eksperimenter skal cyklustid være kortere end den hurtigste hændelse.
smFRET er en følsom teknik, der kan give værdifuld real-time indsigt i biomolekulære reaktioner. Men denne metode har flere tekniske udfordringer, blandt hvilke er at opnå målbare ændringer i FRET under den biokemiske reaktion. Dette er nødvendigt for at opnå veladskilte funktioner i histogrammer og skelne stater i tids-spor. I mange tilfælde kræver smfret omhyggelig design af substrater, udvælgelse af fluoroforet par og deres positioner, og forstærkning af Fret ændringer i DNA-substrat på grund af de små strukturelle ændringer i substrat45. En anden metode til at udføre FRET er at bruge mærkede proteiner46. Observationsvinduet i FRET er begrænset af acceptorens stabilitet såsom Cy5 eller Alexa fluor 647, som har tendens til at blege hurtigere end donor (Cy3 i dette tilfælde). Derfor kræver fret en kontinuerlig søgning efter stabile fluorophorer for at forlænge eksperimentets varighed og bestræbelserne på at udvikle iltskylle systemer for at forlænge fluorescens signalet og maksimere signal-støj-forholdet47,48 .
Blandt de tips til fejlfinding i smFRET balancerer de mange parametre, der er involveret i Imaging såsom laser effekt, eksponeringstid, cyklustid, og antallet af cyklusser for at maksimere fluorescens emission, forlænge eksperimentet varighed, og opnå passende prøvetagnings intervaller for enzym dynamikken. Længere observations tider og minimale effekter fra foto blegning er afgørende for at opnå high fidelity dtids fordelinger, der repræsenterer enzym dynamikken. ALEX genererer bedre histogrammer, da denne metode er udsat for lavere bidrag fra foto blegede partikler sammenlignet med enkelt farve-FRET. Men den tidsmæssige opløsning i ALEX er lavere end i enkelt farve-FRET.
Endelig lægger smFRET vægt på at påvise konformationelle/strukturelle ændringer i individuelle molekyler i realtid broer kløften mellem høj opløsning strukturelle teknikker (dvs., røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans, elektronmikroskopi), som giver atomare opløsning strukturelle detaljer under statiske forhold og bulk metoder, der leverer ensemble gennemsnit af en målbar egenskab. I mange henseender har smFRET vist sig at være en kraftfuld teknik til at studere biologiske systemer i realtid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Kong Abdullah University of Science and Technology gennem Core Funding og konkurrencedygtig Research Award (CRG3) til S. M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |