Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

Abstract

בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה שניתן לבצע עם מיומנויות מעבדה בסיסיות וחומרים להערכת התנועה לימפוציטים כימוקינטית במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. קבוצה 2 מולדת תאים הלימפה (ILC2) ו CD4+ T מסייע תאים היו מבודדים טחולים והריאות של עוף ביצה אובלבומין (OVA)-מאותגרים balb/c עכברים. אנו אישר את הביטוי של CCR4 הן CD4+ T תאים ו ILC2, יחסית. CCL17 ו CCL22 הם ליגנדס ידועים עבור CCR4; לכן, שימוש זה לשעבר שיטה vivo גלגול גירה בדקנו CCL17- ו CCL22 המושרה תנועה של CCR4+ לימפוציטים. כדי ליצור מעברי כימוקין, CCL17 ו CCL22 הוצבו בחדר התחתון של מערכת ההגירה. לימפוציטים מבודדים נוספו אז ללשכה העליונה ובמשך תקופה של 48 h לימפוציטים באופן פעיל הועברו דרך 3 יקרומטר נקבוביות לעבר כימוקין בחדר התחתון. זוהי מערכת יעילה לקביעת כימוקינטיקה של לימפוציטים, אבל, באופן מובן, לא לחקות את המורכבויות שנמצאו ב vivo מיקרוסביבות העוגב. זוהי מגבלה אחת של השיטה שניתן להתגבר על ידי תוספת של הדמיה באתרו של האיבר ולימפוציטים תחת לימוד. לעומת זאת, היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבצע על ידי טכנאי ברמת הכניסה בשיעור חסכוני הרבה יותר מאשר הדמיה חיה. כמו תרכובות טיפוליות להיות זמין כדי לשפר את ההגירה, כמו במקרה של הגידול תאים חיסוניים ציטוטוקסיים, או לעכב הגירה, אולי במקרה של מחלות אוטואימוניות שבו immunopathology הוא של דאגה, שיטה זו יכולה לשמש כ כלי ההקרנה. באופן כללי, השיטה יעילה אם כימוקין העניין מייצר בעקביות כימוקינטיקה ברמה גבוהה מבחינה סטטיסטית מאשר בקרת המדיה. במקרים כאלה, ניתן לקבוע גם את מידת העיכוב/השיפור של תרכובת נתונה.

Introduction

שיטת הגירה מקורית זו הוצגה על ידי סטיבן בוידן ב-1962 בכתב העת לרפואה ניסויית1. הרבה ממה שאנחנו יודעים על כימוטקסיס וכימוקינטיקה לא יהיה אפשרי ללא התפתחות של החדר Boyden. לפני הגילוי של כימוקין הראשון ב 1977, לשעבר vivo גלגול גירה מערכות שימשו כדי ללמוד על סרום-גורמים שיכולים לעצור את התנועה הסלולרית ב מקרופאגים תוך הגברה תנועתיות הסלולר ב נויטרופילים1,2. עושר רב של ידע פותחה לגבי הגירה התא החיסונית, ועד היום, 47 נוגדנים התגלו כעת עם 19 קולטנים תואמים3,4. בנוסף, המוני מעכבי/משפרי מסלולים אלה כימוקין עברו פיתוח למטרות טיפוליות5,6,7,8. רבים מן התרכובות הללו נבדקו בתאי הגירה דומים כדי להבין אינטראקציות ישירות בין תרכובות והיענות לתא החיסונית של כימוקין9.

הגירה, או דיאפאדזיס, לתוך רקמה דלקתית היא תהליך חיוני לתגובה דלקתית בריאה לזיהום ברור10,11. חדר boyden, מערכת גלגול גירה, או מכשירי העברת התקנים מורכבים בדרך כלל משני תאים מופרדים על ידי קרום נקבובי1,12. החדר התחתון מחזיק בדרך כלל מדיה המכילה את כימוקין של עניין, בעוד לוקיציטים ממוקמים בתא העליון. גודל הנקבובית בקרום ניתן לבחור בהתבסס על גודל התא של עניין. עבור פרוייקט זה, בחרנו 3 יקרומטר ממברנה נקבובי, כמו תאים הלימפה הם 7-20 יקרומטר בגודל, בהתאם לשלב של פיתוח הסלולר. זה גודל הנקבובית מבטיח כי תאים אלה אינם מתפרקים פסיבי דרך הנקבוביות, אבל הם באופן פעיל מעביר בתגובה הדרגתי כימוקין.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא יעילותו. ב vivo גלגול גירה קשה כי זה דורש הכשרה נרחבת בטיפול בעלי חיים וניתוח, ולעתים קרובות כרוך מיקרוסקופ רב עוצמה כי הוא לא תמיד זמין לחוקר. עלות הקרנה אפקטיבית של תרכובות חשב לשפר או לעכב הגירה יכול להתבצע מראש בהדמיה vivo. בגלל מערכת גלגול גירה נשלטת בחוזקה, תאים עשויים להיות מטופלים בתחילה ולאחר מכן הוסיף המנגנון גלגול או, להיפך, כימוקין יכול להיות מטופלים הראשון עם מעכב כימוקין ולאחר מכן תאים הוסיף המנגנון גלגול יטב. לבסוף, תאים אנדותל ו/או חלבונים קרום המרתף ניתן להוסיף לחלק התחתון של הכנס transwell 1-2 ימים לפני הניסוי transwell גירה כדי להבין את המעורבות של תאי המכשול האלה בתוך כימוקינטיקה. שוב, מניפולציות אלה של המערכת לספק אמצעי רב עוצמה לקביעת מידע חשוב על האפקטיביות של מתחם נתון מראש יותר מסובך במחקרים vivo.

ניצול מערכת קאמרית הגירה היא דרך יעילה להעריך את ניידות הימפוציטים תחת שונות בvivo ובתנאי מבחנה12,13,14. להלן, אנו מתארים שיטה ממוטבת להערכת תגובתיות vivo לימפוציט לשעבר לנוגדנים בחדר הגירה טרנסטראני. בדוגמה זו ניסוי, CD4+ T תאים וקבוצה 2 תאי הלימפה המולדת (ILC2) היו מבודדים מזכר ונקבה, balb/c עכברים בעקבות החשיפה לאלרגן. השערה נוצרה כי CCR4+ CD45+ שושלת היוחסין-(LIN-) ILC2 מעכברים מאותגרים לאלרגן יועברו ביעילות רבה יותר כלפי CCL17 וCCL22 מאשר CCR4+ CD4+ T מסייע תאים. CCL17 ו CCL22 הם נוגדנים המיוצר בדרך כלל על ידי תאים דנדריטים ומקרופאגים של M2 (אלרגית) פנוטיפ, בין תאים אחרים, ב אלרגיה15,16. CCL17 ו CCL22 יכול להיות מחושב כמו סמנים ביוארגטים של דלקת אלרגית כפי שהם מזוהים בקלות בריאות במהלך המשך הנשימה16,17,18. חשוב מכך, ביטוי CCR4 הוא גבוה בהשוואה לפקדים לא מטופלים, כפי שנחשף בנתונים bio, שנוצר מ ILC2 מבודד קרדית אבק הבית בעלי חיים מטופלים, ובדומה ILC2 מבעלי חיים תמימים מטופלים לשעבר vivo עם IL-33 ( אלרגן-קידום ציטוקין מולדים) upregulates CCR419,20. יתר על כן, על פי נתונים עבור ILC2 במסד הנתונים של הגנום האימונולוגיים (www.immgen.org), CCR4 mRNA מתבטאת במידה רבה אלה תאים חיסוניים מולדים. עד כה, מעט ידוע לגבי הסחר של ILC2 לתוך רקמות, אבל סביר להניח כי ILC2 ו CD4+ T תאים להשתמש בנוגדנים דומה וקולטנים עבור כימוטקאס וכימוקינטיקה כפי שהם מבטאים את גורמי התמלול דומים וקולטנים. כך, אנו השוונו CCL17 לעומת התגובה CCL22, של ILC2 ו CD4+ לימפוציטים, הן זכר ונקבה, בעלי חיים מאותגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (UNMC) ואוניברסיטת יוטה.

1. התקנה והכנת ריאגנטים

  1. הכינו את התקשורת המלאה RPMI (מכון הזיכרון ברוזוול).
    1. הוסף 10 מ ל של סרום בלתי מופעל חום של שור העוברי (FBS) כדי 90 mL של RPMI.
    2. הוסף 1 מ ל של הפניצילין 100x-סטרפטומיצין-גלוטמין ל 100 mL של 10% FBS RPMI.
  2. הכן ILC2 מדיית הרחבה.
    1. הוסף IL-2 ו-IL-33 (20 ng/mL כל cytokine) עד 10 מ ל של RPMI השלם.
    2. אם ציטוקינים מלאי הם 10 μg/mL, פיפטה 20 μL של IL-2 ו-IL-33 לתוך שפופרת 15 mL המכילה 10 מ ל של מדיה RPMI מלאה.
  3. הכנת מדיום לריאה דיסוציאציה.
    1. הוסף 50 מ"ג מסוג 1 כמוסות ל-250 mL של unsupplemented.
    2. הוסף 2.5 mL של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין ל 250 mL של מדיה בשלב 1.3.1.
    3. בעדינות לערבב את המדיה כדי להבטיח את סוג 1 הקולגן מומס לחלוטין לפני השימוש.
  4. הכנת סרום-RPMI חינם.
    1. לדלל 1 גרם של סרום ליאופלי (BSA) בשנת 200 mL של RPMI.
    2. הוסף 2 מ ל של סטרפטומיצין-גלוטמין 100x.
    3. ערבב בעדינות את המדיה כדי לוודא כי ה-BSA מומס לחלוטין במדיה לפני השימוש.
  5. הכן את אמצעי ההעברה באמצעות CCL17.
    1. לרכוש 10 מ"ל של RPMI ללא סרום ולהוסיף CCL17 [50 ng/mL].
      1. אם מלאי CCL17 הוא 10 μg/mL, להוסיף 50 μL של CCL17 stock כדי 10 מ ל של מדיה RPMI סרום חינם.
  6. הכן את אמצעי ההעברה באמצעות CCL22.
    1. לרכוש 10 מ"ל של RPMI ללא סרום ולהוסיף CCL22 [50 ng/mL].
    2. אם מלאי CCL22 הוא 10 μg/mL, להוסיף 50 μL של CCL22 stock כדי 10 מ ל של מדיה RPMI סרום חינם.
  7. להכין CCR4 נוגדן מכתים קוקטייל.
    1. עבור 10 בדיקות סה כ, להוסיף 5 μL של כל אחד מהנוגדנים הבאים לצינור 5 מ"ל: אנטי-עכבר CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2, ו ICOS.
      הערה: דוגמה לאופן הפיכת קוקטייל נוגדן עבור 10 דגימות: 0.5 μL של כל נוגדן x 10 דגימות = 5 μL של כל אחד מהנוגדנים המפורטים ב1.7.1.
    2. עבור 10 בדיקות בסך הכל, להוסיף 2.5 μL של נוגדנים הבאים לקוקטייל הנוגדן משלב 1.7.1: אנטי עכבר CD3, CD11c, ו-NK 1.1.
      הערה: דוגמה כדי להשלים את קוקטייל הנוגדן עבור 10 דגימות: 0.25 μL x 10 דגימות = 2.5 μL של CD3, CD11c ולאחר מכן 1.1 נוגדנים.
    3. לאחסן את הנוגדן CCR4 מכתים קוקטייל ב 4 ° צ' עד מוכן להוסיף דגימות. התעלם קוקטייל נוגדן לאחר 1 שבוע אם לא בשימוש.
  8. הכן 1x ייצוב מייצב.
    1. הוסף 10 מ ל של מים מזוקקים-מזוקק עד 5 מ ל של 3x ייצוב מייצב מרוכז

2. הכנת עכברים לאלרגן-התיגר BALB/c

הערה: עכברים זכר ונקבה BALB/c נרכשו מנהר צ'רלס (UNMC) או מעבדות ג'קסון (אוניברסיטת יוטה) בגיל 6 עד 8 שבועות.

  1. לאחר הסתגלות (1 שבוע), ברגישות כל החיות כדי OVA.
    1. שילוב 100 μg/ml OVA נספחת כדי אלומיניום הידרוקסיד (20 מ"ג/ml) בצינור 5 מ ל פוליסטירן.
    2. מערבבים את הצינור ומיד לצייר 500 μL של הבולם של ה-בי-אלום ל 1 מ ל, 28 גרם מזרק (מזרק אינסולין).
    3. מניחים עכבר בצנצנת פעמון המכילה את איזוofלאנה (1 – 2 מ ל תחת רצפה מזויפת, כך שהחיה אינה עומדת ישירות באיזוללוראן). אפשר לעכבר לעבור תחת הרדמה עבור כ 1 – 2 דקות, או עד שיעור טיפות הנשימה.
    4. במהירות להרים את העכבר על ידי הפרווה על הגב והכתפיים ולהזריק 100 μl של נובה-אלום intraperitoneally לכל עכבר21,22.
    5. מניחים את העכבר בכלוב שלו ולצפות כדי לוודא שהם מחדש ניידות; זה אמור להתרחש בתוך 2 – 5 דקות.
  2. שבעה ימים לאחר הרגישות, נושא כל בעלי החיים לintranasal (i.n.) 1.5% OVA מדולל בתמיסת מלח סטרילית בחדר הניבולטיזציה (מדעי המידע הבינלאומי) עבור 20 דקות.
    1. מסירים עכברים מהכלובים שלהם ומניחים אותם בחדר החיות הניבולזציה. . תסגור את המכסה של החדר
    2. חברו את צינור הניבולטיזציה. לזרבובית הכניסה בחדר הניבולטיזציה
    3. הוסף 30 מ ל של 1.5% OVA מדולל בתמיסת מלח סטרילית לגביע הניבולטיזציה על הניבולייזר.
    4. הפעל את המנייצר ואפשר לחדר להתמלא בערפל במשך 20 דקות.
    5. . תכבה את הנייזר ותן לערפל להתיישב
    6. . להחזיר חיות לכלובים שלהם
  3. חזור על שלב 2.2 עבור סך של 5 פעמים, על 5 ימים רצופים, כדי לגרום לדלקת אלרגית.

3. בידוד CD4+ T תאים מתוך Spleens והריאות של עכברים מאותגרים

  1. המתת חסד הומאנית כל בעלי הטיפול בחיות זכר ונקבה על ידי שיתוף2 חנק על פי פרוטוקולים IACUC מאושרים, באמצעות 2 כדי 3 בעלי חיים לכל קבוצה, לכל ניסוי.
  2. ריאות בלו ומוטות מבעלי חיים ורקמות במקום בצינורות הדיסוציאציה נפרדים המבוססים על סוג הרקמה והמין של בעל החיים23.
  3. הנתק רקמת ריאה ב 500 μL של ריאה מדיה דיסוציאציה (25 U/mL; הקולגנאז, סוג 1) ב הניתוק רקמות אוטומטי באמצעות הפרוטוקול ' ריאה '.
    1. חזור על 3.2 ו 3.3 סכום כולל של שתי פעמים.
  4. לנתק את רקמת הטחול ב-500 μL של מדיית RPMI מלאה באמצעות פרוטוקול ' טחול ' על מנתק הרקמה האוטומטית.
    הערה: את הצעדים הנותרים יש לבצע בקבינט בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקה סטרילית.
  5. לשטוף את צינורות הדיסוציאציה המכילים ריאות והטחול הומוטים עם 5 מ ל של מדיה נוספת של ריאה דיסוציאציה או Complete RPMI, בהתאמה.
  6. לסנן את השעיות תא באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר ולאסוף לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
  7. הריאה דגירה המגון עבור 15 – 30 דקות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי להוסיף עוד רקמת הריאה.
  8. הוסף 5 מ ל של RPMI להשלים את הריאה ואת הטחול המגון ו הגלולה התאים בחלק התחתון של צינורות 50 mL באמצעות צנטריפוגה; 378 x g בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
  9. לשלב את הטחול ואת התאים הריאות לתוך שפופרת יחיד 50 mL ולקבוע ספירות התא הכולל באמצעות מונה התא האוטומטי.
  10. התאימו את השעיות התאים הזכריים והנקביים ל-1 x 108 תאים/mL במאגר ההפרדה והוסיפו לצינור פוליסטירן של 5 מ ל.
    הערה: הפרוטוקול העשרה יכול להיות מותאם עד 14 מ ל שפופרת פוליסטירן כאשר התאים יותר נרכשים מן הטחול והריאות. פרוטוקול זה תוכנן עבור רקמות מ 2 – 3 עכברים לכל קבוצה; לכן שפופרת של 5 מ"ל צריכה להספיק.
  11. השתמש כ-2 שלישים מהתאים הכולל לבידוד ILC2 בהתאם לפרוטוקול העשרת הILC2.
    1. הוסף קוקטייל נוגדן (50 μL/mL) להשעיה של התא ו מודטה עבור 5 דקות at RT.
    2. וורטקס מהיר כדורים עבור 30 s ולהוסיף למדגם בקצב של 75 μL/mL של השעיית תא. בעדינות לערבב ו הדגירה עבור 5 דקות ב RT.
    3. מובילים את הצינורית עד 3 מ ל עם מאגר הפרדה ומקום במגנט הפרדה קל של 8 תאי. דגירה עבור 3 דקות at RT.
    4. עצה המגנט קדימה (הרחק מן הספירה-נוגדן תא מתחמי דבק לחלק האחורי של הצינור) ו פיפטה את ההשעיה התא לתוך צינור נקי 5 מ ל.
    5. הוסף 1.5 mL של RPMI להשלים את הצינורות ו צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    6. יוצקים את המדיה מתוך הגלולה תא ולהשעות מחדש את ILC2 ב 1 x 107 תאים לכל mL.
    7. מקום 100 uL של זכר ונקבה ILC2 per גם ב-U-תחתון, 96-באר צלחת ולהוסיף 100 μL של ILC2 הרחבת מדיה לכל טוב.
    8. מרחיב את התאים במשך 4 – 5 ימים כדי להרחיב את ILC2.
    9. לאסוף את ILC2 לתוך שפופרת 5 מ"ל ולהוסיף עד 4.5 mL של RPMI סרום חינם. צנטריפוגה את התאים ב 378 x g עבור 5 דקות ב RT.
    10. ספירת תאים באמצעות hemacytometer ולהשעות מחדש ב 1 x 107 ILC2 per mL ב-RPMI ללא סרום.
  12. השתמש בתאים הנותרים עבור הליך בידוד התא CD4+ t, הנערך בהתאם לפרוטוקול בידוד התא CD4+ t עם מספר שינויים.
    1. הוסף סרום חולדה (50 μL/mL) לCD4 ההעשרה של תא T.
    2. הוסף קוקטייל בידוד (50 μL/mL) למדגם ו-הדגירה עבור 10 דקות ב-RT.
    3. וורטקס מהיר כדורים עבור 30 s ולהוסיף למדגם בקצב של 75 μL/mL.
    4. בעדינות לערבב את ההשעיה התא ו הדגירה עבור 2.5 דקות ו-RT
    5. למעלה דגימות של עד 3 מ ל ולמקם את 5 הצינורות mL לתוך מגנט 8-הפרדה קל ההפרדה ו דגירה עבור 5 דקות ב RT.
    6. טיפ המגנט קדימה ומנקז את התא ההשעיה לתוך צינור 5 מ ל נקי.
    7. הוסף 1.5 מ ל של סרום ללא RPMI כדי שפופרות ו צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    8. יוצקים את המדיה מתוך הגלולה תא ולהשעות מחדש את התאים CD4+ T ב 1 x 107 תאים לכל mL ב-RPMI ללא סרום.

4. לקבוע CCR4 ביטוי על CD4+ T תאים וקבוצה 2 המולדת תאים הלימפה (ILC2) מבעלי חיים מאותגרים על ידי זרימה cy, לנסות

הערה: השלבים הבאים עשויים להתבצע על ראש ספסל פתוח כפי שהם טכניקות שאינן סטרילי.

  1. לרכוש כ 1 – 2.5 x 105 ILC2 תאים משלב 3.11.10 ו 1 – 2.5 x 106 CD4+ T תאים משלב 3.12.8 בנפרד 5 מ"ל צינורות.
    1. לשמור על שפופרת נוספת של לפחות 5.0 x 104 CD4 + T תאים כפקד בלתי מוכתם.
  2. השהה את התאים ב-100 – 200 μL של מאגר FACS והוסף 1 μL של בלוק Fc לכל צינור, לאחר מכן דגירה על הקרח (או במקרר 4 ° c) עבור 10 דקות.
  3. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  4. יוצקים את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב-100 – 200 μL של מאגר FACS.
  5. הוסף 37.5 μL של הנוגדן CCR4 מכתים קוקטייל להשעיה התא בכל צינור למעט הצינור המכיל את ' תאים ' לא מוכתם.
  6. מודקון את הצינורות על הקרח, או במקרר 4 ° c, במשך 20 – 30 דקות.
  7. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  8. . שפוך את הסופרנטאנט
  9. חזור על שלבים 4.7 ו-4.8.
  10. הוסף 250 – 300 μL של 1 x ייצוב מייצב (ראה טבלת חומרים) לכל צינור.
  11. להכין שולטת בצבע יחיד בצבעים עבור כל נוגדן בקוקטייל הנוגדן CCR4 בהתאם לפרוטוקול המסופק עם חרוזי פיצוי.
    1. . מערבולת את חרוזי הפיצויים
    2. הוסיפו טיפה אחת של החרוזים לכל צינור שליטה בצבע אחד.
    3. הוסף 1 μL של כל נוגדן בקוקטייל הנוגדן CCR4 לצינור התווית שלו.
    4. בעדינות לערבב הדגירה עבור 10 דקות במקרר 4 ° c או על קרח.
    5. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל הצינורות והצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    6. יוצקים את supernatant ולהשעות מחדש את החרוזים ב 200 μL של מאגר FACS.
    7. להכניס למקרר את הפקדים בצבע אחד עד כל הדגימות מוכתם ומוכן להיות מנותח על cytometer זרם.
  12. לנתח את התאים הבלתי מוכתמים, שולטת בצבע יחיד ואת דגימות ניסיוני על cytometer הזרימה בתוך 24 h של קיבעון.

5. נוהל הגירה Vivo טרנסלשעבר

הערה: את הצעדים הבאים יש לבצע בקבינט בטיחות ביולוגית, כפי שהם דורשים טכניקה סטרילית.

  1. רכוש את הILC2 משלב 3.11.10 וCD4 תאי T משלב 3.12.8 וקבע את מספר הוספות ההעברה הדרושות לניסוי.
    הערה: דוגמה: עבור 1.2 mL של תאים CD4 T מועשר משלב 3.12.8, להכפיל 1.2 x 1,000 μL = 1,200 μL; לאחר מכן לחלק 1,200 uL על ידי 100 μL = 12, מספר התוספות הדרושות עבור העברת CD4 T.
  2. להעביר בעדינות את 3 יקרומטר מוסיף שורות באמצע של צלחת 24-הבאר.
  3. הוסף 500 μL של מדיית הגירה עם CCL17 לערך שליש מבארות.
  4. הוסף 500 μL של מדיית הגירה עם CCL22 לעוד שליש מבארות.
  5. הוסף 500 μL של RPMI ללא סרום המכיל כימוקין לשליש האחרון של הבארות.
  6. ברור לתייג את המכסה על הצלחת עם מדיה ההגירה המתאים ממוקם בבארות התחתון.
  7. הציבו את מוסיף המשגר בחזרה לבארות המכילות את הטיפולים השונים.
  8. הוסף בעדינות 100 μL של תאים CD4 T או ILC2 לחלק העליון של כל הוספה. אל תערבב או מצנף את התא הבולם למעלה ולמטה בטרנסבארות, משום שזה עשוי לבלבל את תוצאות הניסוי.
  9. ברור לתייג את המכסה של הצלחת עם סוג תא ממוקם בכל באר ולכתוב את התאריך והשעה של היום כי התאים נוספו.
  10. חזור על שלבים 5.2 עד 5.9 עד שכל התאים הוצבו בתוך מוסיף העברה באמצעות מדיה.
  11. בעדינות למקם את הצלחת בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 48 h. למזער את הקשר עם הצלחת על פני תקופת הדגירה.

6. קוונפיקציה של הגירה Vivo Transmigration שעבר

  1. להסיר בעדינות את הצלחת מן החממה ולהסיר את כל מוסיף transwell מן השורות האמצעיות לתוך הבארות הריקות ממש מעל או מתחת.
  2. לאסוף את התאים מלמטה הבארות העליון של מוסיף transwell לתוך צינורות המסומנים עם העליון או התחתון, עם, CCL22, או מדיה, עם סוג התא, עם מספר שכפול (לפחות 3 משכפל לכל ניסוי).
  3. לשטוף את הבארות התחתונה עם 500 μL של 1x PBS ולאסוף את זה לשטוף לתוך הצינור המקביל.
  4. לשטוף את הבארות העליון עם 250 μL של 1x PBS ולאסוף את זה לשטוף לתוך הצינור המקביל.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  6. בעדינות מצנלת את כל. הסופרנטי מהגלולה
  7. השהה מחדש את תאי T ו ILC2 לתוך 50 μL של 1x PBS.
  8. קח 10 μL של השעיות התא והוסף ל-90 μL של 0.4% טרימטר כחול.
  9. ספירת התאים במונה התאים האוטומטיים.
    1. הקלטת% כדאיות.
    2. הקלט את ספירת התאים לכל mL עבור כל דוגמה.
    3. קבע את המספר הכולל של תאים לכל טיפול בחלק העליון ובחדר התחתון; תעד את ספירות התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CCR4 ביטוי בתאים CD4 + T וILC2.

להצלחה של ניסוי vivo גלגול גירה לשעבר, זה הכרחי כדי לקבוע אם לימפוציטים הם מגיבים CCL17 ו CCL22 דרך CCR4; לכן, קבענו CCR4 ביטוי בשני CD4+ T תאים וILC2 על ידי זרימה cy try. בעוד ידוע היטב כי CD4+ מסייע בתאי T CCR4 express, פחות ידוע על הביטוי של CCR4 על ILC2. איור 1 מציג את תוצאות הנציג של ביטוי CCR4, יחסית, על CD4+ T תאים (איור 1A, C) ו ILC2 (איור 1B, D) מן זכר ונקבה, ברובה מאותגרים balb/C. CyCCR4 try זרימה שימש כדי לזהות באמצעות נוגדן חד שבטיים מצועם כדי allophycocyanin (APC). באמצעות ניתוח בכיוון אחד של סטיה (ANOVA), קבענו שאין הבדלים בביטוי CCR4 בין מארחים זכריים ונקביים (איור 1A – D), עם זאת, הביטוי של CCR4 על בסיס תא (MFI) ב ILC2 היה גבוה יותר בהשוואה ל CD4 + תאי T (איור 1C לעומת איור 1c). תוצאות אלה חשובות בלהראות כי התאים ILC2 ו-CD4+ T אמורים להגיב לCCL17 וCCL22 בניסוי הבא.

תגובתיות של CD4+ T תאים כדי CCR4 ליגנדס בתאי העליון והתחתון של מערכת הגירה.

CD4+ T תאים מזכר, בעלי התיגר ביותר balb/c עכברים היו מבודדים מן הריאות טחולים והניח בחדר העליון של מנגנון גלגול מופרדים על ידי 3 μm ממברנה נקבובי (איור 2). סיכום של הכנת vivo של עכברים מטופלים (איור 2A) ושגרת ההעברה (איור 2a) מוצגים לעיון. שילוב של CCL17 (25 ng/mL) ו CCL22 (25 ng/mL) הוצבו בחדר העליון, החדר התחתון או שני הלשכה העליונה והתחתונה כדי לאשר (איור 2C), (1) כי התאים CD4+ T מבעלי חיים מאותגרים הרבה הגיב לCCR4 ליגנדס, ו (2) כי הגירה המושרה היה תהליך פעיל שבו תאי T נע דרך הנקבוביות בתגובה הדרגתי כימוקין, וכי לימפוציטים לא נע דרך הנקבוביות עצמאית של כימוקין. מדיה (No כימוקין) היה כלול כדי להראות כי CD4+ T תאים לא יכול להגר דרך הנקבוביות 3 μm ללא גירוי. במצב זה, האחוז הגבוה ביותר של תאים נשאר בתא העליון. כאשר הנוגדנים הונחו בחדר העליון והתחתון בו זמנית, גילינו 52% של תאי T הכולל בחדר התחתון ו 48% התאים בחדר העליון (העליון/תחתון הטיפול). כצפוי, התפלגות התאים הועברו בתגובה כימוקין רק בחלק העליון או רק בחדר התחתון, כפי שגילינו את האחוז הגבוה ביותר של תאים בתא שבו היה כימוקין היה נוכח.

תגובתיות של תאים CD4+ T וILC2 לCCL17 וCCL22 במנגנון ההגירה הvivo לשעבר.

CD4 T תאים ו ILC2 מן זכר ונקבה, העכברים מאותגרים ביותר היו מבודדים הריאות טחולים מכן ממוקם בחדר העליון של מנגנון transwell הגירה (איור 3). החדר התחתון של המנגנון היה מלא מדיה תרבותית תאים מטופל, מדיה המכילה CCL17, או מדיה המכילה CCL22. תוצאות הנציג מציגות שפחות מ -14% (13.37 + 6.5%) של התאים המועברים בתנאי בקרת מדיה (איור 3A – D). בתגובה CCL22, שני התאים, בין אם הם היו מארחים זכר או נקבה, הגיבו CCL22 (איור 3A – D), עם זאת, התוצאות עבור CCL17 היו עקביים פחות. CCL17 רק המושרה הגירה משמעותית CD4 T הנשי תאים ו ILC2 בהשוואה למדיה בלבד (איור 3ג, ד). CCL17 הטיפול לא היה שונה מאמצעי תקשורתלCD4 ולתאים זכריים מILC2 (איור 3A, B), ו CCL22 המושרה הגירה גדולה יותר מאשר CCL17 בILC2 גברים (איור 2b).

תוצאות העברת משנה אופטימלית עבור תאים CD4+ T עם יכולת קיום נמוכה.

תוצאות תת-אופטימליות נוצרו כדי לספק לחוקר דוגמה למה לצפות כאשר ניסוי העברת הטרנזקציות אינו פועל כראוי (איור 4). בודדנו זכר CD4+ T תאים מבעלי חיים על פי פרוטוקול זה והניח אותם בראש הטוב של מערכת גלגול. לאחר CD4+ T התאים נוספו, עם זאת, את הצלחת נשאר בטמפרטורת החדר עבור 24 h הראשון, ואז הצלחת הועברה לתוך החממה עבור הנותרים 24 h של תקופת הדגירה. לא באופן מפתיע, לא גילינו הגירה לכיוון CCL17 ו CCL22 (איור 4A) ואת הכדאיות של התאים היה נמוך במיוחד (< 15%) עבור התאים בחלק העליון (איור 4B). תוצאות פגומות אלה מדגישות את החשיבות של שימוש בטמפרטורות ובתנאים הנכונים המפורטים בפרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות אופטימליות.

Figure 1
איור 1: ביטוי CCR4 בתאים CD4+ T וILC2. 7 עד 9 בן שבוע, זכר ונקבה, עכברים BALB/c הוזרקו פעם אחת עם 100 μl של בינה-adsorbed לאלומיניום הידרוקסיד (500 μg/mL; OVA ו 20 mg/mL אלומיניום הידרוקסיד) 7 ימים לפני הראשון של 5, חוזרים, היום אתגרים בדרכי הנשימה עם 1.5% OVA ב תמיסת מלח. בעלי חיים מאותגרים לאלרגן היו מורדמים בהומאניות, ורקמת הריאה והטחול נאסף עבור ILC2 ו CD4+ T בידוד תאים. מכשיר קטן של תאים היה אז מוכתם ונותחו על ידי הזרימה cy, לנסות לקבוע את רמת CCR4 על כל סוג תא. (A) תדירות של תאים CD4+ T הCCR4+ מעכברים מסוג OVA +, כאשר קווי השגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (+ SEM). (ב) תדר של ILC2 שהיו CCR4+ (+ SEM). (ג, ד) עוצמת קרינה מרושעת (+ SEM) של CCR4 (C) CD4 + T תאים ו (ד) ILC2. בסך הכל 13 עכברים שימשו להפקת נתונים אלה, וניסוי הזרימה חזר פעמיים, עם 3 משכפל של כל טיפול לכל ניסוי. המשמעות נקבעה על-ידי ANOVA בכיוון אחד; n.d. מציין שלא היו הבדלים בין קבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התגובתיות של CD4+ T תאים כדי CCR4 ליגנדס בחדרי העליון והתחתון של מערכת הגירה טרנסליאני. עכבר balb/c הגברי רגישות ומאתגרת עם ביצת עוף אובלבומין (OVA) ו CD4 + T תאים היו מבודדים טחולים והריאות (A, B). עבור ניסוי זה להעברת הגירה, תאים CD4+ T הושעו במדיה ללא סרום ב-1 x 107 תאים/mL. CCL17 ו CCL22 נוספו מדיה ללא סרום בריכוז של 50 ng/mL (25 ng/mL של כל כימוקין כדי להשיג סך של 50 ng/mL). כימוקין-הוספת מדיה לחדר העליון בלבד, לחדר התחתון בלבד, או לתאים העליונים והתחתונים. נפח כולל של 500 μL של מדיית הגירה התווסף לבארות התחתונה ו 100 μL של השעיית הסלולר (1 x 106 תאים/טוב) התווסף הבאר העליון. טרנסנדידה נמדדה לאחר 48 h בתרבות (ג). נתונים אלה נוצרו מניסוי בודד, 3 מטופלים, עכברים זכרים שימשו לאיסוף רקמות, ו 3 משכפל נעשו לכל טיפול. המשמעות הסטטיסטית נקבעה על-ידי ANOVA בכיוון אחד; *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התגובתיות של CD4 + T תאים ו ILC2 כדי CCL17 ו CCL22 במנגנון ההגירה הvivo לשעבר . עכברים הוכנו כמו באיור 1 עבור CD4+ T תא ו ILC2 בידוד מן טחולים והריאות. CD4+ T תאים ו ILC2 הושעו במדיה ללא סרום ב 1 x 107 תאים/mL. CCL17 או CCL22 נוספו מדיה ללא סרום בריכוז של 50 ng/mL. 500 μl של מדיית גלגול נוספה לבארות התחתונות ו 100 μl של השעיית הסלולר (1 x 106 תאים/טוב) התווסף היטב למעלה. טרנסנדידה נמדדה לאחר 48 h בתרבות. (א) CD4+ T תאים ו (ב) ILC2 ממארחים גברים טופלו עם מדיה כשליטה, CCL17, או CCL22. באופן דומה, (ג) נשים CD4+ T בתאי ו (ד) ILC2 נשים טופלו עם מדיה, CCL17, או CCL22. סך של 14 עכברים שימשו להפקת נתונים אלה. ניסוי הגירה חוזר על עצמו 4 פעמים, עם 3 – 6 שכפול של כל טיפול לכל ניסוי. המשמעות נקבעה על-ידי ANOVA בכיוון אחד; *p < 0.05, * * *p < 0.001, * * * *p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות העברת משנה אופטימלית עבור תאים CD4 T עם יכולת קיום נמוכה. עכברים BALB/c נאיבי השיגו לאיסוף רקמת הריאה והטחול ו CD4+ T בידוד תא כמו באיור 1, איור 2, ואיור 3. תאים CD4 T נוספו לחדר העליון של מנגנון הגירה ומדיה ללא סרום המכיל CCL17, CCL22 או לא כימוקין (בקרת מדיה) נוספו לתחתית הבאר. עבור ה -24 הראשונים של הניסוי הצלחת להגיע בטמפרטורת החדר, ואז הוא הועבר לחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור תוספת של 24 שעות (a) אחוז של תאים שנותרו בבארות העליון והתחתון לאחר 24 h. (ב) הכדאיות של C D4 + תאי T בחדר העליון והתחתון בעקבות מצבי דגירה עניים. נתונים אלה נוצרו מניסוי בודד, 3 עכברים זכריים תמימים שימשו לאיסוף רקמות, ו 3 משכפל נעשו לכל טיפול. משמעות סטטיסטית לא נקבעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

להלן, אנו מציגים שיטה מבוססת היטב להערכת כימוקין המושרה הגירה של לימפוציטים במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, הראשון אשר מאמת את הביטוי של קולטן כימוקין הנכון על התאים החיסוניים בניסוי. בידינו, בחרנו CCR4 בגלל הגוף של ספרות המדגיש את החשיבות של CCR4 על Th2 תאים T מסייע בדלקת אלרגית. Ovalbumin המושרה דלקת הוכח בעבר להיות מוגבל על ידי לפחות שני CCR4 וניסטים24,25; עם זאת, זה היה לפני גילוי של הקבוצה 2 תאים הלימפה המולדת (ILC2)26,27. יצרנו נתונים חדשניים המראים כי תאים ILC2 לבטא גבוה יותר CCR4 CD4+ T תאים והראה כי תאים אלה היו מגיבים בעקביות לCCL22.

צעד קריטי שני לפעול בפרוטוקול הוא לוודא שהתאים נשמרים באמצעי התווך האופטימלי לתרבות לפני תחילת החלק של ההעברה בפרוטוקול. במקרה של ILC2, היינו צריכים להתרבות תאים אלה ב ILC2 הרחבת מדיה המכילה את IL-2 ו-IL-33. Il-2 ו-il-7 מדווחים בספרות לתמיכה בILC2 בתרבות של עד 14 ימים28,29. אם הכדאיות הופכת לבעיה עבור CD4+ T תאים וILC2 בניסויים עתידיים, התוספת של il-2 או il-7 צפוי לשפר את ההישרדות של לימפוציטים עד נקודת הקצה של הניסוי. כל אחד מאמצעי התקשורת שהוצגו בזאת הוגדרו במהלך מספר ניסויים והיו ממוטבים לשימוש בפרוטוקול זה14,30,31. באיור 4, הצגנו תוצאות פגומות כדי להדגים את החשיבות של שימוש באינקובטור עם טמפרטורה נאותה 5% CO2. שמירה על לוחיות המעבר בחממה, שם לא יפריעו להם, היא צעד קריטי נוסף להצלחת הפרוטוקול.

כפי שצוין קודם לכן, יש יתרונות לשימוש מיקרוסקופ vivo זמין ברוב המוסדות, עם זאת, בהדמיה vivo יכול להיות זמן רב ויקר. הליך ניסיוני אלטרנטיבי, כי הוא פחות יקר משתמש מיקרופלואידיקה בשילוב עם מעברי כימוקין כדי להבין ex, הגירה לוקיציט ורקמות32,33,34. מערכות אלה מחזיקים ערך מדעי משום שהם מעריכים את המורכבות של קינטיקה תאית הכוללת תאים אנדותל, אשר ניתן לגדל על נימים של מערכות microfluidic. יתר על כן, מערכות מיקרו-פלואידים אלה מערכת את החשיבות של חלבונים חסיד (למשל, E-קדהרין) על תאי האנדותל ואינטגרציה על התאים החיסוניים בתהליך של הדבקות בתאים תחת זרימת הדם. עם זאת, מערכות אלו דורשות ציוד מיוחד ותכנות וסטטיסטיקה מורכבים וסטטיסטיים כדי לקבוע את החשיבות של כל תנאי טיפול. לכן, למרות המגבלה של שיטת ההגירה המוצגת כאן היא כי הוא מלאכותי בטבע, זה יכול לשמש ככלי סינון חשוב כדי להגביל את בזבוז של ריאגנטים מיותרים בעקבות שיטות vivo. משמעות השיטה היא כי כמו תאים חדשים מתגלים, כמו במקרה של ILC2, אנחנו יכולים להקרין תאים אלה עבור התגובה שלהם נוגדנים ידוע. זהו אחד היישומים העתידיים מעורבים ILC2 וטיפולים פוטנציאליים שעלולים לעכב את הגירה שלהם לתוך הריאות במהלך החרפה אסתמה. פרוטוקול זה להעברת הגירה ישמש למסך מעכבי שונים שעשויים לשמש כדי להגביל CCR4 או מתווכים אחרים כימוטקטיק המעורבים בגיוס ILC2. לגמרי, זה פרוטוקול לשעבר vivo גלגול גירה יוביל לדור של נתונים קריטיים שניתן לאמת עם העתיד בניסויים vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים כספיים או קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי האגודה האמריקאית לריאות (K.J.W.), הקרן יוג'ין קני הזיכרון הוענק T.A.W. ו K.J.W., התחלה נדיבה תמיכה מאוניברסיטת יוטה עבור K.J.W., ו המחלקה לענייני ותיקי לשנת הפרס T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. הוא המקבל של פרס מדען קריירה מחקר (IK6 BX003781) מהמחלקה לענייני ותיקי. המחברים רוצים להכיר בסיוע המערכת מגברת ליסה צ'דואלקה. המחברים מודים על הליבה UNMC זרימה Cy, לתמיכה שלהם באיסוף הזרימה cy, לנסות את הנתונים שנוצרו עבור כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 151 CCL17 (C-C מוטיב כימוקין 17)/tarc (התימוס וההפעלה הקשורות כימוקין) CCL22 (C-C מוטיב כימוקין 22)/mdc (מקרופאג-נגזר כימוקין) CCR4 (הקולטן כימוקין 4) תא CD4 T (CD4 + T תא מסייע) ILC2: (קבוצה 2 תא הלימפה המולדת) OVA (ביצת עוף Ovalbumin)
הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter