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Genetics

सेल डिवीजन के लाइव इमेजिंग के लिए Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60049
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of New Mexico

Summary

सेल डिवीजनों फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन और समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वास्तविक समय में कल्पना की जा सकती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, उपयोगकर्ताओं सेल विभाजन समय गतिशीलता, माइटोटिक धुरी विधानसभा, और गुणसूत्र कांग्रेस और अलगाव का विश्लेषण कर सकते हैं. आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) के बाद इन घटनाओं में दोष -मध्यस्थ जीन knockdown मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

Abstract

ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं ऊतक संस्कृति में mitosis का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं, एक तेजी से और उच्च throughput तरीके से इस मौलिक सेलुलर प्रक्रिया में आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान. S2 कोशिकाओं दोनों स्थिर और लाइव सेल इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल साबित कर दिया है. विशेष रूप से, लाइव सेल इमेजिंग कैसे हानि या एक जीन के दस्तक कोशिका विभाजन के दौरान प्रमुख घटनाओं की गतिज और गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, mitotic धुरी विधानसभा सहित, गुणसूत्र कांग्रेस, और अलगाव, के रूप में अच्छी तरह के रूप में समग्र सेल चक्र समय. यहाँ हम S2 कोशिकाओं का उपयोग sably fluorcently टैग mCherry के साथ transfected: $-tubulin mitotic धुरी और GFP चिह्नित करने के लिए:CENP:CENP-A (Drosophilaमें 'सीआईडी' जीन के रूप में संदर्भित) के समय पर कुंजी माइटोटिक जीन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए centromere चिह्नित करने के लिए सेल डिवीजनों, prophase से (विशेष रूप से परमाणु लिफाफा टूटने पर; NEBD) anaphase की शुरुआत करने के लिए. इस इमेजिंग प्रोटोकॉल भी mitosis भर में धुरी microtubule और गुणसूत्र गतिशीलता के दृश्य के लिए अनुमति देता है. इसमें, हम एक सरल अभी तक व्यापक प्रोटोकॉल है कि पाठकों को आसानी से लाइव इमेजिंग प्रयोगों के लिए S2 कोशिकाओं को अनुकूलित करने की अनुमति देगा प्रदान करना है. ऐसे प्रयोगों से प्राप्त परिणामों को कई एक साथ और गतिशील घटनाओं में अपनी भूमिका को परिभाषित करके कोशिका विभाजन में शामिल जीनों की हमारी समझ का विस्तार करना चाहिए। इस सेल संस्कृति प्रणाली में किए गए प्रेक्षणों को मान्य किया जा सकता है और आगे मक्खियों में आनुवंशिक दृष्टिकोण के प्रभावशाली टूलकिट का उपयोग करते हुए विवो में जांच की जा सकती है।

Introduction

कोशिका प्रभाग एक प्रक्रिया है जो सभी बहुकोशिकीय जीवों के लिए महत्वपूर्ण है, दोनों के विकास और होमियोस्टेसिस1में। Drosophila लंबे समय सेल विभाजन के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, विभिन्न ऊतक प्रकार और आनुवंशिक प्रक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने की स्थिति में प्रयोगों के साथ. जबकि इन अंतर्दृष्टि के कई निश्चित सेल शर्तों से आते हैं, सेल विभाजन कई चलती भागों के साथ एक गतिशील प्रक्रिया है, जीना कोशिकाओं के दृश्य बनाने के लिए RAi या आनुवंशिक नॉकआउट प्रभाव सेल विभाजन के कई भागों पर आकलन करने के लिए अभिन्न बनाने, सहित धुरी गठन, गुणसूत्र कांग्रेस और अलगाव, और साइटोकिनेसिस.

कई प्रोटोकॉल विकसित किया गया है और विवो में Drosophila सेल डिवीजनों कल्पना करने के लिए वर्षों में उपयोग किया गया है। विभिन्न समूहों ने लार्वा कल्पना डिस्क और लार्वा दिमाग2,3,4,5,6,7,8 दोनों में विभाजनों को छवि बनाने के लिए तकनीकों की खेती की है . इन तकनीकों, जबकि विशिष्ट ऊतकों में इमेजिंग के लिए उपयोगी, प्रवाह में सीमित कर रहे हैं और अक्सर पीढ़ी और आनुवंशिक शेयरों के रखरखाव की आवश्यकता के लिए फ्लोरोसेंट घटकों उत्पन्न और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन. Drosophila से सुसंस्कृत S2 कोशिकाओं को तेजी से कोशिका विभाजन में विभिन्न जीन ों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रदान करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन transfect करने की क्षमता के साथ, S2 कोशिकाओं को जल्दी से सेल विभाजन के कई घटकों पर RNAi knockdown के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. ब्याज की फ्लोरीसेंटी टैग किए गए जीनों को कोशिका विभाजन में भी देखा जा सकता है, जिससे उनके कार्य की गतिशील विशेषता9की अनुमति दी जा सकती है।

यहाँ हम Mitotic S2 कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान तरीकों हम हाल ही में वर्णित का उपयोग कर10. हमारी विधि microtubules और centromeres जिनकी अभिव्यक्ति एक तांबे के लिए प्रेरक promotor (metallothionein; पीएमटी) के नियंत्रण में हैं के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ stably transfected कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है. इस पद्धति बुनियादी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक अपेक्षाकृत सरल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग mitosis के सभी चरणों में धुरी और गुणसूत्र गतिशीलता छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह आगे व्यक्तिगत अनुसंधान की जरूरत फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, क्षणिक transfection और RNAi mitosis में उम्मीदवार जीन की भूमिका का निर्धारण करने के लिए विस्तारित संभावनाओं की पेशकश के साथ. प्रोटोकॉल के रिश्तेदार सादगी की वजह से, यह छोटे पैमाने पर नुकसान के समारोह स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता जीन की पहचान करने के लिए जिसके लिए vivo में आगे अध्ययन फायदेमंद होगा, और अधिक ध्यान केंद्रित प्रयासों और बाद में आनुवंशिक के साथ दक्षता के लिए अनुमति देता है मक्खियों में हेरफेर।

Protocol

1. आरएनएई के साथ उपचार के लिए एस 2 कोशिकाओं की तैयारी

  1. confluent PMT की एक शेयर संस्कृति से:GFP:सीआईडी और पीएमटी:मचेरी: जेड-ट्यूबुलिन stably transfected S2 कोशिकाओं ($80% व्यवहार्य; 24-28 डिग्री सेल्सियस पर हो), एक 6 अच्छी तरह से बाँझ संस्कृति प्लेट में बीज कोशिकाओं 1 x 106 कोशिकाओं / पूरक Schneider कीट मीडिया (सिम).
    नोट:     Stably transfected S2 कोशिकाओं Drosophila RNAi स्क्रीनिंग सेंटर (DRSC) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells) से एक प्रोटोकॉल का पालन करके उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि विशिष्ट स्थिर S2 लाइन यहाँ इस्तेमाल GFP और mCherry का इस्तेमाल करता है, कई विकल्प इन फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम के साथ ही दूसरों के भीतर दोनों मौजूद हैं. इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक विस्तृत चर्चा इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, लेकिन उनके गुणों और संभावित लाभ /
    1. एक सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना, confluent सेल स्टॉक के घनत्व का निर्धारण.
    2. 4 एमएल (उदा., ख्4 x 106 कुल कोशिकाओं) की कुल मात्रा में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल को प्राप्त करने के लिए आवश्यक संप्रवाही सेल निलंबन की मात्रा निर्धारित करें। 4 एमएल/अच्छी तरह से कुल मात्रा बनाने के लिए ताजा सिम की एक मात्रा के लिए सेल स्टॉक के इस मात्रा जोड़ें। सेल स्टॉक (सेल/एमएल) के घनत्व का निर्धारण मीडिया के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ स्टॉक फ्लास्क से सीधे 100 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को कम करके और इस 1:2 कमजोर पड़ने की गिनती या तो मैन्युअल रूप से एक हेमोसाइटोमीटर के साथ या यदि उपलब्ध हो तो एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ।
      नोट: यदि S2 कोशिकाओं का उपयोग नहीं stably transfected, एक क्षणिक transfection परख के साथ fluorcently टैग (GFP, mCherry, आदि) - या जेड-tubulin, और एक डीएनए मार्कर (CENP-A, Histone H2B, आदि) प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, विभिन्न माइटोटिक धुरी और डीएनए मार्करों के साथ stably transfected सेल लाइनों Drosophila जेनेटिक्स संसाधन केंद्र है कि बेहतर उपयोगकर्ता की सटीक प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुरूप हो सकता है से उपलब्ध हैं (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
    3. 36-48 एच के लिए 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ताजा बीज वाली कोशिकाओं को रखें।

2. ब्याज की जीन (ओं) के खिलाफ dsRNA के साथ सीड कोशिकाओं का उपचार

नोट: निम्नलिखित उदाहरण और परिणाम अनुभाग शॉर्टस्टॉप (शॉट), ब्याज के जीन के रूप में एक actin-microtubule crosslinking एजेंट का उपयोग करेगा. कोई dsRNA के साथ या एक अप्रासंगिक जीन के खिलाफ निर्देशित dsRNA के साथ एक नकली उपचार का प्रयोग करें (जैसे, बीटा-galactosidase, लाख]) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में.

  1. गर्म Schneider कीट मीडिया FBS के साथ पूरक नहीं (सीरम मुक्त मीडिया; एसएफएम) 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में।
  2. पहले से वरीयता प्राप्त अच्छी तरह से स्थानांतरण कोशिकाओं (चरण 1.1.2 से) एक 15 एमएल बाँझ ट्यूब में, स्थानांतरित कोशिकाओं की कुल मात्रा टिप्पण.
    1. एक सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर में गिनती के लिए कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा ($100 $L)।
  3. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर centrifuging द्वारा धीरे गोली कोशिकाओं।
    1. जबकि अपकेंद्रण कोशिकाओं, एक सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर प्रति एमएल कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करते हैं। कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए centrifuged किया जा रहा कुल मात्रा से इस संख्या गुणा (1.2.2.) में नोट किया गया.
  4. गोलीकोशिकाओं से अधिनातंत को प्रेरित करें।
  5. 3 x 106 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता प्राप्त करने के लिए गर्म एसएफएम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    1. एक 6 अच्छी तरह से थाली में एक नया अच्छी तरह से करने के लिए resuspended कोशिकाओं के 1 एमएल स्थानांतरण.
  6. शॉट (या ब्याज के लक्ष्य जीन) के खिलाफ dsRNA के 10-50 डिग्री (RNAase मुक्त पानी के 100 डिग्री एल में पतला) जोड़ें और मिश्रण करने के लिए थाली घूमता है। कोशिकाओं में सीधे dsRNA तेज करने के लिए अनुमति देने के लिए 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 एच के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  7. 1 एच ऊष्मायन के दौरान, 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस पूरक सिम को गर्म करें।
  8. 1 एच के लिए dsRNA के साथ कोशिकाओं incubating के बाद, मीडिया के 1 एमएल को हटाने के बिना अच्छी तरह से सीधे अच्छी तरह से 2 एमएल जोड़ें.
  9. 3-7 दिनों के लिए 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखें।
    नोट: dsRNA एकाग्रता के साथ के रूप में, कुल उपचार समय वांछित लक्ष्य जीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. आरएनएई प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, लक्ष्य जीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पूरे सेल lysates पर एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन. यदि प्रारंभिक dsRNA लक्ष्य अनुक्रम अप्रभावी साबित होता है, वैकल्पिक dsRNAs लक्ष्य जीन के भीतर अद्वितीय दृश्यों को लक्षित डिजाइन.

3. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी का प्रेरण

  1. यदि stably transfected कोशिकाओं PMT प्लाज्मिड का उपयोग कर उत्पन्न किया गया (एक inducible धातुlothionein promotor युक्त) के रूप में यहाँ वर्णित, तांबे सल्फेट के साथ कोशिकाओं के इलाज के द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित (CuSO4) के एक अंतिम एकाग्रता पर इमेजिंग से पहले 24-36 एच के लिए 500 डिग्री और आरएनएआई उपचार के 4 दिनों के बाद। इस तरह के pAct के रूप में संरचक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का उपयोग तांबे प्रेरण की आवश्यकता नहीं है।
  2. इमेजिंग के लिए सेल तैयार करें
    1. 1 एच के लिए 24-28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस पूरक सिम को गर्म करें।
    2. स्थानांतरित कोशिकाओं की कुल मात्रा टिप्पण, एक 15 एमएल बाँझ ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण।
      1. एक सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर में गिनती के लिए कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा ($100 $L)।
    3. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर centrifuging द्वारा धीरे गोली कोशिकाओं।
      1. जबकि अपकेंद्रण कोशिकाओं, एकाग्रता निर्धारित (कोशिकाओं / एमएल) एक सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर. कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए centrifuged किया जा रहा कुल मात्रा से इस संख्या गुणा (2.2.2.) में नोट किया गया.
    4. गोलीकोशिकाओं से अधिनातंत को प्रेरित करें।
    5. ताजा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित, गर्म 10% FBS पूरक सिम की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं / 500 डिग्री सेल्सियस एकाग्रता बनाए रखने के लिए CuSO4 की एक उचित राशि जोड़ें।
    6. एक बहु अच्छी तरह से रहते सेल चैम्बर के एक अच्छी तरह से करने के लिए फिर से निलंबित कोशिकाओं के 200-500 $L स्थानांतरण और उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर जगह है। इमेजिंग प्रयोगों से पहले 15-30 मिनट के लिए कक्ष में व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें।
      नोट: लाइव सेल चैम्बर कुओं अतिरिक्त पालन के लिए पाली-एल-lysine के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है।

4. एक लाइव सेल इमेजिंग प्रोग्राम सेट करें

नोट: इस प्रयोग में लाइव सेल इमेजिंग एक उल्टे इमेजिंग प्रणाली और उसके संबद्ध सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, ओलिंप IX83 cellSens आयाम सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. विवरण माइक्रोस्कोप निर्माता और सॉफ्टवेयर पैकेज द्वारा अलग होगा; इस प्रकार, सामान्य दिशानिर्देश और संचालन नीचे सूचीबद्ध हैं।

  1. उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप चलाता है कि सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, समय के साथ एक सेल (या कोशिकाओं) इमेजिंग के लिए एक कार्यक्रम तैयार करते हैं.
    1. सॉफ़्टवेयर डेस्कटॉप चिह्न पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर खोलें.
    2. फ़ाइलपर क्लिक करके एक नई प्रयोगात्मक फ़ाइल बनाएँ, तो नई प्रयोगात्मक फ़ाइल.
    3. सबसे पहले, एक समय चूक पाश जिस पर छवियों लिया जाएगा डालें। आइकन बार से स्टॉपवॉच आइकन (समयचूक लूप आइकन) पर क्लिक करके यह मत करो. प्रयोग प्रबंधक टैब में s में अंतराल सेट करें और फिर इच्छित समग्र प्रयोग लंबाई (में) को अंतराल से विभाजित करके उसी टैब में चक्रों की संख्या निर्धारित करें. पाश वांछित कुल समय अवधि से अधिक दोहराने के लिए अनुमति दें।
      नोट: आमतौर पर, छवियों 3-4 एच की अवधि में हर 30-60 s लिया जाता है।
    4. समय चूक पाश परत के भीतर, उद्देश्य का ध्यान बनाए रखने के लिए एक अवरक्त ध्यान जांच डालने (यदि उपलब्ध हो). ऐसा करने के लिए, दो तीर आइकन (चलो XY आइकन) के साथ स्क्वायर पर क्लिक करके और ड्रॉपडाउन मेनू से जेड-ड्रिफ्ट मुआवजा का चयन करके समय-चूक लूप परत के भीतर एक जेड-ड्रिफ्ट मुआवजा (जेडडीसी) कदम जोड़ें।
      नोट: अवरक्त फोकस जांच शब्द एक प्रणाली है जिसके द्वारा एक अवरक्त नाड़ी उद्देश्य और स्लाइड / कई माइक्रोस्कोप ऐसी एक प्रणाली है, अपने स्वयं के स्वामित्व नामकरण के साथ प्रत्येक. पाठकों को विशिष्ट नामकरण विवरण के लिए अपने ऑपरेशन मैनुअल या प्रतिनिधि से परामर्श करना चाहिए।
    5. अवरक्त ध्यान की जाँच के बाद, प्रोग्राम में एक कदम जोड़ने के लिए एक multichannel छवि लेने के लिए (उदाहरण के लिए, FITC GFP और TRIC mCherry के लिए) एक 3-5 z-stacks पर पहले एक z स्टैक कदम डालने से, तो चैनल निर्दिष्ट करें. Color Wheel आइकन (मल्टीचैनल समूह चिह्न) पर क्लिक करके टाइम-लैप लूप परत में Multichannelसमूह परत जोड़कर ऐसा करें. इसके बाद, 3-परत वाले आइकन पर क्लिक करके Multichannel समूह परत के भीतर एक $-स्टैक लूप परत जोड़ें (जेड-स्टैक लूप आइकन). प्रयोग प्रबंधक टैब में वांछित कदम आकार और स्लाइस की संख्या सेट और photobleaching को कम करने के लिए संभव के रूप में कम के रूप में प्रत्येक चैनल के प्रदर्शन सेट.
      नोट: एल ई डी के लिए z-स्टैक अंतराल, जोखिम समय, और प्रतिशत संचारण. इन प्रयोगों में विशिष्ट, तीन z-स्टैक का उपयोग करें जो 3 $m की श्रेणी में लिए गए हैं, जिससे प्रत्येक स्टैक के बीच 1 डिग्री उ का अंतराल हो सकता है. ऊपर और नीचे के बजाय सेल के केंद्र को परिभाषित करने से सबसे अच्छा परिणाम होता है। छवियाँ तो प्रत्येक चैनल के लिए एकत्र कर रहे हैं (एस) के एक जोखिम पर 50 एमएस और प्रतिशत संचारण 50% के साथ कोई तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्टर लगे हुए.

5. लाइव सेल इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग करके छवि विभाजित कोशिकाओं

नोट: S2 कोशिकाओं को ब्व्2 की आवश्यकता नहीं होती है और 23-27 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर ढंग से वृद्धि होती है। सभी इमेजिंग एक अच्छी तरह से नियंत्रित कमरे में परिवेश के तापमान पर किया गया था.

  1. नेत्र का उपयोग करना, अच्छी तरह से ऊपर (या नीचे) कोने खोजने के लिए और mCherry (जेड-tubulin) चैनल का उपयोग कर कोशिकाओं पर उद्देश्य (40-60x तेल विसर्जन) ध्यान केंद्रित.
  2. ऊर्ध्वाधर अच्छी तरह से विभाजक से दूर ले जाने के लिए अच्छी तरह से ऊपर (या नीचे) के साथ स्कैन करें।
    नोट: इमेजिंग भी अच्छी तरह से डिवाइडर के करीब अवरक्त ध्यान चेक के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
  3. एक सेल (या कक्ष) जो देर से G2 या प्रारंभिक M-चरण (प्रोफेज) में हैं ढूँढें.
    नोट: इन कोशिकाओं को सबसे अच्छा बिल्कुल दो 'स्टार की तरह' microtubule संरचनाओं (centrosomes) और एक बरकरार नाभिक के अस्तित्व से पहचाना जा सकता है (सेल के भीतर अपवर्तित प्रकाश के एक परिपत्र क्षेत्र द्वारा इंगित), दोनों आसानी से प्रतिष्ठित का उपयोग कर $-tubulin (लाल) उत्तेजना फिल्टर. पहले के अंतर-चरण में कोशिकाओं का चयन, जो एक या शून्य से आसानी से दृश्यमान सेन्ट्रोसोम द्वारा उल्लेखनीय है, जी 2/एम प्रगति में अंतराल के कारण व्यर्थ समय का परिणाम हो सकता है। इसके विपरीत, NEBD के बाद कोशिकाओं का चयन mitotic समय और जल्दी धुरी विधानसभा और गुणसूत्र गतिशीलता के इमेजिंग की सटीक गणना को रोकने जाएगा. इसके अलावा, S2 कोशिकाओं में अक्सर होते हैं और 2 सेन्ट्रोसोम. हालांकि इन आम तौर पर एक द्विध्रुवी धुरी में समूहों12, यह सलाह दी जाती है कि उपयोगकर्ताओं को इन कोशिकाओं से परहेज जब तक अन्यथा प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए वांछित. छवियाँ और चयन करने के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की चर्चा प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में पाया जा सकता है.
  4. सॉफ़्टवेयर स्क्रीन में कक्षों को देखना प्रारंभ करने के लिए Live दृश्य बटन क्लिक करें. माइक्रोस्कोप के ठीक ध्यान घुंडी का उपयोग करना, ब्याज की सेल (या कोशिकाओं) ध्यान केंद्रित. सेट फोकस बटन पर क्लिक करके अवरक्त फोकस जाँच सेट करें.
  5. प्रारंभ बटन पर क्लिक करके समय चूक इमेजिंग प्रोग्राम प्रारंभ करें. वांछित चैनल का चयन करके और स्पष्ट रूप से ब्याज की सेल (या कोशिकाओं) को देखने के लिए मतलब पिक्सेल तीव्रता समायोजित करके की जरूरत के रूप में हिस्टोग्राम समायोजित करें।
  6. कार्यक्रम को चलाने के लिए अनुमति दें, 15-20 मिनट के बाद सेल की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि परमाणु लिफाफा टूटने (NEBD) हुआ है, जो दौर अंधेरे, सेल केंद्र के पास एक refracted स्थान के गायब होने से निर्धारित होता है.
  7. कार्यक्रम को चलाने के लिए अनुमति जारी रखें, आवर्तक रूप की जाँच (हर 15-20 मिनट) एक बार anaphase शुरुआत हुई है निर्धारित करने के लिए. यदि कुल समयावधि में अधिक समय शेष है, तो इस बिंदु पर प्रोग्राम रोकें और फ़ाइल सहेजें. वैकल्पिक रूप से, यदि telophase और cytokinesis के दौरान घटनाओं ब्याज की हैं, कार्यक्रम के लिए एक पर्याप्त समय चलाने के लिए इन प्रक्रियाओं के रूप में अच्छी तरह से छवि की अनुमति दें.
  8. NEBD का विश्लेषण करने के लिए anaphase शुरुआत समय के लिए NEBD (टीNEBD) मिनट में और प्रारंभिक गुणसूत्र जुदाई के समय टिप्पण द्वारा (tanaphase शुरुआत) मिनट में और tNEBD tanaphase शुरुआत से घटाकर प्राप्त करने के लिए किसी दिए गए सेल के लिए एनेफेज शुरुआत समय के लिए NEBD.
    1. फ्रेम अप बटन पर क्लिक करके और फ़्रेम को नोट करके जहां NEBD और anaphase शुरुआत होती है, इन ्हें घटाकर बीतने की फ्रेम की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए, और इमेजिंग फ़्रेम्स के बीच समय अंतराल से यह गुणा.
  9. किसी दी गई शर्त के लिए एकाधिक n's प्राप्त करने के लिए पूर्व-विभाजित कक्षों के लिए स्कैनिंग जारी रखें. कोशिकाओं को उनके प्रारंभिक बसने के बाद 12 एच तक के लिए लाइव सेल चैम्बर में अच्छी तरह से छवि की जा सकती है।

Representative Results

विधियों का वर्णन हम ऊपर का वर्णन Drosophila S2 कोशिकाओं की पहचान और इमेजिंग सेल विभाजन के दौर से गुजर में परिणाम होगा. जिन कोशिकाओं को विभाजित करने के बारे में हैं (यानी, एम चरण में प्रवेश करने से पहले) दो सेन्ट्रोसोम की उपस्थिति और एक बरकरार नाभिक द्वारा लक्षित किया जा सकता है जो अपवर्तित प्रकाश द्वारा इंगित किया जाता है और कक्ष के भीतर एक गहरा स्थान जब सेल के भीतर देखा जाता है (चित्र1, बाएं सबसे पैनलों, लाल चैनल; चित्र 1कमें तीर शीर्ष । हम अनुमान है कि लगभग 2-5% कोशिकाओं के इस श्रेणी में आते हैं, और इमेजिंग प्रयोगों के बीच, हम आम तौर पर एक और योग्य सेल के लिए स्कैनिंग 2-3 मिनट की एक अधिकतम खर्च करते हैं. NEBD इस अंधेरे स्थान के गायब होने के माध्यम से कल्पना की जा सकती है, कोशिका द्रव्य की एक समान रंग में जिसके परिणामस्वरूप (चित्र 1, पैनल ों के रूप में चिह्नित "00:00", लाल). NEBD के बाद, समय प्रत्येक सेल धुरी बनाने के लिए लेता है, कांग्रेस गुणसूत्रों, और अलग गुणसूत्रों बस NEBD के सापेक्ष इन घटनाओं के समय अंक टिप्पण द्वारा मापा जा सकता है.

हम इन डिवीजनों का उपयोग करने के लिए mitotic समय का आकलन, विशेष रूप से NEBD के anaphase शुरुआत करने के लिए, बिंदु जिस पर गुणसूत्रों को अलग करने के लिए शुरू टिप्पण. बहुमत ($90%) कॉपर-प्रेरित कोशिकाओं की, दोनों mCherry व्यक्त की: $-tubulin और GFP:CID. कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत ($10%) केवल एक मार्कर या न तो व्यक्त की. सेल चयन के दौरान इन कोशिकाओं से बचा गया था। सामान्यतया, S2 कक्ष NEBD को 20-30 मिनट के बीच के anaphase शुरुआत समय के लिए प्रदर्शित करते हैं (चित्र 1A, नियंत्रण). हम अगले शॉर्टस्टॉप (शॉट) के खिलाफ लक्षित dsRNA के साथ कोशिकाओं का इलाज किया, एक actin-microtubule crosslinking प्रोटीन हम संदिग्ध सेल चक्र गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है. वास्तव में, शॉट नॉकडाउन कोशिकाओं के बाद एक महत्वपूर्ण माइटोटिक देरी का प्रदर्शन किया (चित्र 1B, ShotRNAi देरी), कई कोशिकाओं metaphase पर गिरफ्तार करने और पूरे 2-3 घंटे इमेजिंग प्रयोग के दौरान anaphase करने के लिए संक्रमण कभी नहीं के साथ (चित्र 1D, ShotRNAi गिरफ्तारी). हमने तर्क दिया कि इस विलंब/गिरफ्तारी फीनोटाइप की संभावना धुरी विधानसभा जांच चौकी (यानी एम-चरण जांच चौकी) के सक्रियण के कारण हो सकती है। सीधे इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम शॉट और रफ डील (रोड) के खिलाफ dsRNA के साथ कोशिकाओं का सह इलाज, इस जांच की चौकी13का एक महत्वपूर्ण घटक है। इससे गिरफ्तारी फीनोटाइप का दमन हुआ, जिसके परिणामस्वरूप NEBD को नियंत्रण के समान एनेफेज बार (चित्र 1C, ShotRNAi+RodRNAi) के समान हो गया। इस प्रकार, इस लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल हमें निष्कर्ष है कि शॉट समय पर एम चरण प्रगति के लिए आवश्यक है और यह कि इसके नुकसान की जांच की चौकी सक्रियण की ओर जाता है कि देरी या mitotic कोशिकाओं को गिरफ्तार करने की अनुमति दी.

Figure 1
चित्रा 1: लाइव इमेजिंग S2 कोशिकाओं में माइटोटिक जांच की चौकी सक्रियण के कारण सेल चक्र दोष का पता चलता है.
सभी स्थितियों में, लाइव-सेल इमेजिंग S2 कोशिकाओं पर stably सह-transfected inducable GFP के साथ आयोजित किया गया:सीआईडी और mCherry: यहाँ वर्णित के रूप में Tubulin. (क) कार्टून mitosis के दौरान महत्वपूर्ण स्थलों वर्णन, और इसी छवियों संकेत जीनोटाइप के प्रतिनिधि फिल्मों से दिखाया जाता है समय अंक के साथ NEBD के सापेक्ष (t$00:00) संकेत दिया. नियंत्रण कक्ष आमतौर पर 20-30 मिनट के भीतर anaphase के लिए प्रगति. ShotRNAi इलाज कोशिकाओं NEBD-anaphase देरी प्रदर्शित (बी) और अक्सर मेटाफेज गिरफ्तारी से गुजरना, इमेजिंग प्रयोग के भीतर anaphase में प्रवेश कभी नहीं (डी) . ShotRNAi और RodRNAi, धुरी विधानसभा जांच की चौकी का एक घटक के साथ कोशिकाओं के सह उपचार, शॉट phenotype नियंत्रण कोशिकाओं के समान anaphase शुरुआत गतिकी के लिए अग्रणी दबा (सी). (ए) मेंतीर 'स्टार-जैसे' सेन्ट्रोसोम संरचनाओं को इंगित करते हैं, और बड़े ऐरोहेड नाभिक को इंगित करते हैं। प्रत्येक पैमाने पर बार 5 microns का प्रतिनिधित्व करता है. यह आंकड़ा अनुकूलित और10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: 'नियंत्रण' S2 सेल डिवीजन के समय चूक फिल्म. वीडियो 'नियंत्रण' जीनोटाइप में S2 सेल डिवीजन के एक प्रतिनिधि फिल्म से पता चलता है. यह फिल्म चित्र 1Aसे मेल खाती है. इस वीडियो को10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) से अनुमति के साथ अनुकूलित और पुनर्प्रकाशित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.

वीडियो 2: देरी 'ShotRNAi' S2 सेल डिवीजन की समय चूक फिल्म. वीडियो 'ShotRNAi' जीनोटाइप में S2 सेल डिवीजन के एक प्रतिनिधि फिल्म से पता चलता है कि एक phenotypic माइटोटिक देरी की ओर जाता है. यह फिल्म चित्र 1Bसे मेल खाती है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.

वीडियो 3: 'ShotRNAi + RodRNAi' S2 सेल डिवीजन की टाइम-लैप्स फिल्म। वीडियो 'ShotRNAi + RodRNAi' जीनोटाइप में S2 सेल डिवीजन के एक प्रतिनिधि फिल्म से पता चलता है. यह फिल्म चित्र 1Cसे मेल खाती है। इस वीडियो को10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) से अनुमति के साथ अनुकूलित और पुनर्प्रकाशित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.

वीडियो 4: गिरफ्तार 'ShotRNAi' S2 सेल डिवीजन की समय चूक फिल्म. वीडियो 'ShotRNAi' जीनोटाइप में S2 सेल डिवीजन के एक प्रतिनिधि फिल्म से पता चलता है कि एक phenotypic माइटोटिक गिरफ्तारी की ओर जाता है. यह फिल्म चित्र 1Dसे मेल खाती है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.

Discussion

एक उपयुक्त सेल की पहचान

इमेजिंग विभाजन S2 कोशिकाओं के लिए कुंजी पहले उचित सेल का पता लगाने है. समय इमेजिंग कोशिकाओं है कि गलती से विभाजित करने के लिए तैयार होने के लिए सोचा है, लेकिन एक उचित समय सीमा में ऐसा करने में विफल बर्बाद किया जा सकता है. कोशिकाओं की पहचान की जानी चाहिए जिनके पास दो अलग और दृश्यमान सेन्ट्रोसोम और एक बरकरार केंद्रक हो। Centrosomes microtubule फाइबर उन से बाहर निकालना होगा, उन्हें एक "स्टार की तरह" उपस्थिति दे रही है. फोकस का समायोजन करते समय एक बरकरार नाभिक प्रकाश को अपवर्तित करता है, और सेल के अनुमानित केंद्र को उपस्थिति में गहरा भी बनाता है। नाभिक भी GFP शामिल होंगे: CID "डॉट्स", अपनी पहचान में मदद करने के लिए एक और विशिष्ट सुविधा. साथ कोशिकाओं के साथ gt;2 सेन्ट्रोसोम, ट्यूबुलिन फाइबर के बिना उन से बाहर निकालती है, या केवल एक सेंट्रोसोम के साथ कोशिकाओं से बचा जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यदि दो सेन्ट्रोसोम दिखाई देते हैं, लेकिन एक नाभिक नहीं है, NEBD पहले ही उत्पन्न हो चुका है और यदि पूर्ण एम-चरण विश्लेषण वांछित है तो कोशिका अपने विभाजन में बहुत अधिक उन्नत है। एक बार एक उपयुक्त सेल पाया जाता है, इमेजिंग शुरू करने में गति महत्वपूर्ण है के रूप में NEBD जल्दी होता है (आमतौर पर 3-5 मिनट के भीतर) और इमेजिंग की शुरुआत में देरी चूक अवसरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में सेल को जल्दी से इस तरह केंद्रित करें कि दोनों सेन्ट्रोसोम दिखाई दे रहे हैं, या यदि सेन्ट्रोसोम एक दूसरे के साथ विमान से बाहर हैं, तो दोनों के बीच फोकस बिंदु सेट करें, ताकि प्रत्येक को तब कैप्चर किया जा सके जब निर्धारित केंद्र के ऊपर और नीचे ढेर एकत्र किए जाते हैं बिंदु. एक बार ध्यान केंद्रित, तुरंत मंच और लाइव सेल कक्ष सतह अवरक्त फोकस की जांच का उपयोग कर के बीच ऑफसेट सेट (यदि उपलब्ध हो) और इमेजिंग कार्यक्रम शुरू करते हैं. हालांकि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशेष रूप से NEBD-से-anaphase गतिशीलता का आकलन प्रयोगों के लिए सिलवाया है, सरल संशोधनों वैकल्पिक mitotic घटनाओं का अध्ययन पाठकों के अनुरूप सकता है. NEBD-to-metaphase और anaphase-to-telaphase इमेजिंग के लिए, हम सुझाव है कि 10 s छवि पर कब्जा अंतराल के रूप में इन प्रक्रियाओं अत्यधिक गतिशील हैं और S2 कोशिकाओं में जल्दी से हो (5-10 मिनट). मेटाफेज-टू-एनाफेज संक्रमण (हमारे विशिष्ट प्रयोगात्मक फोकस) S2 कक्षों में एक लंबी प्रक्रिया (20-30 मिनट) है, और हम 30 s अंतराल पर छवियों को इकट्ठा करते हैं। अंत में, telophase के माध्यम से cytokinesis S2 कोशिकाओं में काफी धीरे धीरे होता है, और हम सुझाव है कि 60 s अंतराल इस अनुमानित घंटे लंबी प्रक्रिया के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान.

इमेजिंग प्रोग्राम के दौरान फोकस बनाए रखना

यदि एक अवरक्त ध्यान जांच डिवाइस उपलब्ध नहीं है, माइक्रोस्कोप या तालिका यह पर बैठता bumping से बचने के लिए सुनिश्चित हो, के रूप में इस सेल इमेजिंग कार्यक्रम के दौरान ध्यान से बाहर चलती में परिणाम कर सकते हैं, अस्पष्ट, संयुक्त राष्ट्र व्याख्या परिणाम के लिए अग्रणी. पाली-एल-lysine के साथ लाइव सेल चैम्बर कुओं पूर्व-कोटिंग सेल पालन में मदद कर सकते हैं, जो सेल आंदोलन से बचने में मदद कर सकते हैं और अवरक्त ध्यान चेक के बिना setups के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अतिरिक्त, सदमे को अवशोषित प्लेटफार्मों या हवा तालिकाओं सहित setups आगे ध्यान से बाहर जाने कोशिकाओं से बचने में मदद कर सकते हैं. अंत में, कुछ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपयोगकर्ता refocus और प्रोग्राम को फिर से शुरू करने की अनुमति कार्य ों थामने है.

एकाधिक कक्षों को इमेजिंग करना

डेटा के संचय के लिए उपयोगी यह है कि अक्सर कई कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए तैयार इमेजिंग के लिए देखने के एक ही क्षेत्र के भीतर रखा जा सकता है. यह उन प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जिनमें कोशिकाओं में लंबे समय तक एम-चरण अवधि या लंबे समय तक गिरफ्तारी होती है (उदाहरण के लिए, स्थितियां जो एसएसी के सक्रियण को प्रेरित करती हैं)। इन कोशिकाओं के लिए, हम आम तौर पर छवि जब तक कोशिकाओं photobleached हैं (लगभग 2-3 एच), लेकिन गिरफ्तार कोशिकाओं का पूरा समय शोधकर्ता के विवेक पर होना चाहिए. कभी-कभी एकाधिक पूर्व-विभाजित कोशिकाएं विभिन्न फोकल विमानों में हो सकती हैं, इस स्थिति में सभी कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए z-स्टैक जोड़ना उपयोगी हो सकता है। अधिक z स्टैक जोड़ना भी रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है। सावधानी ऐसा करने में लिया जाना चाहिए, तथापि, के रूप में यह अधिक विकिरण के लिए कोशिकाओं को बेनकाब और जल्दी photobleaching के लिए नेतृत्व, साथ ही हार्ड डिस्क भंडारण उपकरणों पर बड़ी फ़ाइल आकार के लिए नेतृत्व करेंगे.

फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी से बचना

हमारी विधि जोखिम समय के लिए विशिष्ट सेटिंग्स का वर्णन, इमेजिंग अंतराल, z ढेर, और हमारे एलईडी प्रकाश स्रोत है कि आम तौर पर हमारे प्रयोगात्मक सेटअप और वांछित परिणामों के लिए काम के लिए प्रतिशत संचारण. के रूप में माइक्रोस्कोप और प्रयोगात्मक लक्ष्यों को भिन्न हो सकते हैं, क्या हमारी प्रणाली के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं समय से पहले photobleaching या दूसरों में phototoxicity के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. फोटोडैमेज में धुरी आंदोलन, माइक्रोट्युबल विखंडन, दोषपूर्ण माइक्रोट्युबल गतिशीलता, और लंबे समय तक धुरी जांच चौकी सक्रियण की कमी हो सकती है। इस तरह के नुकसान से बचने के लिए एक संभावित तरीका जोखिम समय को सीमित करने के लिए है। अधिकांश आधुनिक कैमरों अब व्यापक गतिशील पर्वतमाला के अधिकारी, और histograms भी बहुत कम जोखिम पर संरचनाओं कल्पना करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. एक अन्य तकनीक इमेजिंग अंतराल को बढ़ाने के लिए है (जैसे, छवियों के बीच कई मिनट के लिए) इस तरह है कि बार एक सेल की संख्या एक कुल संग्रह अंतराल पर प्रकाश के संपर्क में है कम है. यह विशेष रूप से समय की लंबी अवधि के लिए इमेजिंग में फायदेमंद है (कई घंटे), और इसके अलावा इस तरह के प्रयोगों के फ़ाइल आकार को कम करने में मदद कर सकते हैं. लिया z ढेर की संख्या सीमित भी प्रकाश जोखिम को कम करने में मदद कर सकते हैं, का उपयोग कर 2 या यहां तक कि सिर्फ 1 के बजाय 3. इसके अलावा, प्रकाश का प्रतिशत संचरण समायोजन (एलईडी प्रकाश स्रोतों के लिए), या तटस्थ घनत्व का उपयोग (एनडी) फिल्टर (दोनों Halogen दीपक और एलईडी प्रकाश स्रोतों के लिए) प्रकाश की तीव्रता में कमी होगी और अब जोखिम समय के साथ युग्मित दृश्यता बनाए रख सकते हैं . पहले से ही अलग centrosomes के साथ कोशिकाओं को चुनने के द्वारा, समग्र जोखिम में सीमित किया जा सकता है कि इन कोशिकाओं को आम तौर पर mitosis जल्दी में प्रवेश (एक या दो मिनट के भीतर) इमेजिंग शुरुआत के बाद. एक भी समय है कि कोशिकाओं को NEBD से पहले छवि की अनुमति दी जाती है सीमित कर सकते हैं. हमारी प्रयोगशाला आम तौर पर 10 मिनट पर इस समय सेट, लेकिन एक अधिक रूढ़िवादी सीमा आसानी से उपयोगकर्ता द्वारा लगाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एक और अधिक 'आक्रामक' उपाय हम अनुशंसा करते हैं dsRNA SAC के एक घटक के खिलाफ लक्षित के साथ उपचार है (जैसे रॉड या Mad2). यदि एक गिरफ्तारी phenotype गैर विशिष्ट सेल क्षति (जैसे, दोषपूर्ण microtubule गतिशीलता) के कारण है, इस तरह के एक इलाज कम मूल प्रयोग में ब्याज की जीन के एक सदाशयी प्रभाव की तुलना में गिरफ्तारी को दबाने की संभावना है.

भविष्य की दिशा

यहाँ वर्णित विधि तेजी से छवि लाइव सेल डिवीजनों के लिए एक अपेक्षाकृत सरल epifluorescent माइक्रोस्कोप पर उपयोग किया जा सकता है और आसानी से एक शोधकर्ता के विशेष प्रयोगात्मक डिजाइन और लक्ष्यों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है. culturing के लिए कई उत्कृष्ट तरीकों, RNAi दस्तक दृष्टिकोण, क्षणिक transfection, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी S2 और अन्य Drosophila कोशिकाओं9,14,15के लिए प्रकाशित किया गया है, 16 , 17.हमारा प्रोटोकॉल कुछ फायदे प्रदान करता है. (1) एक डबल स्थिर सेल लाइन का उपयोग (GFP:CID, मची:जेड-Tubulin) एक साथ दो प्रमुख mitotic संरचनाओं के निशान, परेशानी और क्षणिक परिवर्तन की संभावित जटिलताओं से बचा जाता है, और यह सुनिश्चित करता है कि लगभग सभी कोशिकाओं के रूप में फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करेंगे इमेजिंग के लिए संभावित उम्मीदवार. (2) माइटोसिस के लिए अनुकूलन गतिशील, गैर-विभाजित कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल गतिशीलता की जांच प्रकाशित प्रोटोकॉल के लिए कहते हैं और वास्तविक समय में माइटोटिक घटनाओं की जांच करने के लिए फैली हुई है। जबकि हमें विश्वास है कि हमारा एक शक्तिशाली तकनीक है कि दूसरों के प्रदर्शनों की सूची में कहते हैं, वहाँ हमेशा सुधार किया जा सकता है. कोशिका विभाजन का एक विशेष क्षेत्र जिसे हमने छवि के लिए कठिन पाया है, वह है सेन्ट्रोसोम विभाजन। यह NEBD से पहले होता है और यह निर्धारित करने के लिए जब एक एकल सेंट्रोसोम दो में अलग करने के लिए तैयार है मुश्किल है। फ्लोरोसेंट सेल चक्र मार्करों का उपयोग करना (Cyclin A और Cyclin B) इस समस्या को हल करने में मदद कर सकता है, लेकिन सेल विभाजन घटकों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि चैनलों की कीमत पर आता है. सेंट्रोसोम विभाजन कल्पना करने के लिए प्रयास करने के लिए हमारी सबसे अच्छी रणनीति इमेजिंग प्रोग्राम (XY विमान में विभिन्न बिंदुओं को परिभाषित करने की छवि) के लिए multipoint अधिग्रहण जोड़ने के लिए है, लेकिन यह बड़ी फ़ाइलों में परिणाम कर सकते हैं, और यह भी (अंकों की संख्या पर निर्भर करता है) की आवश्यकता कर सकते हैं छवि संग्रह के बीच अंतराल में वृद्धि, जिसके परिणामस्वरूप फिल्म के समय संकल्प को कम. एक अन्य समाधान दवाओं है कि बाद में washout इमेजिंग से पहले के बाद washout द्वारा पीछा किया दवाओं का उपयोग कर एक वांछित सेल चक्र चरण में कोशिकाओं के तुल्यकालन हो सकता है, हालांकि इन तरीकों S2 कोशिकाओं में विशेष रूप से विश्वसनीय नहीं हो सकता है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से लाइव सेल इमेजिंग में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए एक नींव प्रदान करता है. बेहतर इमेजिंग और सॉफ्टवेयर प्रौद्योगिकी के साथ, उच्च क्षमता का उपयोग करइस प्रोटोकॉल के सही मायने में उच्च थ्रूपुट अनुकूलन, बहु-चेंबर प्लेटें संभव हो सकती हैं। इस तरह के नवाचारों बड़े पैमाने पर RNAi स्क्रीन, इस तरह के उन पहले से ही तय तैयारी में प्राप्त के रूप में 12 ,18,एक जीवित सेल प्रारूप में अधिक पथ्य बनाना होगा. छोटे अणु दवा स्क्रीन भी सेल विभाजन प्रक्रियाओं को लक्षित उपन्यास यौगिकों की पहचान करने के एक साधन के रूप में कल्पना की जा सकती है. फ्लोरोफोर्स और ऑप्टिकल फिल्टर में सुधार भी कई माइटोटिक घटकों की इमेजिंग के लिए नेतृत्व कर सकता है (न सिर्फ दो हम वर्णन), विशिष्ट माइटोटिक नियामकों की इमेजिंग और डीएनए और / उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ कोशिकाओं का उत्पादन है कि डीएनए क्षति के बाद या apoptosis के दौरान व्यक्त इन प्रक्रियाओं में शामिल उपन्यास जीन की पहचान करने के लिए उपयोगी उपकरण होगा. इसी तरह के दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट टैग cyclins19की अभिव्यक्ति का उपयोग कर सेल चक्र गतिशीलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 GM108756) द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम उदारता से हमें एक GFP के साथ उपलब्ध कराने के लिए गैरी Karpen (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले) के आभारी हैं: सीआईडी S2 सेल लाइन स्टॉक जिसमें से हमारे GFP:CID/mCherry: $Tubulin लाइन उत्पन्न किया गया था10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

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References

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जेनेटिक्स अंक 150 Drosophila,S2 कोशिकाओं Mitosis सेल चक्र लाइव-सेल इमेजिंग Mitotic धुरी क्रोमोसोम गतिशीलता mCherry: जेड-tubulin GFP: CENP-ए सीआईडी
सेल डिवीजन के लाइव इमेजिंग के लिए <em>Drosophila</em> S2 कोशिकाओं का उपयोग
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Dewey, E. B., Parra, A. S.,… More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

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