Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Abstract

Hierin presenteren we een efficiënte methode die kan worden uitgevoerd met elementaire laboratorium vaardigheden en-materialen om de chemokinetische beweging van lymfocyten in een ex vivo-transmigratie systeem te beoordelen. Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) en CD4+ T helper cellen werden geïsoleerd uit milt en longen van kip ei ovalbumine (OVA)-uitgedaagd Balb/c muizen. We bevestigden de uitdrukking van CCR4 op zowel CD4+ T-cellen als ILC2, relatief. CCL17 en CCL22 zijn de bekende liganden voor CCR4; Daarom onderzochten we met deze ex vivo-transmigratie methode CCL17- en CCL22-geïnduceerde beweging van CCR4+ lymfocyten. Om Chemokine gradiënten vast te stellen, werden CCL17 en CCL22 in de onderste kamer van het transmigratiesysteem geplaatst. Geïsoleerde lymfocyten werden vervolgens toegevoegd aan topkamers en over een periode van 48 uur werden de lymfocyten actief gemigreerd via 3 μm poriën naar de Chemokine in de onderste kamer. Dit is een effectief systeem voor het bepalen van de chemokinetica van lymfocyten, maar, begrijpelijkerwijs, niet nabootsen van de complexiteiten gevonden in de in vivo Organ micro-omgevingen. Dit is een beperking van de methode die kan worden overwonnen door de toevoeging van in situ beeldvorming van het orgel en lymfocyten onder studie. Het voordeel van deze methode is daarentegen dat deze kan worden uitgevoerd door een technicus op instapniveau die een veel kosteneffectiever tarief heeft dan live Imaging. Aangezien therapeutische verbindingen beschikbaar komen om de migratie te verbeteren, zoals in het geval van tumor infiltrerende cytotoxische immuuncellen, of om migratie te remmen, misschien in het geval van auto-immuunziekten waar Immunopathologie van belang is, kan deze methode worden gebruikt als een screening tool. In het algemeen is de methode effectief als de Chemokine van belang consequent chemokinetica genereert op een statistisch hoger niveau dan de media controle. In dergelijke gevallen kan de mate van remming/verbetering door een bepaalde verbinding ook worden bepaald.

Introduction

Deze oorspronkelijke transmigratie methode werd gepresenteerd door Stephen Boyden in 1962 in het tijdschrift van experimentele geneeskunde1. Veel van wat we weten over chemotaxis en chemokinetica zou niet mogelijk zijn zonder de ontwikkeling van de Boyden kamer. Voorafgaand aan de ontdekking van de eerste Chemokine in 1977, werden ex vivo-transmigratie systemen gebruikt om te leren over serum factoren die de cellulaire beweging in macrofagen konden arresteren terwijl de cellulaire beweeglijkheid in neutrofielen1,2werd vergroot. Een enorme rijkdom aan kennis is ontwikkeld met betrekking tot de immuuncelmigratie, en tot op heden, 47 chemokines zijn nu ontdekt met 19 overeenkomstige receptoren3,4. Bovendien, menigten van remmers/versterkers van deze Chemokine trajecten hebben ondergaan ontwikkeling voor therapeutische doeleinden5,6,7,8. Veel van deze verbindingen zijn getest in soortgelijke transmigratie kamers om te begrijpen van directe interacties tussen de verbindingen en immuuncellen responsiviteit op een bepaalde Chemokine9.

Transmigratie, of diapedesis, in ontstoken weefsel is een essentieel proces voor een gezonde ontstekingsreactie op heldere infectie10,11. Een Boyden kamer, transmigratiesysteem of trans Well-apparaat bestaan over het algemeen uit twee kamers, gescheiden door een poreus membraan van1,12. De onderste kamer bevat meestal media met de Chemokine van belang, terwijl leukocyten in de bovenste kamer worden geplaatst. De grootte van de porie in het membraan kan worden geselecteerd op basis van de grootte van de cel van belang. Voor dit project selecteerden we een 3 μm poreus membraan, omdat lymfoïde cellen 7-20 μm groot zijn, afhankelijk van het stadium van cellulaire ontwikkeling. Deze poriegrootte zorgt ervoor dat deze cellen niet passief door de poriën vallen, maar dat ze actief migreren naar aanleiding van de Chemokine gradiënt.

Het grote voordeel van dit protocol is de kosteneffectiviteit. In vivo is transmigratie moeilijk omdat het uitgebreide training vereist in dier hantering en chirurgie, en vaak gaat het om krachtige microscopie die niet altijd beschikbaar is voor een onderzoeker. Kostenefficiënte screening van verbindingen die bedoeld zijn om de transmigratie te verbeteren of te remmen, kan worden uitgevoerd voordat in vivo beeldvorming mogelijk is. Omdat het transmigratiesysteem strak wordt gecontroleerd, kunnen cellen aanvankelijk worden behandeld en vervolgens aan de trans well-apparatuur worden toegevoegd, of omgekeerd kan de Chemokine eerst met een Chemokine remmer worden behandeld, waarna cellen worden toegevoegd aan de trans well-apparatuur. Tot slot kunnen endotheelcellen en/of basaalmembraan proteïnen worden toegevoegd aan de onderzijde van de transwell insert 1-2 dagen voorafgaand aan het transmigratieexperiment om de betrokkenheid van deze barrière cellen in de chemokinetica te begrijpen. Nogmaals, deze manipulaties van het systeem bieden een krachtig middel om belangrijke informatie over de effectiviteit van een bepaalde compound te bepalen voor de ingewikkeldere in vivo studies.

Het gebruik van een systeem voor de transmigratie kamer is een effectieve manier om de lymfocyten mobiliteit te beoordelen onder verschillende in vivo en in vitro omstandigheden12,13,14. Hierin beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het beoordelen van de responsiviteit van ex vivo lymfocyten op chemokinen in een transmigratiekamer. In dit voorbeeld experiment werden CD4+ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) geïsoleerd van mannelijke en vrouwelijke, Balb/c-muizen na blootstelling aan OVA-allergenen. Er werd een hypothese gegenereerd dat CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 van met allergenen betwiste muizen efficiënter zou migreren naar CCL17 en CCL22 dan CCR4+ CD4+ T-helpercellen. CCL17 en CCL22 zijn chemokines die gewoonlijk worden geproduceerd door dendritische cellen en macrofagen van het m2 (allergische) fenotype, onder andere cellen, bij allergie15,16. CCL17 en CCL22 kunnen worden gezien als biomarkers van allergische ontsteking, omdat ze gemakkelijk in de longen worden gedetecteerd tijdens luchtweg exacerbaties16,17,18. Belangrijk is dat CCR4 expressie wordt verhoogd in vergelijking met onbehandelde controles, zoals blijkt uit bioinformatische gegevens die zijn gegenereerd uit ILC2 geïsoleerd van huisstofmijt behandelde dieren, en op dezelfde manier ILC2 van naïeve dieren behandeld ex vivo met IL-33 ( allergenen-bevorderend aangeboren cytokine) upregulates CCR419,20. Bovendien, volgens gegevens voor ILC2 in de database van het immunologische genoom project (www.immgen.org), CCR4 mRNA wordt sterk uitgedrukt in deze aangeboren immuuncellen. Tot op heden is er weinig bekend over de handel in ILC2 in weefsels, maar het is waarschijnlijk dat de ILC2 en CD4+ T-cellen soortgelijke chemokines en receptoren voor chemotaxis en chemokinetica gebruiken, omdat ze vergelijkbare transcriptiefactoren en receptoren uitdrukken. Zo vergeleken we CCL17 versus CCL22 responsiviteit, van ILC2 en CD4+ T-lymfocyten, van zowel mannelijke als vrouwelijke, met eicellen betwiste dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités van de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) en de Universiteit van Utah.

1. installatie en bereiding van reagentia

  1. Maak een complete RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media.
    1. Voeg 10 mL warmtegeïnactiveerd foetaal serum (FBS) toe aan 90 mL RPMI.
    2. Voeg 1 mL 100x Penicillaire-streptomycine-glutamine toe aan 100 mL 10% FBS RPMI.
  2. Bereid ILC2 Expansion media voor.
    1. Voeg IL-2 en IL-33 (20 ng/mL elke cytokine) toe aan 10 mL volledige RPMI.
    2. Als voorraad cytokinen 10 μg/mL zijn, Pipetteer 20 μL IL-2 en IL-33 in een buis van 15 mL die 10 mL volledige RPMI-media bevat.
  3. Bereid Long dissociatie medium.
    1. Voeg 50 mg type 1 Collagenase toe aan 250 mL niet-aangevuld RPMI.
    2. Voeg in stap 1.3.1 2,5 mL 100x penicillaire-streptomycine-glutamine toe aan de 250 mL media.
    3. Meng de media voorzichtig om ervoor te zorgen dat het type 1 Collagenase vóór gebruik volledig is opgelost.
  4. Serum vrije RPMI voorbereiden.
    1. Verdun 1 g gelyofiliseerd boviene serumalbumine (BSA) in 200 mL RPMI.
    2. Voeg 2 mL 100x penicillaire-streptomycine-glutamine toe.
    3. Meng de media voorzichtig om ervoor te zorgen dat de BSA volledig is opgelost in de media voor gebruik.
  5. Migratie medium voorbereiden met CCL17.
    1. Verkrijg 10 mL serum vrije RPMI en voeg CCL17 [50 ng/mL] toe.
      1. Als voorraad CCL17 10 μg/mL is, voeg dan 50 μL CCL17 kolf toe aan 10 mL serum vrije RPMI-media.
  6. Migratie medium voorbereiden met CCL22.
    1. Verkrijg 10 mL serum vrije RPMI en voeg CCL22 [50 ng/mL] toe.
    2. Als voorraad CCL22 10 μg/mL is, voeg dan 50 μL CCL22 kolf toe aan 10 mL serum vrije RPMI-media.
  7. Bereid CCR4 Antilichaamkleurings cocktail.
    1. Voeg gedurende 10 tests totaal 5 μL van elk van de volgende antilichamen toe aan een tube van 5 mL: anti-muis CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 en ICOS.
      Opmerking: Voorbeeld van het maken van een antilichaam cocktail voor 10 monsters: 0,5 μL van elk antilichaam x 10 monsters = 5 μL van elk van de in 1.7.1 vermelde antilichamen.
    2. Voeg gedurende 10 tests totaal 2,5 μL van de volgende antilichamen toe aan de cocktail van antilichamen uit stap 1.7.1: anti-muis CD3, CD11c en NK 1.1.
      Opmerking: Voorbeeld om de antilichaam cocktail voor 10 monsters te voltooien: 0,25 μL x 10 monsters = 2,5 μL van CD3, CD11c en NK 1.1 antilichamen.
    3. Bewaar de CCR4 Antilichaamkleurings cocktail bij 4 °C tot u klaar bent om de monsters toe te voegen. Gooi antilichaam cocktail na 1 week indien niet gebruikt.
  8. Bereid 1x stabiliserende Fixeermiddel.
    1. Voeg 10 mL gedeïoniseerd-gedestilleerd water toe aan 5 mL 3x stabiliserende fixatief concentraat

2. bereiding van voor de allergenen uitgedaagde BALB/c muizen

Opmerking: Mannelijke en vrouwelijke BALB/c muizen werden gekocht bij Charles River (UNMC) of Jackson Laboratories (Universiteit van Utah) op 6 tot 8 weken oud.

  1. Na acclimatie (1 week), sensibiliseren alle dieren aan eicellen.
    1. Combineer 100 μg/mL OVA geadsordeerd aan aluminiumhydroxide (20 mg/mL) in een 5 mL polystyreen buis.
    2. Meng de buis en trek onmiddellijk 500 μL van de OVA-Alum suspensie in een 1 mL, 28 G spuit (insulinespuit).
    3. Plaats een muis in een stolp met Isofluraan (1 – 2 ml onder een valse vloer, zodat het dier niet direct in Isofluraan staat). Laat de muis ongeveer 1 – 2 minuten onder anesthesie gaan, of totdat de ademhalingssnelheid daalt.
    4. Neem de muis snel op door de vacht op de rug en schouders en Injecteer 100 μL OVA-Alum intraperitoneaal per muis21,22.
    5. Plaats de muis terug in zijn kooi en kijk om te zorgen dat ze weer beweeglijkheid krijgen; Dit moet gebeuren binnen 2 – 5 min.
  2. Zeven dagen na sensibilisatie, alle dieren onderworpen aan intranasale (i.n.) 1,5% eicellen verdund in steriele zoutoplossing in een Vernevel kamer (Data Sciences International) gedurende 20 min.
    1. Verwijder muizen uit hun kooien en plaats ze in de dierlijke Vernevel kamer. Sluit de deksel van de kamer.
    2. Bevestig de vernevelaar aan de ingangs uitloop op de Vernevel kamer.
    3. Voeg 30 mL 1,5% OVA verdund in steriele zoutoplossing toe aan de vernevelaar op de vernevelaar.
    4. Schakel de vernevelaar in en laat de kamer 20 minuten met mist vullen.
    5. Schakel de vernevelaar uit en laat de nevel zich vestigen.
    6. Dieren terug te brengen naar hun kooien.
  3. Herhaal stap 2,2 voor een totaal van 5 keer, op 5 opeenvolgende dagen, om allergische ontsteking te induceren.

3. isolatie van CD4+ T-cellen uit milt en longen van met eicellen uitgedaagde muizen

  1. Alle met OVA behandelde mannelijke en vrouwelijke dieren op humane wijze euthanaseren door CO2 -asphyxiatie volgens goedgekeurde IACUC-protocollen, waarbij 2 tot 3 dieren per groep worden gebruikt, per experiment.
  2. Accijns longen en milt van dieren en plaats weefsels in afzonderlijke dissociatie buizen op basis van het weefseltype en het geslacht van het dier23.
  3. Dissociaat longweefsel in 500 μL Long dissociatie media (25 U/mL; Collagenase, type 1) in de geautomatiseerde weefsel dissociator met behulp van het Long-protocol.
    1. Herhaal 3,2 en 3,3 in totaal twee keer.
  4. Dissociaat milt weefsel in 500 μL van volledige rpmi-media met gebruikmaking van het ' milt '-protocol op de geautomatiseerde weefsel dissociator.
    Opmerking: De resterende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met behulp van steriele techniek.
  5. Spoel de dissociatie buisjes met Long-en milt homogenaten met 5 mL extra Long dissociatie media of volledige RPMI, respectievelijk.
  6. Filter cel suspensies door een 40 μm celzeef en verzamel in 50 mL conische buizen.
  7. Incubate Long homogeneert gedurende 15 – 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om het longweefsel verder te ontkoppelen.
  8. Voeg 5 mL complete RPMI toe aan de Long en de milt homogeneert en pellet de cellen aan de onderkant van de 50 mL buizen met behulp van centrifugeren; 378 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
  9. Combineer splenocyten en longcellen in één conische buis van 50 mL en bepaal het totale aantal celtellingen met behulp van de geautomatiseerde celteller.
  10. Pas mannelijke en vrouwelijke celsuspensies aan 1 x 108 cellen/ml in scheidings buffer en voeg toe aan een 5 ml polystyreen buis.
    Opmerking: Het verrijkings protocol kan worden aangepast tot 14 mL polystyreen buizen wanneer meer cellen worden verkregen uit de milt en de longen. Dit protocol is ontworpen voor weefsels van 2 – 3 muizen per groep; Daarom moet een tube van 5 mL volstaan.
  11. Gebruik ongeveer tweederde van de totale cellen voor ILC2 isolatie volgens het ILC2 verrijkings protocol.
    1. Voeg een antilichaam cocktail (50 μL/mL) toe aan de celsuspensie en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
    2. Vortex Rapid-bollen voor 30 sec. en voeg aan het monster toe met een snelheid van 75 μL/mL celsuspensie. Zachtjes mengen en inbroed gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Boven de buis tot 3 mL totaal volume met scheidings buffer en plaats in de 8-kamer Easy separatie magneet. Incuberen gedurende 3 min bij RT.
    4. Tip de magneet naar voren (weg van de bol-antilichaam-cel complexen aan de achterkant van de buis) en Pipetteer de celsuspensie in een schone tube van 5 mL.
    5. Voeg 1,5 mL complete RPMI toe aan de buisjes en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
    6. Giet de media uit de celpellet en rebreng de ILC2 op 1 x 107 cellen per ml.
    7. Plaats 100 uL mannelijk en vrouwelijk ILC2 per put in een U-Bottom, 96-well plate en voeg 100 μL ILC2 Expansion media toe aan elk goed.
    8. Incuberen de cellen voor 4 – 5 dagen om de ILC2 uit te vouwen.
    9. Verzamel de ILC2 in een tube van 5 mL en voeg tot 4,5 mL serum vrije RPMI toe. Centrifugeer de cellen op 378 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    10. Tel cellen met behulp van een hemacytometer en respenderen bij 1 x 107 ILC2 per ml in serum vrije rpmi.
  12. Gebruik de overgebleven cellen voor de CD4+ t cell isolation procedure, die wordt uitgevoerd volgens het CD4+ t cell isolation protocol met enkele modificaties.
    1. Voeg rat serum (50 μL/mL) toe aan de CD4 T Cell verrijkings suspensie.
    2. Voeg een isolatie cocktail (50 μL/mL) toe aan het monster en incuberen gedurende 10 minuten bij RT.
    3. Vortex snelle bollen voor 30 sec. en voeg toe aan het monster met een snelheid van 75 μL/mL.
    4. Meng de celsuspensie zachtjes en inincuberen voor 2,5 min en RT
    5. Boven de monsters tot 3 mL en plaats de 5 mL buisjes in de 8-kamer Easy separatie magneet en inincuberen gedurende 5 min bij RT.
    6. Tip de magneet naar voren en Pipetteer de celsuspensie in een schone tube van 5 mL.
    7. Voeg aan de buizen 1,5 mL serum vrije RPMI toe en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT bij 378 x g .
    8. Giet de media van de celpellet af en breng de CD4+ T-cellen met 1 x 107 cellen per ml in serum vrije rpmi uit.

4. Bepaal CCR4 expressie op CD4+ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) van OVA-betwiste dieren door Flowcytometrie

Opmerking: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op een open Bench top omdat ze niet-steriele technieken.

  1. Verkrijg ongeveer 1 – 2,5 x 105 ILC2 cellen uit stap 3.11.10 en 1 – 2,5 x 106 CD4+ T-cellen uit stap 3.12.8 in afzonderlijke buisjes van 5 ml.
    1. Houd een extra buis van ten minste 5,0 x 104 CD4 + T-cellen als een onbevlekte controle.
  2. Onderbreek de cellen in 100 – 200 μL van de FACS buffer en voeg 1 μL FC block toe aan elke buis, vervolgens inincuberen op ijs (of in een koelkast van 4 °C) gedurende 10 minuten.
  3. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
  4. Giet het supernatant af en breng de cellen in 100 – 200 μL FACS buffer uit.
  5. Voeg 37,5 μL CCR4-Antilichaamkleurencocktail toe aan de celsuspensie in elke buis, behalve de buis met de ' ongekleurde ' cellen.
  6. Inbroed de buisjes op ijs, of in een koelkast van 4 °C, gedurende 20 – 30 minuten.
  7. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
  8. Giet het supernatant af.
  9. Herhaal de stappen 4,7 en 4,8.
  10. Voeg 250 – 300 μL 1x stabiliserende fixeermiddelen (Zie tabel van de materialen) toe aan elke buis.
  11. Maak één kleurige kraal bediening voor elk antilichaam in de cocktail van het CCR4-antilichaam volgens het protocol dat is meegeleverd met de compensatie kralen.
    1. Vortex de compensatie kralen.
    2. Voeg één druppel kralen toe aan elke enkele gekleurde controle buis.
    3. Voeg 1 μL van elk antilichaam in de cocktail van het CCR4 antilichaam toe aan zijn eigen gelabelde buis.
    4. Meng en inbroed 10 min. in een koelkast van 4 °C of op ijs.
    5. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan alle buisjes en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
    6. Giet het supernatant af en breng de parels in 200 μL FACS buffer uit.
    7. Koel de enkelvoudig gekleurde bedieningselementen totdat alle monsters zijn gekleurd en klaar om te worden geanalyseerd op de flow-cytometer.
  12. Analyseer de Onbevlekte cellen, éénkleurige bedieningselementen en de experimentele samples op de flow-cytometer binnen 24 uur fixatie.

5. ex-vivo-transmigratie procedure

Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast, omdat ze een steriele techniek vereisen.

  1. Verkrijg de ILC2 uit stap 3.11.10 en CD4 T-cellen uit stap 3.12.8 en bepaal het aantal trans well-inserts dat nodig is voor het experiment.
    Opmerking: Voorbeeld: voor 1,2 mL verrijkte CD4 T-cellen uit stap 3.12.8 vermenigvuldigt u 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL; Verdeel vervolgens 1.200 uL met 100 μL = 12, het aantal wisselplaten dat nodig is voor CD4 T-transmigratie.
  2. Beweeg de 3 μm trans well inserts voorzichtig van de middelste rijen van een 24-Well plaat.
  3. Voeg 500 μL migratie media met CCL17 toe aan ongeveer een derde van de putjes.
  4. Voeg 500 μL migratie media met CCL22 toe aan een ander eenderde van de putjes.
  5. Voeg aan de laatste eenderde van de putjes 500 μL serum vrije RPMI met geen Chemokine toe.
  6. Label het deksel op de plaat duidelijk met de juiste transmigratie media geplaatst in de bodem putjes.
  7. Plaats de trans well inserts terug in de putten die de verschillende behandelingen bevatten.
  8. Voeg voorzichtig 100 μL CD4 T-cellen of ILC2 toe aan de bovenste put van elke wisselplaat. Meng of Pipetteer de celsuspensie niet op en neer in de trans putten, omdat dit de resultaten van het experiment kan verduren.
  9. Label de deksel van de plaat duidelijk met het celtype dat in elk goed is geplaatst en noteer de datum en tijd van de dag waarop de cellen zijn toegevoegd.
  10. Herhaal de stappen 5,2 tot 5,9 totdat alle cellen in trans well inserts met media zijn geplaatst.
  11. Plaats de plaat voorzichtig in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 48 h. Minimaliseer het contact met de plaat gedurende de incubatieperiode.

6. kwantificering van de ex vivo-transmigratie

  1. Verwijder voorzichtig de plaat uit de incubator en verwijder alle trans well inserts van de middelste rijen in de lege putten net boven of onder.
  2. Verzamel de cellen van de bodem en de bovenste putjes van de trans well-inserts in buizen met het label boven of onder, met CCL17, CCL22 of media, met het celtype en met het replicatienummer (ten minste 3 replicaties per experiment).
  3. Spoel de onderste putjes af met 500 μL 1x PBS en vang deze spoeling op in de bijbehorende buis.
  4. Spoel de bovenste putjes af met 250 μL 1x PBS en vang deze spoeling op in de bijbehorende buis.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 378 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Pipetteer voorzichtig alle supernatant van de celpellet.
  7. Respendeer T-cellen en ILC2 in 50 μL 1x PBS.
  8. Neem 10 μL celsuspensies en voeg toe aan 90 μL 0,4% trypeen blauw.
  9. Tel de cellen op de teller van de geautomatiseerde cel.
    1. % Levensvatbaarheid vastleggen.
    2. Noteer het aantal cellen per mL voor elk voorbeeld.
    3. Bepaal het totale aantal cellen per behandeling in de bovenste en onderste kamer; Noteer het aantal cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CCR4 expressie op CD4 + T-cellen en ILC2.

Voor het succes van het ex vivo transmigratie-experiment is het noodzakelijk om te bepalen of de lymfocyten reageren op CCL17 en CCL22 door middel van CCR4; Daarom bepaalden we CCR4 expressie op zowel CD4+ T-cellen als ILC2 door Flowcytometrie. Hoewel het bekend is dat OVA-specifieke CD4+ helper T cellen Express CCR4, minder is bekend van de uitdrukking van CCR4 op ILC2. Figuur 1 toont representatieve resultaten van CCR4 expressie, relatief, op CD4+ T-cellen (Figuur 1A, C) en ILC2 (Figuur 1B, D) van mannelijke en vrouwelijke, met OVA uitgedaagde Balb/C-muizen. Flow cytometrie werd gebruikt om CCR4 te detecteren met behulp van een monoklonaal antilichaam geconjugeerd met allophycocyanin (APC). Met behulp van eenrichtings analyse van variantie (ANOVA), bepaalden we dat er geen verschillen waren in CCR4 expressie tussen mannelijke en vrouwelijke hosts (Figuur 1A – D), maar de uitdrukking van CCR4 per celbasis (MFI) op ILC2 was hoger in vergelijking met CD4 + T-cellen (figuur 1c vergeleken met figuur 1d). Deze resultaten zijn belangrijk om te laten zien dat de ILC2 en CD4+ T-cellen moeten reageren op CCL17 en CCL22 in het volgende experiment.

Responsiviteit van CD4+ T-cellen tot CCR4 liganden in de bovenste en onderste kamers van een transmigratiesysteem.

CD4+ T-cellen van mannelijke, met OVA UITGEDAAGDE Balb/c-muizen werden geïsoleerd uit de longen en milt en in de bovenste kamer van een transmigratie-apparaat geplaatst, gescheiden door een poreus membraan van 3 ΜM (Figuur 2). Ter referentie wordt een samenvatting gegeven van de in vivo bereiding van met eicellen behandelde muizen (Figuur 2a) en de transmigratie procedure (Figuur 2b). Een combinatie van CCL17 (25 ng/mL) en CCL22 (25 ng/mL) werd in de bovenste kamer, de onderste kamer of de bovenste en onderste kamers geplaatst om te bevestigen (figuur 2c), (1) dat de CD4+ T-cellen van met eicellen betwiste dieren reageerden op CCR4 liganden, en (2) dat de Chemokine-geïnduceerde migratie een actief proces was waarbij T-cellen in reactie op de Chemokine gradiënt door de poriën beweerden en dat de lymfocyten niet door de poriën onafhankelijk van Chemokine beweerden. Een media (geen Chemokine) controle werd opgenomen om aan te tonen dat CD4+ T cellen niet kunnen migreren via de 3 μM poriën zonder stimulatie. In deze toestand bleef het hoogste percentage cellen in de bovenste kamer. Toen de chemokines tegelijkertijd in de bovenste en onderste kamer werden geplaatst, hebben we 52% van de totale T-cellen in de onderste kamer en 48% van de cellen in de bovenste kamer (bovenste/onderste behandeling) gedetecteerd. Zoals verwacht, de verdeling van cellen verplaatst in reactie op Chemokine geplaatst alleen in de top of alleen in de onderste kamer, als we het hoogste percentage van cellen in het compartiment waar Chemokine aanwezig was gedetecteerd.

Respons van CD4+ T-cellen en ILC2 tot CCL17 en CCL22 in een ex vivo-transmigratie-apparaat.

CD4 T-cellen en ILC2 van mannelijke en vrouwelijke muizen die zijn uitgedaagd, werden geïsoleerd uit de longen en milt vervolgens in de bovenste kamer van een trans-well-transmigratie-apparaat geplaatst (Figuur 3). De onderste kamer van het apparaat was gevuld met onbehandelde celkweek media, media die CCL17 bevatten, of media die CCL22 bevatten. Uit de representatieve resultaten blijkt dat minder dan 14% (13,37 + 6,5%) van de cellen die zijn gemigreerd in mediabeheer omstandigheden (Figuur 3A – D). In reactie op CCL22 reageerden beide celtypen, ongeacht of ze van mannelijke of vrouwelijke gastheren waren, op CCL22 (Figuur 3A-D), maar de resultaten voor CCL17 waren minder consistent. CCL17 veroorzaakte alleen significante migratie voor de vrouwelijke CD4 T-cellen en ILC2 in vergelijking met media alleen (Figuur 3C, D). CCL17 behandeling was niet anders dan media voor mannelijke CD4+ T-cellen of mannelijke ILC2 (Figuur 3A, B) en CCL22 veroorzaakte een grotere migratie dan CCL17 in mannelijke ILC2 (Figuur 2b).

Suboptimale transmigratie resultaten voor CD4+ T-cellen met een lage levensvatbaarheid.

Suboptimale resultaten werden gegenereerd om de onderzoeker een voorbeeld te geven van wat te verwachten wanneer het transmigratie-experiment niet goed werkt (Figuur 4). We geïsoleerde mannelijke CD4+ T cellen van dieren volgens dit protocol en plaatste ze in de top goed van transmigratiesysteem. Nadat de CD4+ T-cellen zijn toegevoegd, bleef de plaat echter bij kamertemperatuur voor de eerste 24 uur, waarna de plaat voor de resterende 24 uur van de incubatieperiode in de incubator werd geplaatst. Niet verrassend, we ontdekt geen migratie naar CCL17 en CCL22 (figuur 4a) en de levensvatbaarheid van de cellen was met name laag (< 15%) voor de cellen bovenaan (figuur 4b). Deze gebrekkige resultaten benadrukken het belang van het gebruik van de juiste temperaturen en voorwaarden die in dit protocol worden beschreven om optimale resultaten te behalen.

Figure 1
Figuur 1: CCR4 expressie op CD4+ T-cellen en ILC2. 7 tot 9 week oud, mannelijk en vrouwelijk, BALB/c muizen werden één keer geïnjecteerd met 100 ΜL OVA-geadsorreven aan aluminiumhydroxide (500 μg/ml; EICELLEN en 20 mg/mL aluminiumhydroxide) 7 dagen voorafgaand aan de eerste van 5, repetitieve, dagelijkse luchtweg uitdagingen met 1,5% eicellen in zoutoplossing. Allergenen-uitgedaagd dieren werden humaan geëerd, en Long-en milt weefsel werd verzameld voor ILC2 en CD4+ T cellen isolatie. Een klein aantal cellen werd vervolgens gekleurd en geanalyseerd door flow cytometrie om het niveau van CCR4 op elk celtype te bepalen. A) de frequentie van CD4+ T-cellen die CCR4+ zijn van OVA +-muizen, waarbij de foutbalken de standaardfout van het gemiddelde (+ SEM) vertegenwoordigen. (B) frequentie van ILC2 die CCR4+ (+ SEM) was. (C, D) Gemiddelde fluorescentie intensiteit (+ SEM) van CCR4 op (C) CD4 + T-cellen en (D) ILC2. Een totaal van 13 muizen werden gebruikt om deze gegevens te genereren, en de flow experiment werd herhaald twee keer, met 3 replicaties van elke behandeling per experiment. Significantie werd bepaald door een one-way ANOVA; n.d. geeft aan dat er geen verschillen zijn tussen groepen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: responsiviteit van CD4+ T-cellen naar CCR4 liganden in de bovenste en onderste kamers van een transmigratiesysteem. Mannelijke BALB/c muizen gesensibiliseerd en uitgedaagd met kip ei ovalbumine (OVA) en CD4 + T cellen werden geïsoleerd uit de milt en longen (A, B). Voor dit experiment met transmigratie werden CD4+ T-cellen in serum vrije media op 1 x 107 cellen/ml opgeschort. CCL17 en CCL22 werden toegevoegd aan serum vrije media met een concentratie van 50 ng/mL (25 ng/mL van elke Chemokine om in totaal 50 ng/mL te bereiken). Chemokine-bevattende media werden alleen aan de bovenste kamer toegevoegd, alleen aan de onderste kamer of aan de bovenste en onderste kamers. Een totaal volume van 500 μL transmigratie media werd toegevoegd aan de bodem putjes en 100 μL cellulaire suspensie (1 x 106 cellen/goed) werd toegevoegd aan de top goed. De transmigratie werd gemeten na 48 h in de cultuur (C). Deze gegevens werden gegenereerd uit een enkel experiment, 3 met OVA behandelde, mannelijke muizen werden gebruikt voor weefsel inzameling, en 3 replicaten werden gemaakt per behandeling. De statistische significantie werd bepaald door een one-way ANOVA; *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: reactievermogen van CD4 + T-cellen en ILC2 tot CCL17 en CCL22 in een ex vivo -transmigratie-apparaat. Muizen werden bereid zoals in Figuur 1 voor CD4+ T-cel en ILC2 isolatie van milt en longen. CD4+ T-cellen en ILC2 werden geschorst in serum vrije media bij 1 x 107 cellen/ml. CCL17 of CCL22 werden toegevoegd aan serum vrije media met een concentratie van 50 ng/mL. 500 μL transmigratie media werd toegevoegd aan de bodem putjes en 100 μL cellulaire suspensie (1 x 106 cellen/goed) werd toegevoegd aan de top goed. De transmigratie werd gemeten na 48 uur in de cultuur. A) CD4+ T-cellen en (B) ILC2 van mannelijke hosts werden behandeld met media als controle, CCL17 of CCL22. Evenzo werden (C) vrouwelijke CD4+ T-cellen en (D) vrouwelijke ILC2 behandeld met media, CCL17 of CCL22. In totaal werden er 14 muizen gebruikt om deze gegevens te genereren. Het transmigratieexperiment werd 4 keer herhaald, met 3 – 6 duplo's van elke behandeling per experiment. Significantie werd bepaald door een one-way ANOVA; *p < 0,05, * * *p < 0,001, * * * *p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: suboptimale transmigratie resultaten voor CD4 T-cellen met een lage levensvatbaarheid. Naïeve mannelijke BALB/c muizen werden verworven voor de longen en milt weefsel collectie en CD4+ T-cel isolatie zoals in Figuur 1, Figuur 2, en Figuur 3. CD4 T-cellen werden toegevoegd aan de bovenste kamer van de transmigratie-apparatuur en serum vrije media met CCL17, CCL22 of geen Chemokine (Media Control) werden toegevoegd aan de bodem goed. Voor de eerste 24 h van het experiment werd de plaat achtergelaten bij kamertemperatuur, daarna werd hij verplaatst naar een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor een extra 24 uur. (a) percentage cellen in de bovenste en onderste putjes na 24 uur.B) levensvatbaarheid van de C D4 + T-cellen in de bovenste en onderste kamer na slechte incubatie condities. Deze gegevens werden gegenereerd uit een enkel experiment, 3 naïeve mannelijke muizen werden gebruikt voor weefsel inzameling, en 3 replicaten werden gemaakt per behandeling. Statistische significantie werd niet bepaald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin presenteren we een vaste methode voor de beoordeling van Chemokine-geïnduceerde migratie van lymfocyten in een ex vivo-transmigratiesysteem. Er zijn verschillende kritische stappen in het Protocol, waarvan de eerste de uitdrukking van de juiste Chemokine receptor op de immuuncellen in het experiment verifieert. In onze handen kozen we CCR4 vanwege het lichaam van de literatuur die het belang van CCR4 op Th2 helper T cellen in allergische ontsteking benadrukt. Ovalbumine-geïnduceerde ontsteking werd eerder aangetoond door ten minste twee CCR4 antagonisten24,25te worden beperkt; Dit was echter voorafgaand aan de ontdekking van de groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2)26,27. We hebben nieuwe gegevens gegenereerd waaruit blijkt dat ILC2 cellen hogere CCR4 dan CD4+ T-cellen uitdrukken en toonden dat deze cellen consequent REAGEERDEN op CCL22.

Een tweede belangrijke stap in het protocol is ervoor te zorgen dat cellen vóór het begin van het transmigratiegedeelte van het protocol in een optimaal medium voor cultuur worden gehouden. In het geval van ILC2 moesten we deze cellen cultuur in ILC2 expansie media die zowel IL-2 als IL-33 bevat. Il-2 en Il-7 zijn beide gerapporteerd in de literatuur ter ondersteuning van ILC2 in cultuur voor maximaal 14 dagen28,29. Als levensvatbaarheid een probleem wordt voor CD4+ T-cellen en ILC2 in toekomstige experimenten, zou de toevoeging van Il-2 of Il-7 waarschijnlijk de overleving van de lymfocyten verbeteren tot het eindpunt van het experiment. Elk van de hierin gepresenteerde Media werd in de loop van verschillende experimenten gedefinieerd en werd geoptimaliseerd voor gebruik in dit protocol14,30,31. In Figuur 4presenteerden we foutieve resultaten om aan te tonen hoe belangrijk het is om een incubator te gebruiken met de juiste temperatuur en 5% Co2. Het is een belangrijke stap voor het welslagen van het protocol om de transmigratieplaten in de incubator te houden waar ze niet gestoord zullen worden.

Zoals eerder vermeld, zijn er voordelen voor het gebruik van de in vivo microscopie beschikbaar bij de meeste instellingen, maar in vivo beeldvorming kan tijdrovend en kostbaar zijn. Een alternatieve experimentele procedure die minder kostbaar is, maakt gebruik van microfluïdica in combinatie met Chemokine gradiënten om de extravasatie van leukocyten en weefsel migratie te begrijpen32,33,34. Deze systemen hebben een wetenschappelijke waarde omdat ze de complexiteit van de celkinetiek beoordelen, waarbij endotheelcellen betrokken zijn, die kunnen worden geteeld op de haarvaten van de microfluïdische systemen. Bovendien beoordelen deze microfluïdische systemen het belang van de aanhangers van eiwitten (bijv. E-cadherin) op de endotheelcellen en integrinen op de immuuncellen in het proces van celhechting onder bloedstroom. Niettemin vereisen deze systemen gespecialiseerde apparatuur en complexe computationele programmering en statistieken om het belang van elke behandelings situatie te bepalen. Hoewel de hier gepresenteerde beperking van de transmigratiemethode echter een kunstmatig karakter heeft, kan deze worden gebruikt als een belangrijk screeningsinstrument om het afval van onnodige reagentia te beperken in de daaropvolgende in vivo-methoden. De betekenis van de methode is dat als nieuwe cellen worden ontdekt, zoals het geval is voor ILC2, we deze cellen kunnen scherm voor hun reactievermogen op bekende chemokines. Dit is een van de toekomstige toepassingen met betrekking tot ILC2 en potentiële therapieën die hun migratie in de longen tijdens de exacerbatie van astma remmen kunnen. Dit Protocol van transmigratie zal worden gebruikt om verschillende remmers die kunnen worden gebruikt om CCR4 of andere Chemotactische bemiddel kers die betrokken zijn bij het rekruteren van ILC2 te schermen. In totaal zal dit ex vivo transmigratie protocol leiden tot het genereren van kritieke gegevens die kunnen worden geverifieerd met toekomstige in vivo experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen financiële openbaarmakingen of belangenconflicten om te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de American Lung Association (K.J.W.), het Memorial Eugene Kenney Fund toegekend aan T.A.W. en K.J.W., royale start-up ondersteuning van de Universiteit van Utah voor K.J.W., en een afdeling van Veterans Affairs Award to T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. is de ontvanger van een Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) van het departement Veterans Affairs. De auteurs willen de redactionele assistentie van mevrouw Lisa Chudomelka erkennen. De auteurs danken de unmc flow flowcytometrieonderzoeken core voor hun ondersteuning bij het verzamelen van de flow cytometrie-gegevens die voor dit manuscript zijn gegenereerd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

Immunologie en infectie uitgave 151 CCL17 (C-C motief Chemokine 17)/TARC (Thymus en activerings gerelateerde Chemokine) CCL22 (C-C motief Chemokine 22)/MDC (macrophage-afgeleide Chemokine) CCR4 (CC Chemokine receptor 4) CD4 T cel (CD4 + T helper cel)/Th2 cel ILC2: (groep 2 aangeboren lymfoïde cellen) eicellen (kippenei ovalbumine)
Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter