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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Abstract

Ici, nous présentons une méthode efficace qui peut être exécutée avec les qualifications et les matériaux de laboratoire de base pour évaluer le mouvement chimio-entique de lymphocyte dans un système de transmigration ex vivo. Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) et les cellules d'aide CD4t ont été isolées des rates et des poumons des souris BALB/c de BALB/c d'ovalbumine d'oeufde de poulet (OVA). Nous avons confirmé l'expression de CCR4 sur les deux cD4- lymphocytes T et ILC2, comparativement. LE CCL17 et le CCL22 sont les ligands connus pour le CCR4; par conséquent, en utilisant cette méthode de transmigration ex vivo, nous avons examiné le CCL17- et le mouvement induit par le CCL22 deslymphocytes CCR4. Pour établir des gradients de chimiokine, CCL17 et CCL22 ont été placés dans la chambre inférieure du système de transmigration. Des lymphocytes isolés ont alors été ajoutés aux chambres supérieures et sur une période de 48 h les lymphocytes ont activement migré par des pores de 3 m vers la chimiokine dans la chambre inférieure. Il s'agit d'un système efficace pour déterminer la chimioïque des lymphocytes, mais, naturellement, n'imite pas les complexités trouvées dans les microenvironnements in vivo d'organe. C'est une limitation de la méthode qui peut être surmontée par l'ajout de l'imagerie in situ de l'organe et des lymphocytes à l'étude. En revanche, l'avantage de cette méthode est que peut être effectuée par un technicien d'entrée de gamme à un taux beaucoup plus rentable que l'imagerie en direct. Comme les composés thérapeutiques deviennent disponibles pour améliorer la migration, comme dans le cas de la tumeur infiltrant les cellules immunitaires cytotoxiques, ou pour inhiber la migration, peut-être dans le cas des maladies auto-immunes où l'immunopathologie est préoccupante, cette méthode peut être utilisée comme un outil de dépistage. En général, la méthode est efficace si la chimiokine d'intérêt génère constamment des chimioïques à un niveau statistiquement plus élevé que le contrôle des médias. Dans de tels cas, le degré d'inhibition/amélioration par un composé donné peut également être déterminé.

Introduction

Cette méthode originale de transmigration a été présentée par Stephen Boyden en 1962 dans le Journal of Experimental Medicine1. Une grande partie de ce que nous savons sur la chimiotaxie et la chimiothérapeutique ne serait pas possible sans le développement de la chambre Boyden. Avant la découverte de la première chimiokine en 1977, les systèmes de transmigration ex vivo ont été utilisés pour en apprendre davantage sur les facteurs sériques qui pourraient arrêter le mouvement cellulaire dans les macrophages tout en amplifiant la motilité cellulaire chez les neutrophiles1,2. Une énorme richesse de connaissances a été développée en ce qui concerne la migration des cellules immunitaires, et à ce jour, 47 chemokines ont été découverts avec 19 récepteurs correspondants3,4. En outre, des multitudes d'inhibiteurs/améliorateurs de ces voies de chimiokine ont subi le développement à des fins thérapeutiques5,6,7,8. Beaucoup de ces composés ont été testés dans des chambres de transmigration similaires pour comprendre les interactions directes entre les composés et la réactivité des cellules immunitaires à une chimiokine donnée9.

La transmigration, ou diapède, dans les tissus enflammés est un processus essentiel à une réponse inflammatoire saine à l'infection claire10,11. Une chambre Boyden, un système de transmigration ou un appareil de transwell sont généralement composés de deux chambres séparées par une membrane poreuse1,12. La chambre inférieure tient le plus souvent des supports contenant la chimiokine d'intérêt, tandis que les leucocytes sont placés dans la chambre supérieure. La taille des pores de la membrane peut être sélectionnée en fonction de la taille de la cellule d'intérêt. Pour ce projet, nous avons sélectionné une membrane poreuse de 3 m, car les cellules lymphoïdes ont une taille de 7 à 20 m, selon le stade du développement cellulaire. Cette taille de pores assure que ces cellules ne tombent pas passivement à travers les pores, mais qu'elles migrent activement en réponse au gradient de chimiokine.

Le principal avantage de ce protocole est sa rentabilité. La transmigration in vivo est difficile parce qu'elle nécessite une formation approfondie sur la manipulation et la chirurgie des animaux, et implique souvent une microscopie de haute puissance qui n'est pas toujours disponible pour un chercheur. Le criblage rentable des composés censés améliorer ou inhiber la transmigration peut être accompli avant l'imagerie in vivo. Puisque le système de transmigration est étroitement commandé, les cellules peuvent être traitées d'abord puis ajoutées à l'appareil de transwell, ou, vice versa, la chimiokine peut être traitée d'abord avec un inhibiteur de chimiokine puis des cellules ajoutées à l'appareil de transwell. Enfin, les cellules endothéliales et/ou les protéines membranaires du sous-sol peuvent être ajoutées au fond de l'insertion de transwell 1-2 jours avant l'expérience de transmigration pour comprendre l'implication de ces cellules de barrière dans la chimioïétique. Encore une fois, ces manipulations du système fournissent un moyen puissant de déterminer des informations importantes sur l'efficacité d'un composé donné avant des études in vivo plus compliquées.

L'utilisation d'un système de chambre de transmigration est un moyen efficace d'évaluer la mobilité des lymphocytes dans diverses conditions in vivo et in vitro12,13,14. Ici, nous décrivons une méthode optimisée pour évaluer la réactivité ex vivo de lymphocyte aux chemokines dans une chambre de transmigration. Dans cet exemple d'expérience, les lymphocytesT CD4 et le groupe 2 lymphoïdes innés (ILC2) ont été isolés chez des souris mâles et femelles, BALB/c après exposition ova-allergène. Une hypothèse a été générée que CCR4- CD45- Lineage- (LIN-) ILC2 à partir de souris à défi allergène migrerait plus efficacement vers CCL17 et CCL22 que CCR4- CD4- T cellules d'aide. CCL17 et CCL22 sont des chemokines couramment produites par les cellules dendritiques et les macrophages du phénotype M2 (allergique), entre autres cellules, dans l'allergie15,16. CCL17 et CCL22 peuvent être considérés comme des biomarqueurs de l'inflammation allergique car ils sont facilement détectés dans les poumons lors d'exacerbations des voies respiratoires16,17,18. Fait important, l'expression CCR4 est élevée par rapport aux témoins non traités, comme le révèlent les données bioinformatiques générées par ilC2 isolés à partir d'animaux traités par les acariens de la poussière domestique, et de même ILC2 d'animaux naïfs traités ex vivo avec IL-33 ( cytokine innée favorisant l'allergène) upregulates CCR419,20. En outre, selon les données pour ILC2 dans la base de données immunologique de projet de génome (www.immgen.org), l'ARNm cCR4 est fortement exprimé dans ces cellules immunitaires innées. À ce jour, on sait peu de choses concernant le trafic d'ILC2 dans les tissus, mais il est probable que les cellules ILC2 etCD4-T utilisent des chimiocines et des récepteurs similaires pour la chimiotaxie et la chimiogénie car elles expriment des facteurs de transcription et des récepteurs similaires. Ainsi, nous avons comparé la réactivité du CCL17 à la réactivité du CCL22, des lymphocytes ILC2 et CD4T, provenant à la fois d'animaux mâles et femelles, d'animaux à défi OVA.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux du Centre médical de l'Université du Nebraska (UNMC) et de l'Université de l'Utah.

1. Configuration et préparation des réactifs

  1. Préparer les médias complets du RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
    1. Ajouter 10 ml de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) à 90 ml de RPMI.
    2. Ajouter 1 mL de 100x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine à 100 ml de 10% FBS RPMI.
  2. Préparer ILC2 Expansion Media.
    1. Ajouter l'IL-2 et l'IL-33 (20 ng/mL chaque cytokine) à 10 ml de RPMI complet.
    2. Si les cytokines de stock sont de 10 g/mL, la pipette 20 'L d'IL-2 et d'IL-33 dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de support COMPLET de RPMI.
  3. Préparer la dissociation pulmonaire moyenne.
    1. Ajouter 50 mg de collagène de type 1 à 250 ml de RPMI non complété.
    2. Ajouter 2,5 ml de pénicilline-streptomycine-glutamine 100x à 250 ml de support dans l'étape 1.3.1.
    3. Mélanger délicatement les supports pour s'assurer que le type 1 De collagène est complètement dissous avant utilisation.
  4. Préparer le RPMI sans sérum.
    1. Diluer 1 g d'albumine de sérum bovin lyophilisé (BSA) dans 200 ml de RPMI.
    2. Ajouter 2 ml de pénicilline-streptomycine-glutamine 100x.
    3. Mélanger délicatement les médias pour vous assurer que le BSA est complètement dissous dans les médias avant utilisation.
  5. Préparer Migration Medium avec CCL17.
    1. Acquérir 10 ml de RPMI sans sérum et ajouter CCL17 [50 ng/mL].
      1. Si le stock CCL17 est de 10 g/mL, ajouter 50 oL de bouillon de CCL17 à 10 ml de milieux RPMI sans sérum.
  6. Préparer Migration Medium avec CCL22.
    1. Acquérir 10 ml de RPMI sans sérum et ajouter CCL22 [50 ng/mL].
    2. Si le stock CCL22 est de 10 g/mL, ajouter 50 oL de bouillon de CCL22 à 10 ml de milieu xérique RPMI.
  7. Préparer le cocktail de teinture d'anticorps CCR4.
    1. Pour un total de 10 tests, ajoutez 5 ll de chacun des anticorps suivants à un tube de 5 mL : anti-souris CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 et ICOS.
      REMARQUE: Exemple de la façon de faire un cocktail d'anticorps pour 10 échantillons : 0,5 L de chaque anticorps x 10 échantillons, soit 5 l de chacun des anticorps énumérés dans 1,7,1.
    2. Pour un total de 10 tests, ajoutez 2,5 l des anticorps suivants au cocktail d'anticorps à partir de l'étape 1.7.1 : cD3 anti-souris, CD11c et NK1.1.
      REMARQUE: Exemple pour compléter le cocktail d'anticorps pour 10 échantillons : 0,25 ML x 10 échantillons et 2,5 l d'anticorps CD3, CD11c et NK1.1.
    3. Conserver le cocktail de teinture d'anticorps CCR4 à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'ajouter aux échantillons. Jeter le cocktail d'anticorps après 1 semaine s'il n'est pas utilisé.
  8. Préparer 1x Stabilisateur stabilisateur stabilisateur.
    1. Ajouter 10 ml d'eau distillée déionisée à 5 ml de concentré fixatif stabilisateur stabilisateur 3x

2. Préparation de souris BALB/c contestées par les allergènes

REMARQUE: Des souris MÂLEs et femelles de BALB/c ont été achetées de Charles River (UNMC) ou de Jackson Laboratories (Université de l'Utah) à l'âge de 6 à 8 semaines.

  1. Après l'acclimatation (1 semaine), sensibiliser tous les animaux à l'OVA.
    1. Dans un tube en polystyrène de 5 ml, verser 100 g/mL d'hydroxyde d'aluminium (20 mg/ml) dans un tube en polystyrène de 5 ml.
    2. Mélanger le tube et immédiatement tirer 500 'L de la suspension ova-alum dans une seringue de 1 ml, 28 G (seringue d'insuline).
    3. Placer une souris dans un bocal à clochecontenant de l'isoflurane (1 x 2 ml sous un faux plancher, de sorte que l'animal ne se trouve pas directement dans l'isoflurane). Laisser la souris passer sous anesthésie pendant environ 1 h à 2 min, ou jusqu'à ce que le taux de respiration diminue.
    4. Ramassez rapidement la souris par la fourrure sur le dos et les épaules et injectez 100 L d'alum OVA intrapéritonel par souris21,22.
    5. Placez la souris dans sa cage et regardez pour s'assurer qu'ils retrouvent la mobilité; cela devrait se produire dans les 2 à 5 minutes.
  2. Sept jours après la sensibilisation, soumettre tous les animaux à intranasal (i.n.) 1,5% OVA dilué dans saline stérile dans une chambre de nébulisation (Data Sciences International) pendant 20 min.
    1. Retirez les souris de leurs cages et placez-les dans la chambre de nébulisation animale. Fermez le couvercle de la chambre.
    2. Fixez le tuyau de nébulisation au bécout d'entrée sur la chambre de nébulisation.
    3. Ajouter 30 ml de 1,5 % d'OVA dilué dans la saline stérile à la tasse de nébulisation sur le nébuliseur.
    4. Allumez le nébuliseur et laissez la chambre se remplir de brume pendant 20 min.
    5. Éteignez le nébuliseur et laissez la brume s'installer.
    6. Renvoyez les animaux dans leurs cages.
  3. Répétez l'étape 2.2 pour un total de 5 fois, sur 5 jours consécutifs, pour induire une inflammation allergique.

3. Isolement des CD4et des lymphocytes T de la rate et des poumons de souris ova-contestées

  1. Euthanasier humainement tous les animaux mâles et femelles traités par OVA par asphyxie co2 selon les protocoles approuvés de l'IACUC, en utilisant 2 à 3 animaux par groupe, par expérience.
  2. Exciser les poumons et les rates des animaux et placer les tissus dans des tubes de dissociation séparés en fonction du type de tissu et le sexe de l'animal23.
  3. Dissocier le tissu pulmonaire dans 500 l de médias de dissociation pulmonaire (25 U/mL; collagène, type 1) dans le dissociateur automatisé de tissu utilisant le protocole de ' poumon'.
    1. Répétez 3,2 et 3,3 au total deux fois.
  4. Dissociez le tissu de rate dans 500 l de médias complets de RPMI utilisant le protocole de ' rate' sur le dissociateur automatisé de tissu.
    REMARQUE: Les étapes restantes doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique à l'aide d'une technique stérile.
  5. Rincer les tubes de dissociation contenant des homogénéices pulmonaires et de rate avec 5 ml de milieu supplémentaire de dissociation pulmonaire ou RPMI complet, respectivement.
  6. Filtrer les suspensions cellulaires à travers une passoire cellulaire de 40 m et les recueillir dans des tubes coniques de 50 ml.
  7. Incuber les homogénéités pulmonaires pendant 15 à 30 min dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pour dissocier davantage les tissus pulmonaires.
  8. Ajouter 5 ml de RPMI complet au poumon et à la rate homogénéise et granuler les cellules au fond des tubes de 50 ml à l'aide de centrifugation; 378 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min.
  9. Combinez les splenocytes et les cellules pulmonaires dans un seul tube conique de 50 ml et déterminez le nombre total de cellules à l'aide du compteur cellulaire automatisé.
  10. Ajuster les suspensions cellulaires mâles et femelles à 1 x 108 cellules/mL dans un tampon de séparation et ajouter à un tube de polystyrène de 5 ml.
    REMARQUE: Le protocole d'enrichissement peut être ajusté jusqu'à 14 ml de tubes de polystyrène lorsque plus de cellules sont acquises à partir de la rate et des poumons. Ce protocole a été conçu pour les tissus de 2 à 3 souris par groupe; par conséquent, un tube de 5 ml devrait suffire.
  11. Utilisez environ les deux tiers des cellules totales pour l'isolement ILC2 selon le protocole d'enrichissement ILC2.
    1. Ajouter le cocktail d'anticorps (50 l/mL) à la suspension cellulaire et couver pendant 5 min à RT.
    2. Vortex sphères rapides pour 30 s et ajouter à l'échantillon à un taux de 75 L/mL de suspension cellulaire. Mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à RT.
    3. Garnir le tube jusqu'à 3 ml de volume total avec un tampon de séparation et placer dans l'aimant de séparation facile de 8 chambres. Incuber pendant 3 min à RT.
    4. Inclinez l'aimant vers l'avant (loin des complexes de cellule-anticorps de sphère adhérés à l'arrière du tube) et pipette outre de la suspension de cellules dans un tube propre de 5 ml.
    5. Ajouter 1,5 ml de RPMI complet aux tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.
    6. Verser le support de la pastille cellulaire et resuspendre l'ILC2 à 1 x 107 cellules par mL.
    7. Placez 100 uL d'ILC2 mâle et femelle par puits dans une plaque de 96 puits en U et ajoutez 100 ll de media d'expansion ILC2 à chaque puits.
    8. Incuber les cellules pendant 4 à 5 jours pour étendre l'ILC2.
    9. Recueillir l'ILC2 dans un tube de 5 ml et ajouter jusqu'à 4,5 ml de RPMI sans sérum. Centrifugeles les cellules à 378 x g pendant 5 min à RT.
    10. Compter les cellules à l'aide d'un hémacytomètre et resuspendre à 1 x 107 ILC2 par mL dans le RPMI sans sérum.
  12. Utilisez les cellules restantes pour la procédure d'isolement des cellulesT CD4, qui est menée selon le protocole d'isolement des cellules T cD4de la souris avec peu de modifications.
    1. Ajouter le sérum de rat (50 l/mL) à la suspension d'enrichissement des cellules T CD4.
    2. Ajouter le cocktail d'isolement (50 l/mL) à l'échantillon et couver pendant 10 min à RT.
    3. Vortex sphères rapides pour 30 s et ajouter à l'échantillon à un taux de 75 L/mL.
    4. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et couver pendant 2,5 min et RT
    5. Garnir les échantillons jusqu'à 3 ml et placer les tubes de 5 ml dans l'aimant de séparation facile de 8 chambres et couver pendant 5 min à RT.
    6. Verslez l'aimant vers l'avant et pipette la suspension de la cellule dans un tube propre de 5 ml.
    7. Ajouter 1,5 ml de RPMI sans sérum aux tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.
    8. Versez le support de la pastille cellulaire et suspendez les lymphocytes CD4et T à 1 x 107 cellules par mL dans le RPMI sans sérum.

4. Déterminer l'expression cCR4 sur cD4- cellules T et groupe 2 cellules lymphoïdes innées (ILC2) des animaux OVA contestés par cytométrie de flux

REMARQUE: Les étapes suivantes peuvent être effectuées sur un dessus de banc ouvert car elles sont des techniques non stériles.

  1. Acquérir environ 1 à 2,5 x 105 cellules ILC2 à partir de l'étape 3.11.10 et de 1 à 2,5 x 106 cD4et t de l'étape 3.12.8 dans des tubes séparés de 5 ml.
    1. Gardez un tube supplémentaire d'au moins 5,0 x 104 lymphocytes T CD4 MD comme un contrôle non taché.
  2. Suspendre les cellules dans 100 à 200 oL de tampon FACS et ajouter 1 l de fc Block à chaque tube, puis incuber sur la glace (ou dans un réfrigérateur de 4 oC) pendant 10 min.
  3. Ajouter 1/2 mL de tampon FACS à chaque tube et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.
  4. Verser le supernatant et resuspendre les cellules dans 100 à 200 l de FACS Buffer.
  5. Ajoutez 37,5 L du cocktail de coloration des anticorps CCR4 à la suspension cellulaire dans chaque tube, à l'exception du tube contenant les cellules « non tachées ».
  6. Incuber les tubes sur la glace, ou dans un réfrigérateur de 4 oC, pendant 20 à 30 min.
  7. Ajouter 1/2 mL de tampon FACS à chaque tube et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.
  8. Verser le supernatant.
  9. Répétez les étapes 4.7 et 4.8.
  10. Ajouter 250 à 300 l de fixatif stabilisateur stabilisateur 1x (voir Tableau des matériaux)à chaque tube.
  11. Préparer des contrôles de perles de couleur unique pour chaque anticorps dans le cocktail d'anticorps CCR4 selon le protocole fourni avec les perles de compensation.
    1. Vortex les perles de compensation.
    2. Ajouter une goutte de perles à chaque tube de commande unicolore.
    3. Ajouter 1 oL de chaque anticorps dans le cocktail CCR4 Antibody à son propre tube étiqueté.
    4. Mélanger délicatement et incuber 10 min dans un réfrigérateur à 4 oC ou sur de la glace.
    5. Ajouter 1/2 ml de tampon FACS à tous les tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.
    6. Verser le supernatant et resuspendre les perles dans 200 ll de tampon FACS.
    7. Réfrigérer les commandes unicolores jusqu'à ce que tous les échantillons soient tachés et prêts à être analysés sur le cytomètre d'écoulement.
  12. Analyser les cellules non tachées, les commandes unicolores et les échantillons expérimentaux sur le cytomètre d'écoulement dans les 24 h suivant la fixation.

5. Procédure de transmigration ex Vivo

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un cabinet de sécurité biologique, car elles nécessitent une technique stérile.

  1. Acquérir les cellules ILC2 de l'étape 3.11.10 et cD4 des lymphocytes T de l'étape 3.12.8 et déterminer le nombre d'inserts de transwell nécessaires pour l'expérience.
    REMARQUE: Exemple : Pour 1,2 ml de lymphocytes T CD4 enrichis à partir de l'étape 3.12.8, multipliez 1,2 x 1 000 l et 1 200 l; puis diviser 1 200 uL par 100 L et 12, le nombre d'inserts nécessaires pour la transmigration CD4 T.
  2. Déplacez doucement les inserts transwell de 3 m à partir des rangées du milieu d'une plaque de 24 puits.
  3. Ajouter 500 l de supports de migration avec CCL17 à environ un tiers des puits.
  4. Ajoutez 500 l de supports de migration avec CCL22 à un autre tiers des puits.
  5. Ajouter 500 L de RPMI sans sérum sans contenant de chimiokine au dernier tiers des puits.
  6. Étiquetez clairement le couvercle sur la plaque avec le support de transmigration approprié placé dans les puits inférieurs.
  7. Placer les inserts de transwell dans les puits contenant les différents traitements.
  8. Ajouter délicatement 100 L de lymphocytes T CD4 ou ILC2 au puits supérieur de chaque insert. Ne pas mélanger ou pipette la suspension cellulaire de haut en bas dans les transwells, car cela peut confondre les résultats de l'expérience.
  9. Étiquetez clairement le couvercle de la plaque avec le type de cellule placé dans chaque puits et écrivez la date et l'heure de la journée que les cellules ont été ajoutées.
  10. Répétez les étapes 5.2 à 5.9 jusqu'à ce que toutes les cellules aient été placées dans des inserts transwell avec des supports.
  11. Placer délicatement la plaque dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 48 h. Minimiser le contact avec la plaque pendant la période d'incubation.

6. Quantification de la transmigration ex vivo

  1. Retirez délicatement la plaque de l'incubateur et retirez tous les inserts transwell des rangées du milieu dans les puits vides juste au-dessus ou en dessous.
  2. Recueillir les cellules du bas et du haut des puits de transwell dans des tubes étiquetés avec TOP ou BOTTOM, avec CCL17, CCL22, ou des médias, avec le type de cellule, et avec le numéro de réplique (au moins 3 répliques par expérience).
  3. Rincer les puits inférieurs avec 500 L de 1x PBS et recueillir ce rinçant dans le tube correspondant.
  4. Rincer les puits supérieurs avec 250 L de 1x PBS et recueillir ce rinçant dans le tube correspondant.
  5. Pelleter les cellules par centrifugation à 378 x g pendant 5 min à RT.
  6. Pipette doucement hors tout supernatant de la pastille cellulaire.
  7. Resuspendre les lymphocytes T et ilC2 en 50 OL de 1x PBS.
  8. Prenez 10 l des suspensions cellulaires et ajoutez à 90 l de 0,4 % de bleu trypan.
  9. Comptez les cellules sur le compteur cellulaire automatisé.
    1. Record %de viabilité.
    2. Enregistrez le nombre de cellules par mL pour chaque échantillon.
    3. Déterminer le nombre total de cellules par traitement dans la chambre supérieure et inférieure; enregistrer le nombre de cellules.

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Representative Results

Expression CCR4 sur les lymphocytes T CD4 et ILC2.

Pour le succès de l'expérience de transmigration ex vivo, il est impératif de déterminer si les lymphocytes sont sensibles au CCL17 et au CCL22 par cCR4; par conséquent, nous avons déterminé l'expression de CCR4 sur les deux cellules CD4et T et ILC2 par cytométrie de flux. Bien qu'il soit bien connu que les lymphocytes T CD4et aidespécifiques ovabiques expriment cCR4, on en sait moins sur l'expression du CCR4 sur ILC2. La figure 1 montre les résultats représentatifs de l'expression cCR4, comparativement, sur les cellules CD4et T(figure 1A,C) et ILC2 (figure 1B,D) de souris MÂLEs et femelles, DÉFIaient L'OVA BALB/c. La cytométrie de flux a été employée pour détecter CCR4 utilisant un anticorps monoclonal conjugué à l'allophycocyanin (APC). En utilisant one-Way Analysis of Variance (ANOVA), nous avons déterminé qu'il n'y avait aucune différence dans l'expression du CCR4 entre les hôtes masculins et féminins (Figure 1A-D), cependant, l'expression de CCR4 sur une base par cellule (MFI) sur ILC2 était plus élevée par rapport au CD4 + Cellules T(figure 1C par rapport à la figure 1D). Ces résultats sont importants pour montrer que les lymphocytes ILC2 et CD4et T devraient répondre au CCL17 et au CCL22 dans l'expérience suivante.

Réactivité des cellules CD4et T aux ligands CCR4 dans les chambres supérieures et inférieures d'un système de transmigration.

CD4- Les lymphocytes T des souris MÂLEs, OVA-contestées BALB/c ont été isolés des poumons et des rates et placés dans la chambre supérieure d'un appareil de transmigration séparé par une membrane poreuse de 3 M (figure 2). Un résumé de la préparation in vivo des souris traitées à l'OVA (figure 2A) et de la procédure de transmigration (figure 2B) sont présentés pour référence. Une combinaison de CCL17 (25 ng/mL) et de CCL22 (25 ng/mL) a été placée dans la chambre supérieure, la chambre inférieure ou les deux chambres supérieures et inférieures pour confirmer (figure 2C), (1) que les cellules CD4et T des animaux OVA-contestés étaient sensibles au CCR4 les ligands, et (2) que la migration chimiokine-induite était un processus actif par lequel les cellules de T se déplaçaient par les pores en réponse au gradient de chimiokine, et que les lymphocytes ne se déplaçaient pas par les pores indépendamment de la chimiokine. Un contrôle des médias (No Chemokine) a été inclus pour montrer que les cellules CD4et T ne pouvaient pas migrer à travers les pores de 3 M sans stimulation. Dans cet état, le pourcentage le plus élevé de cellules est resté dans la chambre supérieure. Lorsque les chimionines ont été placées simultanément dans la chambre supérieure et inférieure, nous avons détecté 52 % des lymphocytes T totaux dans la chambre inférieure et 48 % des cellules de la chambre supérieure (traitement TOP/BOTTOM). Comme prévu, la distribution des cellules se déplaçait en réponse à la chimiokine placée seulement dans le haut ou seulement dans la chambre inférieure, car nous avons détecté le pourcentage le plus élevé de cellules dans le compartiment où la chimiokine était présente.

Réactivité des cellules CD4et T et ILC2 au CCL17 et au CCL22 dans un appareil de transmigration ex vivo.

Les lymphocytes T CD4 et ilC2 des souris mâles et femelles, les souris OVA-contestées ont été isolées des poumons et des rates puis placées dans la chambre supérieure d'un appareil de transmigration de transwell (figure 3). La chambre inférieure de l'appareil était remplie de supports de culture cellulaire non traités, de supports contenant ccL17 ou de supports contenant ccL22. Les résultats représentatifs montrent que moins de 14 % (13,37 des cellules migrées dans des conditions de contrôle des médias (Figure 3A-D). En réponse au CCL22, les deux types de cellules, qu'ils proviennent ou non d'hôtes masculins ou féminins, ont répondu au CCL22(figure 3A-D),mais les résultats du CCL17 étaient moins cohérents. Le CCL17 n'a induit qu'une migration importante des lymphocytes T CD4 femelles et de l'ILC2 par rapport aux seuls médias(figure 3C,D). Le traitement CCL17 n'était pas différent des médias pour les cellules CD4mâles ou ill2 mâles(figure 3A,B),et le CCL22 a induit une plus grande migration que le CCL17 chez les hommes ILC2 (figure 2B).

Résultats de transmigration sous-optimales pour les cellules CD4et T à faible viabilité.

Des résultats sous-optimaux ont été générés pour fournir au chercheur un exemple de ce à quoi s'attendre lorsque l'expérience de transmigration ne fonctionne pas correctement (figure 4). Nous avons isolé les cellules CD4et T mâles des animaux selon ce protocole et les avons placées dans le puits supérieur du système de transmigration. Après l'ajout des cellules CD4et T, la plaque est restée à température ambiante pendant les 24 premières heures, puis la plaque a été déplacée dans l'incubateur pendant les 24 heures restantes de la période d'incubation. Comme on pouvait s'y attendre, nous n'avons détecté aucune migration vers CCL17 et CCL22 (figure 4A) et la viabilité des cellules était particulièrement faible (lt;15%) pour les cellules dans le haut (Figure 4B). Ces résultats imparfaits soulignent l'importance d'utiliser les températures et les conditions correctes détaillées dans ce protocole pour obtenir des résultats optimaux.

Figure 1
Figure 1 : Expression CCR4 sur les lymphocytes CD4et IlC2. De 7 à 9 semaines, mâles et femelles, des souris BALB/c ont été injectées une fois avec 100 l d'hydroxyde d'aluminium (500 g/mL; OVA et 20 mg/mL d'hydroxyde d'aluminium) 7 jours avant le premier des 5 défis quotidiens répétitifs des voies respiratoires avec 1,5 % d'OVA en salin. Les animaux à défi pour les allergènes ont été euthanasiés sans humains, et des tissus pulmonaires et de la rate ont été prélevés pour l'isolement des cellules ILC2 et CD4. Un petit aliquot de cellules a alors été souillé et analysé par cytométrie de flux pour déterminer le niveau de CCR4 sur chaque type de cellule. (A) Fréquence des cellules CD4et T qui sont CCR4- à partir de souris OVA, où les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM). (B) Fréquence de l'ILC2 qui étaient CCR4(SEM). (C, D) Intensité moyenne de fluorescence (SEM) de CCR4 sur (C) CD4 MD T et (D) ILC2. Un total de 13 souris ont été utilisées pour générer ces données, et l'expérience de flux a été répétée deux fois, avec 3 répliques de chaque traitement par expérience. L'importance a été déterminée par One-Way ANOVA; n.d. indique qu'il n'y avait aucune différence entre les groupes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Réactivité des cellules CD4et T aux ligands CCR4 dans les chambres supérieures et inférieures d'un système de transmigration. Les souris mâles BALB/c sensibilisées et défiées par l'ovalbumine d'ovules de poulet (OVA) et les lymphocytes T CD4MD ont été isolées des rates et des poumons (A, B). Pour cette expérience de transmigration, les cellules CD4et T ont été suspendues dans des médias sans sérum à 1 x 107 cellules/mL. LE CCL17 et le CCL22 ont été ajoutés aux médias sans sérum à une concentration de 50 ng/mL (25 ng/mL de chaque chimiokine pour atteindre un total de 50 ng/mL). Les supports contenant de la chimiokine ont été ajoutés à la chambre supérieure seulement, à la chambre inférieure seulement, ou aux chambres supérieures et inférieures. Un volume total de 500 ll de supports de transmigration a été ajouté aux puits inférieurs et 100 l de suspension cellulaire (1 x 106 cellules/puits) a été ajouté au puits supérieur. La transmigration a été mesurée après 48 h en culture (C). Ces données ont été générées à partir d'une seule expérience, 3 OVA-traités, souris mâles ont été utilisés pour la collecte de tissus, et 3 répliques ont été faites par traitement. L'importance statistique a été déterminée par One-Way ANOVA; p lt; 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Réactivité des lymphocytes T CD4MD et de l'ILC2 au CCL17 et au CCL22 dans un appareil de transmigration ex vivo. Les souris ont été préparées comme dans la figure 1 pour l'isolement des cellules T et des lymphocytes T CD2 de la rate et des poumons. Les lymphocytes CD4et T et ILC2 ont été suspendus dans des médias sans sérum à 1 x 107 cellules/mL. LE CCL17 ou le CCL22 ont été ajoutés aux médias sans sérum à une concentration de 50 ng/mL. 500 l de supports de transmigration ont été ajoutés aux puits inférieurs et 100 l de suspension cellulaire (1 x 106 cellules/puits) ont été ajoutés au puits supérieur. La transmigration a été mesurée après 48 h en culture. (A) CD4- lymphocytes T et (B) ILC2 des hôtes masculins ont été traités avec des médias comme contrôle, CCL17, ou CCL22. De même, (C) les cellules CD4femelles et Les lymphocytes T et(D)femelles ILC2 ont été traitées avec des médias, CCL17, ou CCL22. Un total de 14 souris ont été utilisées pour générer ces données. L'expérience de transmigration a été répétée 4 fois, avec 3 à 6 répliques de chaque traitement par expérience. L'importance a été déterminée par One-Way ANOVA; p'lt; 0.05,'p 'lt; 0.001,'p 'lt; 0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats de transmigration sous-optimale pour les lymphocytes T CD4 à faible viabilité. Des souris balB/c mâles naïfs ont été acquises pour la collecte des tissus pulmonaires et de la rate et l'isolement des cellules T CD4comme à la figure 1, à la figure 2et à la figure 3. Des cellules T CD4 ont été ajoutées à la chambre supérieure de l'appareil de transmigration et des supports sans sérum contenant CCL17, CCL22 ou aucune chimiokine (contrôle des médias) ont été ajoutés au puits inférieur. Pendant les 24 premières heures de l'expérience, la plaque a été laissée à température ambiante, puis elle a été déplacée vers un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pour 24 h supplémentaires (A) Pourcentage de cellules restant dans les puits supérieurs et inférieurs après 24 h. (B) Viabilité du C Cellules T D4MD dans la chambre supérieure et inférieure suite à de mauvaises conditions d'incubation. Ces données ont été générées à partir d'une seule expérience, 3 souris mâles naïfs ont été utilisées pour la collecte des tissus, et 3 répliques ont été faites par traitement. L'importance statistique n'a pas été déterminée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici, nous présentons une méthode bien établie pour évaluer la migration chimiokine-induite des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, dont la première est de vérifier l'expression du récepteur correct de chimiokine sur les cellules immunitaires dans l'expérience. Dans nos mains, nous avons choisi CCR4 en raison du corps de la littérature qui souligne l'importance de CCR4 sur les cellules T aide Th2 dans l'inflammation allergique. L'inflammation Ovalbumin-induite a été montrée précédemment pour être limitée par au moins deux antagonistes de CCR424,25; cependant, c'était avant la découverte du groupe 2 cellules lymphoïdes innées (ILC2)26,27. Nous avons généré de nouvelles données montrant que les cellules ILC2 expriment plus de CCR4 que les cellules CD4et T et avons montré que ces cellules étaient constamment sensibles au CCL22.

Une deuxième étape critique à suivre dans le protocole est de s'assurer que les cellules sont maintenues dans le milieu optimal pour la culture avant de commencer la partie de transmigration du protocole. Dans le cas de l'ILC2, nous avons dû culture ces cellules dans ILC2 Expansion Media qui contient à la fois IL-2 et IL-33. IL-2 et IL-7 sont tous deux rapportés dans la littérature pour soutenir ILC2 dans la culture pour un jusqu'à 14 jours28,29. Si la viabilité devient un problème pour les lymphocytes CD4et ILC2 dans de futures expériences, l'ajout d'IL-2 ou d'IL-7 améliorerait probablement la survie des lymphocytes jusqu'au point final de l'expérience. Chacun des supports présentés ci-dessus a été défini au cours de plusieurs expériences et a été optimisé pour une utilisation dans ce protocole14,30,31. Dans la figure 4, nous avons présenté des résultats erronés pour démontrer l'importance d'utiliser un incubateur avec une température appropriée et 5% CO2. Garder les plaques de transmigration dans l'incubateur où elles ne seront pas dérangées est une autre étape cruciale pour le succès du protocole.

Comme indiqué précédemment, il y a des avantages à utiliser la microscopie in vivo disponible dans la plupart des établissements, cependant, l'imagerie in vivo peut prendre du temps et coûteux. Une procédure expérimentale alternative qui est moins coûteuse utilise la microfluidique en combinaison avec des gradients de chimiokine pour comprendre l'extravasation des leucocytes et la migration des tissus32,33,34. Ces systèmes ont une valeur scientifique parce qu'ils évaluent la complexité de la cinétique cellulaire qui implique des cellules endothéliales, qui peuvent être cultivées sur les capillaires des systèmes microfluidiques. En outre, ces systèmes microfluidiques évaluent l'importance des protéines d'adhérence (par exemple, E-cadherin) sur les cellules endothéliales et les integrins sur les cellules immunitaires dans le processus d'adhérence cellulaire sous le flux sanguin. Néanmoins, ces systèmes nécessitent de l'équipement spécialisé et une programmation et des statistiques informatiques complexes pour déterminer l'importance de chaque affection de traitement. Par conséquent, bien que la limitation de la méthode de transmigration présentée ici soit qu'elle soit de nature artificielle, elle peut être utilisée comme un outil de dépistage important pour limiter le gaspillage de réactifs inutiles dans les méthodes in vivo ultérieures. L'importance de la méthode est que de nouvelles cellules sont découvertes, comme c'est le cas pour ILC2, nous pouvons dépister ces cellules pour leur réactivité aux chemokines connues. C'est l'une des applications futures impliquant ILC2 et thérapies potentielles qui peuvent inhiber leur migration dans les poumons pendant l'exacerbation d'asthme. Ce protocole de transmigration sera utilisé pour dépister divers inhibiteurs qui peuvent être utilisés pour limiter le CCR4 ou d'autres médiateurs chimiothérapeutiques impliqués dans le recrutement de l'ILC2. Au total, ce protocole de transmigration ex vivo conduira à la génération de données critiques qui pourront être vérifiées lors d'expériences in vivo futures.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas de divulgations financières ou de conflits d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par l'American Lung Association (K.J.W.), le fonds Memorial Eugene Kenney attribué à T.A.W. et K.J.W., un généreux soutien de démarrage de l'Université de l'Utah pour K.J.W., et un prix du ministère des Anciens Combattants à T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. est le récipiendaire d'un prix de chercheur en carrière scientifique (IK6 BX003781) du ministère des Anciens Combattants. Les auteurs tiennent à souligner l'aide éditoriale de Mme Lisa Chudomelka. Les auteurs remercient le noyau de cytométrie des flux de l'UNMC pour leur soutien dans la collecte des données de cytométrie de flux générées pour ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

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References

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Immunologie et infection numéro 151 CCL17 (C-C Motif Chemokine 17)/TARC (thymus et activation chemokine liée) CCL22 (C-C Motif Chemokine 22)/MDC (Ccphage-derived chemokine) CCR4 (CC Chemokine Receptor 4) CD4 T cell (CD4MD T helper cell)/Th2 ILC2: (Groupe 2 Cellule lymphoïde innée) OVA (Ovalbumin d'oeufs de poulet)
Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo
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Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

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