Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एक पूर्व Vivo प्रवास प्रणाली में लिम्फोसाइट प्रवास का आकलन

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल में, लिम्फोसाइटों को स्थानांतरण प्रणाली के शीर्ष कक्ष में रखा जाता है, जो नीचे कक्ष से एक छिद्रयुक्त झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है। Chemokine नीचे कक्ष में जोड़ा जाता है, जो एक chemokine ढाल के साथ सक्रिय प्रवास लाती है. 48 ज के बाद, लिम्फोसाइटों को दोनों कक्षों में माइग्रेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए गिना जाता है।

Abstract

इसमें, हम एक कुशल विधि है कि बुनियादी प्रयोगशाला कौशल और सामग्री के साथ निष्पादित किया जा सकता है एक पूर्व vivo प्रवास प्रणाली में लिम्फोसाइट chemokinetic आंदोलन का आकलन प्रस्तुत करते हैं. समूह 2 जन्मजात लसीकाभ कोशिकाओं (ILC2) और CD4+ टी सहायक कोशिकाओं तिल्ली और चिकन अंडे ovalbumin के फेफड़ों से अलग किया गया (OVA)-challenged BALB / हम दोनों CD4+ टी कोशिकाओं और ILC2, तुलनात्मक रूप से पर CCR4 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की. CCL17 और CCL22 CCR4 के लिए जाना जाता ligands हैं; इसलिए, इस पूर्व vivo स्थानांतरण विधि का उपयोग कर हम CCL17 की जांच की- और CCR22 प्रेरित आंदोलन CCR4+ लिम्फोसाइटों. रसायन ग्राडिएंट्स स्थापित करने के लिए सीसीएल17 और सीसीएल22 को स्थानांतरण प्रणाली के निचले कक्ष में रखा गया था। अलग लिम्फोसाइटों तो शीर्ष कक्षों में जोड़ा गया और एक 48 एच अवधि में लिम्फोसाइटों सक्रिय रूप से नीचे कक्ष में chemokine की ओर 3 m pores के माध्यम से चले गए. यह लिम्फोसाइटों के कीमोकिनेटिक्स का निर्धारण करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली है, लेकिन, जाहिर है, विवो अंग माइक्रोएन्यूमेंट्स में पाए जाने वाले जटिलताओं की नकल नहीं करता है। यह विधि है कि अध्ययन के तहत अंग और लिम्फोसाइटों के situ इमेजिंग में जोड़ने के द्वारा दूर किया जा सकता है की एक सीमा है. इसके विपरीत, इस विधि का लाभ यह है कि लाइव इमेजिंग की तुलना में एक बहुत अधिक लागत प्रभावी दर पर एक प्रवेश स्तर तकनीशियन द्वारा किया जा सकता है. के रूप में चिकित्सकीय यौगिकों प्रवास को बढ़ाने के लिए उपलब्ध हो जाते हैं, के रूप में cytotoxic प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ ट्यूमर के मामले में, या प्रवास को बाधित करने के लिए, शायद autoimmune रोगों के मामले में जहां इम्यूनोपैथोलॉजी चिंता का विषय है, इस विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक स्क्रीनिंग उपकरण. सामान्य में, विधि प्रभावी है अगर ब्याज की chemokine लगातार मीडिया नियंत्रण से एक सांख्यिकीय उच्च स्तर पर chemokinetics पैदा कर रहा है. ऐसे मामलों में, किसी दिए गए यौगिक द्वारा निषेध/संवर्धन की डिग्री के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है।

Introduction

यह मूल स्थानांतरण विधि स्टीफन Boyden द्वारा 1962 में प्रयोगात्मक चिकित्साके जर्नल1में प्रस्तुत किया गया था . क्या हम chemotaxis और chemokinetics के बारे में पता है की बहुत Boyden कक्ष के विकास के बिना संभव नहीं होगा. 1977 में पहली chemokine की खोज से पहले, पूर्व vivo प्रवास प्रणालियों सीरम-कारकों कि मैक्रोफेज में सेलुलर आंदोलन को गिरफ्तार कर सकता है के बारे में जानने के लिए इस्तेमाल किया गया, जबकि न्यूट्रोफिल में सेलुलर गतिशीलता बढ़ाना1,2. प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास के संबंध में ज्ञान का एक विशाल धन विकसित किया गया है, और आज तक, 47 chemokines अब 19 इसी रिसेप्टर्स3,4के साथ की खोज की गई है. इसके अतिरिक्त , इन चीमोकीन पथों के अवरोधकों/संवर्धनों की भीड़ चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए विकास कर चुकी है5,6,7,8. इनमें से अनेक यौगिकों का इसी प्रकार के स्थानांतरण कक्षों में परीक्षण किया गया है ताकि यौगिकों के बीच प्रत्यक्ष अन्योन्यक्रिया को समझा जा सके और किसी दी गई कीमोकिन9के प्रति प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाशीलता को समझा जा सके .

वाष्पित, या डायपेडेसिस, सूजन ऊतक में स्पष्ट संक्रमण10,11के लिए एक स्वस्थ भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। बॉयडेन कक्ष, स्थानांतरण प्रणाली या ट्रांसवेल उपकरण सामान्यतः दो कक्षों से बना होता है जो छिद्रयुक्त झिल्ली1,12से अलग होते हैं . नीचे कक्ष सबसे अधिक बार ब्याज की chemokine युक्त मीडिया रखती है, जबकि ल्यूकोसाइट्स शीर्ष कक्ष में रखा जाता है. झिल्ली में छिद्र के आकार का चयन ब्याज की कोशिका के आकार के आधार पर किया जा सकता है। इस परियोजना के लिए, हमने 3 मीटर छिद्रयुक्त झिल्ली का चयन किया, क्योंकि लसीकाभ कोशिकाएं 7-20 उ उ हैं, जो कोशिकीय विकास की अवस्था के आधार पर होती हैं। यह छिद्र आकार यह सुनिश्चित करता है कि ये कोशिकाएं छिद्रों के माध्यम से निष्क्रिय रूप से नहीं गिर रही हैं, लेकिन वे सक्रिय रूप से chemokine ढाल के जवाब में पलायन कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ इसकी लागत प्रभावशीलता है. Vivo transmigration में मुश्किल है क्योंकि यह पशु हैंडलिंग और सर्जरी में व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और अक्सर उच्च स्तरीय माइक्रोस्कोपी है कि हमेशा एक शोधकर्ता के लिए उपलब्ध नहीं है शामिल है. यौगिकों की लागत प्रभावी स्क्रीनिंग को बढ़ाने या स्थानांतरण को बाधित करने के लिए सोचा vivo इमेजिंग में अग्रिम में पूरा किया जा सकता है. क्योंकि स्थानांतरण प्रणाली कसकर नियंत्रित किया जाता है, कोशिकाओं को शुरू में इलाज किया जा सकता है तो transwell उपकरण में जोड़ा, या, इसके विपरीत, chemokine पहले एक chemokine अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया जा सकता है तो कोशिकाओं transwell उपकरण में जोड़ा. अंत में, endothelial कोशिकाओं और / या तहखाने झिल्ली प्रोटीन transwell डालने के नीचे करने के लिए जोड़ा जा सकता है 1-2 दिन पहले स्थानांतरण प्रयोग करने के लिए chemokinetics में इन बाधा कोशिकाओं की भागीदारी को समझने के लिए. फिर, प्रणाली के इन जोड़तोड़ vivo अध्ययन में और अधिक जटिल के अग्रिम में एक दिया यौगिक की प्रभावशीलता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का निर्धारण करने का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करते हैं.

एक स्थानांतरण कक्ष प्रणाली का उपयोग विवो में विभिन्न के तहत लिम्फोसाइट गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है और इन विट्रो स्थितियोंमें 12,13,14. इसमें, हम एक स्थानांतरण कक्ष में chemokines के लिए पूर्व vivo लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन. इस उदाहरण प्रयोग में, CD4+ T कोशिकाओं और समूह 2 जन्मजात लसीकाभ कोशिकाओं (ILC2) पुरुष और महिला से अलग थे, BALB/c चूहों OVA-एलर्जी जोखिम के बाद. एक परिकल्पना उत्पन्न की गई थी कि CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 एलर्जी-चुनौती चूहों से CCL17 और CCL22 CCR4+ CD4+ T सहायक कोशिकाओं की तुलना में अधिक कुशलता से माइग्रेट होगा. सीसीएल17 और सीसीएल22 आमतौर पर डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं और एम 2 (एलर्जिक) फीनोटाइप के मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित कीमोकिन हैं, अन्य कोशिकाओं के बीच, एलर्जी15,16में । सीसीएल17 और सीसीएल22 को एलर्जी की सूजन के बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है क्योंकि वायुमार्ग में16,17,18के दौरान फेफड़ों में आसानी से पाया जाता है . महत्वपूर्ण बात, CCR4 अभिव्यक्ति अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में ऊंचा है, के रूप में घर धूल घुन इलाज जानवरों से अलग ILC2 से उत्पन्न bioinformatic डेटा में पता चला है, और इसी तरह IL-33 के साथ पूर्व vivo इलाज किया ( एलर्जी को बढ़ावा देने जन्मजात साइटोकिन) CCR419,20को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, इम्यूनोलॉजिकल जीनोम परियोजना डेटाबेस (www.immgen.org) में आईएलसी 2 के लिए डेटा के अनुसार, CCR4 MRNA अत्यधिक इन जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त की है. तारीख करने के लिए, थोड़ा ऊतकों में ILC2 के अवैध व्यापार के बारे में जाना जाता है, लेकिन यह संभावना है कि ILC2 और CD4+ टी कोशिकाओं chemotaxis और chemokinetics के लिए इसी तरह की chemokines और रिसेप्टर्स का उपयोग के रूप में वे इसी तरह के प्रतिलेखन कारकों और रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं. इस प्रकार, हम सीसीएल17 बनाम CCL22 जवाबदेही की तुलना में, ILC2 और CD4+ टी लिम्फोसाइटों, दोनों पुरुष और महिला, OVA-चुनौती पशुओं से.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों की समीक्षा की और नेब्रास्का मेडिकल सेंटर (UNMC) और यूटा विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. सेटअप और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. पूरा RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट) मीडिया तैयार करें.
    1. आरपीएमआई के 90 एमएल में 10 एमएल गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफपीएस) जोड़ें।
    2. 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन के 100 एमएल में 10% एफबीएस आरपीएमआई के 100 एमएल जोड़ें।
  2. ILC2 विस्तार मीडिया तैयार करें.
    1. आईएल-2 और आईएल-33 (20 एनजी/एमएल प्रत्येक साइटोकीन) को 10 एमएल पूर्ण RPMI में जोड़ें।
    2. यदि स्टॉक साइटोकिन्स 10 ग्राम/एमएल, पिपेट 20 एल आईएल-2 और आईएल-33 को 15 एमएल ट्यूब में पूर्ण आरपीएमआई मीडिया के 10 एमएल होते हैं।
  3. फेफड़ों के विघटन के माध्यम से तैयार करें।
    1. टाइप 1 कोलैजानेस के 50 मिलीग्राम को 250 एमएल में जोड़ें।
    2. चरण 1.3.1 में मीडिया के 250 एमएल में 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन के 2.5 एमएल जोड़ें।
    3. धीरे प्रकार 1 Collagenase पूरी तरह से उपयोग करने से पहले भंग कर दिया है यह सुनिश्चित करने के लिए मीडिया मिश्रण.
  4. सीरम मुक्त RPMI तैयार करें.
    1. आरपीएमआई के 200 एमएल में 1 ग्राम लाइओफिलाइज्ड गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)।
    2. 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन के 2 एमएल जोड़ें।
    3. बीएसए का उपयोग करने से पहले मीडिया में पूरी तरह से भंग हो गया है यह सुनिश्चित करने के लिए मीडिया मिश्रण।
  5. CCL17 के साथ माइग्रेशन माध्यम तैयार करें।
    1. सीरम मुक्त RPMI के 10 एमएल प्राप्त करें और CCL17 [50 ng/mL] जोड़ें।
      1. यदि स्टॉक CCL17 10 g/mL है, तो सीरम-मुक्त RPMI मीडिया के 10 एमएल में CCL17 स्टॉक के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  6. CCL22 के साथ माइग्रेशन माध्यम तैयार करें।
    1. सीरम मुक्त RPMI के 10 एमएल प्राप्त करें और CCL22 [50 ng/mL] जोड़ें।
    2. यदि स्टॉक CCL22 10 g/mL है, तो सीरम-मुक्त RPMI मीडिया के 10 एमएल में CCL22 स्टॉक के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  7. CCR4 एंटीबॉडी दाग कॉकटेल तैयार करें.
    1. कुल 10 परीक्षणों के लिए, 5 एमएल ट्यूब में निम्नलिखित एंटीबॉडी में से प्रत्येक का 5 $L जोड़ें: एंटी-माउस CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2, और ICOS।
      नोट: 10 नमूनों के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल बनाने के लिए कैसे का उदाहरण: 0.5 प्रत्येक एंटीबॉडी x 10 नमूने के एल - 1.7.1 में सूचीबद्ध एंटीबॉडी में से प्रत्येक के 5 डिग्री एल.
    2. कुल 10 परीक्षणों के लिए, चरण 1.7.1 से एंटीबॉडी कॉकटेल में निम्न एंटीबॉडी का 2.5 $L जोड़ें: एंटी-माउस CD3, CD11c, और NK1.1.
      नोट: उदाहरण के लिए 10 नमूनों के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल को पूरा करने के लिए: 0.25 [L x 10 नमूने ] 2.5 CD3, CD11c और NK1.1 एंटीबॉडी के एल.
    3. नमूनों को जोड़ने के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर CCR4 एंटीबॉडी दाग कॉकटेल स्टोर. 1 सप्ताह के बाद एंटीबॉडी कॉकटेल छोड़ें यदि उपयोग नहीं किया जाता है।
  8. 1x स्थिर फिक्सेटिव तैयार करें।
    1. 3x स्थिर स्थिर ध्यान केंद्रित की 5 एमएल करने के लिए deionized-डिस्टिल्ड पानी के 10 एमएल जोड़ें

2. एलर्जी-चुनौती वाले BALB/c चूहे की तैयारी

नोट: पुरुष और महिला BALB/c चूहों चार्ल्स नदी (UNMC) या जैक्सन प्रयोगशालाओं (उटाह के विश्वविद्यालय) से 6 से 8 सप्ताह की उम्र में खरीदा गया था.

  1. अनुकूलन (1 सप्ताह) के बाद, OVA के लिए सभी जानवरों को संवेदनशील.
    1. एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड (20 मिलीग्राम/एमएल) के लिए 100 g/mL OVA adsorbed गठबंधन।
    2. ट्यूब मिलाएं और तुरंत एक 1 एमएल, 28 जी सिरिंज (इंसुलिन सिरिंज) में OVA-एलम निलंबन के 500 डिग्री सेल्सियस आकर्षित।
    3. एक घंटी जार में एक माउस रखें जिसमें आईसोफ्लुरेन (1-2 एमएल एक झूठी मंजिल के नीचे) है, ताकि जानवर सीधे isoflurane में खड़ा नहीं है। माउस को लगभग 1-2 मिनट के लिए संज्ञाहरण के नीचे जाने की अनुमति दें, या जब तक श्वसन की दर नहीं गिरती है।
    4. जल्दी से पीठ और कंधों पर फर से माउस उठाओ और ओवा-एलम के 100 डिग्री सेल्सियस प्रति माउस21,22इंजेक्ट करें।
    5. माउस को अपने पिंजरे में वापस रखें और यह सुनिश्चित करने के लिए देखें कि वे गतिशीलता हासिल करें; यह 2-5 मिनट के भीतर होना चाहिए.
  2. संवेदीकरण के सात दिन बाद, सभी जानवरों को इंट्रानैसल (i.n.) के अधीन करें 1.5% OVA 20 मिनट के लिए एक नेबुलाइजेशन चैम्बर (डेटा साइंसेज इंटरनेशनल) में बाँझ नमकीन में पतला।
    1. उनके पिंजरों से चूहों निकालें और उन्हें पशु nebulization कक्ष में जगह है. कक्ष पर ढक्कन बंद करें.
    2. nebulization कक्ष पर इनपुट spout करने के लिए nebulization नली संलग्न करें.
    3. नेबुलाइज़र पर नेबुलाइजेशन कप में बाँझ नमकीन में पतला 1.5% OVA के 30 एमएल जोड़ें।
    4. नेबुलाइज़र को चालू करें और कक्ष को 20 मिनट के लिए धुंध से भरने की अनुमति दें।
    5. नेबुलाइज़र बंद करें और धुंध को व्यवस्थित होने दें।
    6. जानवरों को उनके पिंजरों में वापस करें।
  3. एलर्जी सूजन पैदा करने के लिए, लगातार 5 दिनों पर, कुल 5 बार के लिए चरण 2.2 दोहराएँ।

3. सीडी 4+ टी कोशिकाओं के तिल्ली और OVA-चुनौती चूहे के फेफड़ों से अलगाव

  1. सभी OVA इलाज पुरुष और मादा जानवरों को सीओ2 asphyxiation द्वारा मानवीय रूप से इच्छामृत्यु अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रति समूह 2 से 3 जानवरों का उपयोग कर, प्रति प्रयोग.
  2. पशुओं के फेफड़ों और तिल्ली को उत्पादित करें और ऊतक के प्रकार और पशु के लिंग के आधार पर अलग -अलग वियोजन ट्यूबों में ऊतकों को रखें.
  3. फेफड़ों के विघटन मीडिया (25 U/mL; कोलाजनेस, टाइप 1) के 500 डिग्री एल में फेफड़ों के ऊतकों को 'लंग' प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्वचालित ऊतक डिसोसेस्टर में अलग करें।
    1. 3.2 और 3.3 को दोहराएँ कुल दो बार.
  4. स्वचालित ऊतक वियोजनकर्ता पर 'स्प्लेन' प्रोटोकॉल का उपयोग करपूर्ण पूर्ण RPMI मीडिया के 500 डिग्री सेल्सियस में तिल्ली ऊतक को अलग करें।
    नोट: शेष कदम बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए.
  5. क्रमशः अतिरिक्त फेफड़ों के विघटन मीडिया या पूर्ण RPMI के 5 एमएल के साथ फेफड़ों और तिल्ली homogenates युक्त वियोजन ट्यूबों कुल्ला.
  6. एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर और 50 एमएल शंकु ट्यूबों में इकट्ठा.
  7. फेफड़ों के ऊतकों को और अलग करने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट फेफड़ों homogenates।
  8. फेफड़ों और तिल्ली homogenates के लिए पूर्ण RPMI के 5 एमएल जोड़ें और centrifugation का उपयोग कर 50 एमएल ट्यूबों के तल पर कोशिकाओं को गोली; कमरे के तापमान पर 378 x g (आरटी) 5 मिनट के लिए।
  9. स्प्लेनोसाइट्स और फेफड़ों की कोशिकाओं को एकल 50 एमएल शंकु ट्यूब में संयोजित करें और स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कुल सेल गणना निर्धारित करें।
  10. पुरुष और महिला सेल निलंबन को 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल को जुदाई बफर में समायोजित करें और 5 एमएल पॉलीस्टाइरीन ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: अधिक कोशिकाओं तिल्ली और फेफड़ों से प्राप्त कर रहे हैं जब संवर्धन प्रोटोकॉल 14 एमएल polystyrene ट्यूबों को समायोजित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल से ऊतकों के लिए डिजाइन किया गया था 2-3 चूहों प्रति समूह; इसलिए एक 5 एमएल ट्यूब पर्याप्त होना चाहिए।
  11. ILC2 संवर्धन प्रोटोकॉल के अनुसार ILC2 आइसोलेशन के लिए कुल कक्षों के लगभग दो तिहाई का उपयोग करें.
    1. सेल निलंबन के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल (50 जेडएल/एमएल) जोड़ें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. 30 s के लिए भंवर तेजी से क्षेत्रों और सेल निलंबन के 75 डिग्री सेल्सियस की दर से नमूना करने के लिए जोड़ें। आरटी में 5 मिनट के लिए धीरे से मिश्रण और इनक्यूबेट करें।
    3. जुदाई बफर और 8 कक्ष आसान जुदाई चुंबक में जगह के साथ 3 एमएल कुल मात्रा अप करने के लिए ट्यूब शीर्ष। आरटी में 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    4. टिप चुंबक आगे (क्षेत्र antibody-सेल परिसरों से दूर ट्यूब के पीछे का पालन किया) और एक साफ 5 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन बंद pipette.
    5. ट्यूब ों के लिए 1.5 एमएल पूर्ण RPMI जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज पर 378 x g के लिए 5 मिनट RT.
    6. सेल गोली से मीडिया डालो और 1 x 107 कोशिकाओं प्रति एमएल पर ILC2 resuspend.
    7. एक यू-नीचे, 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से पुरुष और महिला आईएल 2 के 100 यूएल रखें और प्रत्येक अच्छी तरह से आईएलसी 2 विस्तार मीडिया के 100 $L जोड़ें।
    8. आईएलसी2 का विस्तार करने के लिए कोशिकाओं को 4-5 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. एक 5 एमएल ट्यूब में ILC2 ले लीजिए और सीरम मुक्त RPMI के 4.5 एमएल तक जोड़ें. आरटी में 5 मिनट के लिए 378 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. एक hemacytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और सीरम मुक्त RPI में 1 x 107 ILC2 प्रति एमएल पर resuspend.
  12. CD4+ T सेल आइसोलेशन प्रक्रिया के लिए शेष कक्षों का उपयोग करें, जो कुछ संशोधनों के साथ माउस CD4+ T सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया जाता है.
    1. CD4 टी सेल संवर्धन निलंबन के लिए चूहे सीरम (50 $L/mL) जोड़ें.
    2. आरटी में 10 मिनट के लिए नमूना और इनक्यूबेट में आइसोलेशन कॉकटेल (50 जेडएल/एमएल) जोड़ें।
    3. 30 s के लिए भंवर तेजी से क्षेत्रों और 75 डिग्री सेल्सियस की दर से नमूना करने के लिए जोड़ें।
    4. धीरे से 2.5 मिनट और आर टी के लिए सेल निलंबन और इनक्यूबेट मिश्रण
    5. 3 एमएल तक के नमूनों को ऊपर रखें और आरटी में 5 मिनट के लिए 8-चैम्बर आसान जुदाई चुंबक और इनक्यूबेट में 5 एमएल ट्यूबों को रखें।
    6. चुंबक आगे टिप और एक साफ 5 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन pippette.
    7. ट्यूब ों के लिए सीरम-मुक्त आरपीएमआई के 1.5 एमएल जोड़ें और आरटी में 5 मिनट के लिए 378 x ग्राम पर अपकेंद्रण।
    8. सेल गोली से मीडिया डालो और सीरम मुक्त RPMI में प्रति एमएल 1 x 107 कोशिकाओं पर CD4+ टी कोशिकाओं को पुन: निलंबित.

4. प्रवाह Cytometry द्वारा OVA-चुनौतीपूर्ण पशु से CD4+ टी कोशिकाओं और समूह 2 सहज लिम्फोइड सेल (ILC2) पर CCR4 अभिव्यक्ति निर्धारित

नोट: निम्नलिखित चरणों के रूप में वे गैर बाँझ तकनीक हैं एक खुले बेंच शीर्ष पर किया जा सकता है.

  1. कदम से लगभग 1-2.5 x 105 ILC2 कोशिकाओं का अधिग्रहण 3.11.10 और 1-2.5 x 106 CD4+ टी कोशिकाओं से कदम 3.12.8 अलग 5 एमएल ट्यूबों में.
    1. कम से कम 5.0 x 104 CD4 + T कोशिकाओं की एक अतिरिक्त ट्यूब एक बेदाग नियंत्रण के रूप में रखें।
  2. एफएसीएस बफर के 100-200 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को निलंबित करें और प्रत्येक ट्यूब में 1 डिग्री सेल्सियस एफसी ब्लॉक जोड़ें, फिर बर्फ पर इनक्यूबेट करें (या 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में)।
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 378 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 1-2 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें।
  4. सुपरनेटेंट को डालो और एफएसीएस बफर के 100-200 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. CCR4 एंटीबॉडी दाग कॉकटेल के 37.5 $L जोड़ें हर ट्यूब में सेल निलंबन के लिए 'अनिवार्य' कोशिकाओं युक्त ट्यूब को छोड़कर.
  6. 20-30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब, या 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करें।
  7. आरटी पर 5 मिनट के लिए 378 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 1-2 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें।
  8. सुपरनेंट को डालो।
  9. चरण 4.7 और 4.8 दोहराएँ.
  10. प्रत्येक ट्यूब में 1x स्थिर स्थिर करने वाला 250-300 $ल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक ट्यूब में।
  11. मुआवजा मोती के साथ प्रदान की प्रोटोकॉल के अनुसार CCR4 एंटीबॉडी कॉकटेल में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक रंग का मनका नियंत्रण तैयार करें।
    1. मुआवजा मोती भंवर.
    2. प्रत्येक एकल रंग नियंत्रण ट्यूब के लिए मोती की एक बूंद जोड़ें.
    3. CCR4 एंटीबॉडी कॉकटेल में अपने स्वयं के लेबल ट्यूब के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के 1 डिग्री एल जोड़ें.
    4. एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में या बर्फ पर 10 मिनट के लिए धीरे से मिश्रण और इनक्यूबेट।
    5. सभी ट्यूबों में 1-2 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए 378 x g पर अपकेंद्रण।
    6. supernatant बंद डालो और FACS बफर के 200 $L में मोती resuspend.
    7. सभी नमूनों दाग और प्रवाह cytometer पर विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक एकल रंग नियंत्रण फ्रिज.
  12. निर्धारण के 24 घंटे के भीतर प्रवाह cytometer पर unstained कोशिकाओं, एकल रंग नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने का विश्लेषण करें.

5. पूर्व Vivo स्थानांतरण प्रक्रिया

नोट: निम्नलिखित चरणों में एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए, के रूप में वे बाँझ तकनीक की आवश्यकता है.

  1. चरण 3.11.10 और CD4 T कक्षों से 3.11.10 और CD4 T कक्षों को चरण 3.12.8 से प्राप्त करें और प्रयोग के लिए आवश्यक ट्रांसवेल आवेषणों की संख्या निर्धारित करें.
    नोट: उदाहरण: चरण 3.12.8 से समृद्ध CD4 T कोशिकाओं के 1.2 एमएल के लिए, 1.2 x 1,000 $L $ 1,200 $L की गुणा करें; फिर 1,200 यूएल को 100 डिग्री सेल्सियस 12, सीडी 4 टी प्रवास के लिए आवश्यक आवेषणों की संख्या को विभाजित करें।
  2. 24-वेल प्लेट की मध्यम पंक्तियों से 3 डिग्री मीटर ट्रांसवेल को धीरे-धीरे ले जाएं।
  3. CCL17 के साथ प्रवास मीडिया के 500 $L कुओं के लगभग एक तिहाई करने के लिए जोड़ें.
  4. सीसीएल22 के साथ प्रवास मीडिया के 500 डिग्री सेल्सियस को अन्य एक तिहाई कुओं में जोड़ें।
  5. कुओं के अंतिम एक तिहाई करने के लिए कोई chemokine युक्त सीरम मुक्त RPMI के 500 $L जोड़ें.
  6. स्पष्ट रूप से प्लेट पर ढक्कन को नीचे के कुओं में रखे उपयुक्त स्थानांतरण मीडिया के साथ लेबल करें।
  7. ट्रांसवेल को विभिन्न उपचारों वाले कुओं में वापस डालें।
  8. धीरे से प्रत्येक डालने के शीर्ष अच्छी तरह से CD4 टी कोशिकाओं या ILC2 के 100 $L जोड़ें. ट्रांसवेल्स में सेल निलंबन को मिश्रण या पिपेट न करें, क्योंकि इससे प्रयोग के परिणामों को भ्रमित किया जा सकता है।
  9. स्पष्ट रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से रखा सेल प्रकार के साथ थाली के ढक्कन लेबल और दिन की तारीख और समय है कि कोशिकाओं को जोड़ा गया लिखें.
  10. कदम दोहराएँ 5.2 से 5.9 जब तक सभी कोशिकाओं transwell सम्मिलित करता है में मीडिया के साथ रखा गया है.
  11. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% ब्व्2 के साथ 48 ज के लिए रखें। ऊष्मायन अवधि में प्लेट के साथ संपर्क को कम करें।

6. पूर्व Vivo स्थानांतरण की मात्रा

  1. धीरे से इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें और मध्य पंक्तियों से सभी ट्रांसवेल आवेषणको ऊपर या नीचे खाली कुओं में निकाल दें।
  2. नीचे से कोशिकाओं को ले लीजिए और transwell के शीर्ष कुओं शीर्ष या BOTTOM के साथ लेबल ट्यूबों में सम्मिलित करता है, CCL17 के साथ, CCL22, या मीडिया, सेल प्रकार के साथ, और प्रतिकृति संख्या के साथ (कम से कम 3 प्रयोग प्रति प्रतिकृति).
  3. 1x पीबीएस के 500 $L के साथ नीचे कुओं कुल्ला और इसी ट्यूब में इस कुल्ला इकट्ठा.
  4. 1x पीबीएस के 250 $L के साथ शीर्ष कुओं कुल्ला और इसी ट्यूब में इस कुल्ला इकट्ठा.
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 378 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें।
  6. कोशिका गोली से सभी supernatant बंद धीरे pipette.
  7. 1x पीबीएस के 50 डिग्री एल में टी कोशिकाओं और आईएलसी 2 को पुन: निलंबित करें।
  8. सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस ले लो और 0.4% trypan नीले रंग की 90 $L करने के लिए जोड़ें।
  9. स्वचालित कक्ष काउंटर पर कक्षों की गणना करें.
    1. रिकॉर्ड %viability.
    2. प्रत्येक नमूने के लिए प्रति एमएल कक्ष संख्या रिकॉर्ड करें.
    3. शीर्ष और नीचे कक्ष में उपचार प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें; कक्ष गणनाएँ रिकॉर्ड करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CD4 + T कक्षों और ILC2 पर CCR4 व्यंजक.

पूर्व vivo स्थानांतरण प्रयोग की सफलता के लिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या लिम्फोसाइटों CCL17 और CCR4 के माध्यम से CCL22 के लिए उत्तरदायी हैं आवश्यक है; इसलिए, हमने प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD4+ T कक्षों और आईएलसी2 दोनों पर CCR4 व्यंजक निर्धारित किया है. हालांकि यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि OVA-विशिष्ट CD4+ सहायक टी कोशिकाओं CCR4 व्यक्त, कम ILC2 पर CCR4 की अभिव्यक्ति के लिए जाना जाता है. चित्र 1 CCR4 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है, तुलनात्मक रूप से, CD4+ T कोशिकाओं पर (चित्र 1A,C) और ILC2 (चित्र 1B,D) पुरुष और महिला से, OVA-challenged BALB/ प्रवाह साइटोमिट्री एलोफाइकोसाइनिन (एपीसी) के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संयुग्मी का उपयोग करके सीसीआर 4 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक-वे वैकेंसी का उपयोग करते हुए , हमने निर्धारित किया कि पुरुष और महिला होस्ट्स के बीच CCR4 अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं था (चित्र 1A-D),तथापि, आईएलसी 2 पर प्रति सेल आधार पर CCR4 की अभिव्यक्ति CD4 की तुलना में अधिक थी + टी सेल ( चित्र 1Dकी तुलनामें चित्र 1C )। ये परिणाम यह दिखाने में महत्वपूर्ण हैं कि ILC2 और CD4+ T सेल को निम्न प्रयोग में CCL17 और CCL22 का प्रतिसाद देना चाहिए.

एक स्थानांतरण प्रणाली के ऊपर और नीचे कक्षों में सीसीआर 4 ligands के लिए CD4+ टी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया.

सीडी 4+ पुरुष से टी कोशिकाओं, OVA-challenged BALB/c चूहों फेफड़ों और तिल्ली से अलग किया गया और एक 3 डिग्री ग्राम झिल्ली से अलग एक स्थानांतरण उपकरण के शीर्ष कक्ष में रखा गया था (चित्र 2) . ओवा-उपचारित चूहों की इन विवो तैयारी का सारांश (चित्र 2क) तथा स्थानांतरण प्रक्रिया (चित्र 2ख) संदर्भ के लिए दर्शाया गया है। CCL17 (25 ng/mL) और CCL22 (25 ng/mL) का एक संयोजन शीर्ष कक्ष में रखा गया था, नीचे कक्ष या दोनों ऊपर और नीचे कक्षों की पुष्टि करने के लिए (चित्र 2C), (1) कि CD4+ टी कोशिकाओं OVA-चुनौती वाले जानवरों से सीसीआर 4 के लिए उत्तरदायी थे ligands, और (2) कि chemokine प्रेरित प्रवास एक सक्रिय प्रक्रिया है जिसके द्वारा टी कोशिकाओं chemokine ढाल के जवाब में pores के माध्यम से आगे बढ़ रहे थे, और यह कि लिम्फोसाइटों chemokine के स्वतंत्र pores के माध्यम से नहीं जा रहे थे. एक मीडिया (कोई Chemokine) नियंत्रण को दिखाने के लिए कि CD4+ टी कोशिकाओं उत्तेजना के बिना 3 डिग्री एम pores के माध्यम से स्थानांतरित नहीं कर सका शामिल किया गया था. इस स्थिति में, कोशिकाओं का उच्चतम प्रतिशत शीर्ष कक्ष में बने रहे। जब chemokines ऊपर और नीचे कक्ष में एक साथ रखा गया था, हम नीचे कक्ष में कुल टी कोशिकाओं के 52% और शीर्ष कक्ष में कोशिकाओं के 48% का पता चला (TOP/ जैसा कि उम्मीद थी, कोशिकाओं का वितरण केवल शीर्ष में या केवल नीचे कक्ष में रखा chemokine के जवाब में चले गए, के रूप में हम डिब्बे में कोशिकाओं के उच्चतम प्रतिशत का पता चला जहां chemokine मौजूद था.

एक पूर्व vivo स्थानांतरण उपकरण में सीसीएल17 और सीसीएल22 के लिए सीडी 4+ टी कोशिकाओं और आईएलसी 2 की उत्तरार्तकता।

सीडी 4 टी कोशिकाओं और पुरुष और महिला से आईएलसी 2, OVA-चुनौती चूहों फेफड़ों और तिल्ली से अलग तो एक ट्रांसवेल स्थानांतरण तंत्र के शीर्ष कक्ष में रखा गया था (चित्र 3). उपकरण के नीचे कक्ष अनुपचारित सेल संस्कृति मीडिया, CCL17 युक्त मीडिया, या CCL22 युक्त मीडिया से भर गया था. प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि कम से कम 14% (13.37 + 6.5%) मीडिया नियंत्रण स्थितियों में स्थानांतरित कक्षों में से (चित्र 3A-D)। CCL22 के प्रत्युत्तर में, दोनों सेल प्रकार, चाहे वे पुरुष या महिला मेजबान से थे, CCL22 को जवाब दिया (चित्र 3ए -डी),तथापि, CCL17 के लिए परिणाम कम संगत थे. CCL17 केवल केवल केवल मीडिया की तुलना में महिला CD4 टी कोशिकाओं और ILC2 के लिए महत्वपूर्ण प्रवास प्रेरित (चित्र 3सी, डी) . CCL17 उपचार पुरुष CD4+ टी कोशिकाओं या पुरुष ILC2 के लिए मीडिया से अलग नहीं था (चित्र 3ए, बी), और CCL22 प्रेरित से अधिक प्रवास CCL17 में CCL17 ( चित्र2B) .

CD4+ T कोशिकाओं के लिए कम व्यवहार्यता के साथ suboptimal स्थानांतरण परिणाम.

अनुमंडलकपरिणामन के परिणाम अनुसंधानकर्ता को यह एक उदाहरण प्रदान करने के लिए उत्पन्न किए गए थे कि जब स्थानांतरण प्रयोग ठीक से कार्य नहीं करता है तो क्या अपेक्षा की जानीककी जा सके ( चित्र 4)। हम इस प्रोटोकॉल के अनुसार जानवरों से पुरुष CD4+ टी कोशिकाओं को अलग और उन्हें स्थानांतरण प्रणाली के शीर्ष अच्छी तरह से में रखा. सीडी 4+ टी कोशिकाओं को जोड़ा गया था के बाद, तथापि, थाली पहले 24 एच के लिए कमरे के तापमान पर बने रहे, तो प्लेट ऊष्मायन अवधि के शेष 24 एच के लिए इनक्यूबेटर में ले जाया गया था। आश्चर्य नहीं कि हमने सीसीएल17 और सीसीएल 22 की ओर कोई प्रवास नहीं पाया (चित्र 4क) और कोशिकाओं की व्यवहार्यता विशेष रूप से कम थी ([lt;15%) शीर्ष में कोशिकाओं के लिए (चित्र 4B) . इन त्रुटिपूर्ण परिणाम सही तापमान और इस प्रोटोकॉल में विस्तृत शर्तों का उपयोग करने के लिए इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के महत्व पर प्रकाश डाला.

Figure 1
चित्र 1: CD4+ T कक्षों और ILC2 पर CCR4 व्यंजक. 7 से 9 सप्ताह पुराने, पुरुष और महिला, BALB/c चूहों एक बार के साथ इंजेक्शन थे 100 $L OVA-adsorbed एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड (500 $g/ OVA और 20 mg/mL एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड) 7 दिन पहले से पहले 5, दोहराव, दैनिक airway चुनौतियों के साथ 1.5% गोवा नमकीन में. एलर्जी-चुनौती वाले जानवर मानवीय रूप से इच्छामृत्यु, और फेफड़े और तिल्ली ऊतक आईएलसी 2 और सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एकत्र किए गए थे। कोशिकाओं का एक छोटा सा एलिकोट तो दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था प्रत्येक सेल प्रकार पर CCR4 के स्तर का निर्धारण. (क)CD4+ T कक्षों की आवृत्ति जो CCR4+ OVA+ चूहों से हैं, जहाँ त्रुटि पट्टियाँ माध्य (+ SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. (B)आईएलसी 2 की आवृत्ति जो CCR4+ (+SEM) थी। (सी, डी) माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता(ब्) सीडी4 ़ टी कोशिकाओं तथा (डी) आईएलसी2 पर CCR4 की तीव्रता (+SEM). कुल 13 चूहों इन डेटा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और प्रवाह प्रयोग दो बार दोहराया गया था, प्रति प्रयोग प्रत्येक उपचार के 3 प्रतिकृति के साथ. महत्व वन-वे ANOVA द्वारा निर्धारित किया गया था; n.d. इंगित करता है कि समूहों के बीच कोई अंतर नहीं था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक स्थानांतरण प्रणाली के ऊपर और नीचे कक्षों में CCR4 ligands करने के लिए CD4+ टी कोशिकाओं की उत्तरउत्तरदायीता. पुरुष BALB/c चूहों संवेदनशील और चिकन अंडे ovalbumin (OVA) और CD4 + टी कोशिकाओं के साथ चुनौती दी तिल्ली और फेफड़ों से अलग किया गया (ए, बी). इस स्थानांतरण प्रयोग के लिए, सीडी 4+ टी कोशिकाओं सीरम मुक्त मीडिया में 1 x 107 कोशिकाओं / सीसीएल17 और सीसीएल22 को सीरम-मुक्त मीडिया में 50 एनजी/एमएल (25 एनजी/एमएल प्रत्येक की डिग्री/ Chemokine युक्त मीडिया केवल शीर्ष कक्ष में जोड़ा गया था, नीचे कक्ष में ही, या दोनों ऊपर और नीचे कक्षों के लिए. 500 डिग्री सेल्सियस के स्थानांतरण मीडिया की कुल मात्रा को नीचे के कुओं में जोड़ा गया था और 100 डिग्री सेल्सियस सेलुलर निलंबन (1 x 106 कोशिकाओं/ प्रवास को संस्कृति में 48 एच के बाद मापा गया (सी) . ये डेटा एक ही प्रयोग से उत्पन्न किए गए थे, 3 OVA इलाज, पुरुष चूहों ऊतक संग्रह के लिए इस्तेमाल किया गया, और 3 प्रतिकृति उपचार प्रति बनाया गया. सांख्यिकीय महत्व वन-वे ANOVA द्वारा निर्धारित किया गया था; *पी एंड एलटी; 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक पूर्व vivo स्थानांतरण उपकरण में सीडी 4 + टी कोशिकाओं और सीसीएल 17 और CCL22 के लिए आईएलसी 2 की उत्तरदायीता। चूहे सीडी 4 + टी सेल और तिल्ली और फेफड़ों से आईएलसी 2 अलगाव के लिए चित्र 1 में के रूप में तैयार किए गए थे। सीडी 4+ टी कोशिकाओं और आईएलसी 2 सीरम मुक्त मीडिया में 1 x 107 कोशिकाओं / CCL17 या CCL22 सीरम मुक्त मीडिया के लिए 50 एनजी /एमएल की एकाग्रता में जोड़ा गया. 500 $L के नीचे कुओं में जोड़ा गया था और सेलुलर निलंबन के 100 $L (1 x 106 कोशिकाओं / आप्रवास संस्कृति में 48 एच के बाद मापा गया था. (ए) सीडी 4+ टी सेल और (बी) आईएलसी 2 पुरुष मेजबानों से मीडिया के साथ नियंत्रण, CCL17, या CCL22 के रूप में व्यवहार किया गया. इसी प्रकार , (सी) मादा सीडी 4+ टी सेल और (डी) महिला आईएलसी 2 का इलाज मीडिया, सीसीएल17 या सीसीएल22 के साथ किया गया था। इन डेटा को जनरेट करने के लिए कुल 14 चूहों का उपयोग किया गया था। स्थानांतरण प्रयोग 4 बार दोहराया गया था, प्रति प्रयोग प्रत्येक उपचार के 3-6 प्रतिकृति के साथ. महत्व वन-वे ANOVA द्वारा निर्धारित किया गया था; *पी एंड एलटी; 0.05, * ** पी और एलटी; 0.001, * * *पी और एलटी; 0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कम व्यवहार्यता वाले CD4 T कक्षों के लिए उपऑप्टिमल स्थानांतरण परिणाम। नवे नर बलब/ग चूहों को फेफड़ों और तिल्ली ऊतक संग्रह तथा सीडी4+ टी सेल पृथक्केश के लिए प्राप्त किया गया था जो चित्र 1, चित्र 2और चित्र 3में है . CD4 टी कोशिकाओं को स्थानांतरण तंत्र और सीसीएल 17, CCL22 या कोई chemokine (मीडिया नियंत्रण) युक्त सीरम मुक्त मीडिया के शीर्ष कक्ष में जोड़ा गया अच्छी तरह से नीचे करने के लिए जोड़ा गया. प्रयोग के पहले 24 एच के लिए प्लेट कमरे के तापमान पर छोड़ दिया गया था, तो यह एक अतिरिक्त 24 ज के लिए 5% सीओ2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए ले जाया गया था (ए) 24 एच के बाद ऊपर और नीचे कुओं में शेष कोशिकाओं का प्रतिशत (बी) सी की व्यवहार्यता D4 + ऊपर और नीचे कक्ष में टी कोशिकाओं गरीब ऊष्मायन की स्थिति के बाद. इन आंकड़ों को एक ही प्रयोग से उत्पन्न किए गए थे, 3 भोले पुरुष चूहों ऊतक संग्रह के लिए इस्तेमाल किया गया, और 3 प्रतिकृति उपचार प्रति किए गए थे. सांख्यिकीय महत्व निर्धारित नहीं किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इसमें, हम एक पूर्व विवो स्थानांतरण प्रणाली में लिम्फोसाइटों के chemokine प्रेरित प्रवास का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि पेश करते हैं। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिनमें से पहले प्रयोग में प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर सही chemokine रिसेप्टर की अभिव्यक्ति की पुष्टि कर रहा है. हमारे हाथों में, हम क्योंकि साहित्य के शरीर है कि एलर्जी सूजन में Th2 सहायक टी कोशिकाओं पर CCR4 के महत्व पर प्रकाश डाला गया CCR4 के कारण CCR4 चुना. Ovalbumin प्रेरित सूजन पहले कम से कम दो CCR4 विरोधी24,25द्वारा सीमित किया जा करने के लिए दिखाया गया था; तथापि, यह समूह 2 जन्मजात लसीकाभ कोशिकाओं (ILC2)26,27की खोज से पहले था. हमने उपन्यास डेटा जेनरेट किया है जो यह दर्शाता है कि आईएलसी 2 सेल CD4+ T कोशिकाओं की तुलना में अधिक CCR4 को व्यक्त करते हैं और यह दर्शाता है कि ये कोशिकाएं लगातार CCL22 के प्रति उत्तरदायी थीं.

प्रोटोकॉल में पालन करने के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के स्थानांतरण भाग की शुरुआत करने से पहले संस्कृति के लिए इष्टतम माध्यम में रखा जाता है। आईएलसी2 के मामले में, हमें आईएलसी2 विस्तार मीडिया में इन कोशिकाओं को संस्कृति देना था जिसमें आईएल-2 और आईएल-33 दोनों शामिल हैं। आईएल-2 और आईएल-7 दोनों को साहित्य में 14 दिन28,29तक संस्कृति में आईएलसी 2 का समर्थन करने के लिए सूचित किया गया है . यदि भविष्य के प्रयोगों में CD4+ T cells और ILC2 के लिए व्यवहार्यता एक मुद्दा बन जाता है, तो आईएल-2 या आईएल-7 के शामिल होने से प्रयोग के समापन बिंदु तक लिम्फोसाइटों के अस्तित्व में सुधार होने की संभावना है। यहां प्रस्तुत प्रत्येक मीडिया को अनेक प्रयोगों के दौरान परिभाषित किया गया था और इस प्रोटोकॉल14,30,31में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था . चित्र 4 मेंहमने दोषपूर्ण परिणाम प्रस्तुत किए हैं ताकि इनक्यूबेटर को उचित ताप तथा 5% सीओ2के साथ उपयोग करने के महत्व को प्रदर्शित किया जा सके . इनक्यूबेटर में स्थानांतरण प्लेटों को रखते हुए जहां वे परेशान नहीं होंगे, प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है।

जैसा कि पहले कहा गया है, अधिकांश संस्थानों में उपलब्ध इन विवो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के फायदे हैं, हालांकि, विवो इमेजिंग में समय लगता है और महंगा हो सकता है। एक वैकल्पिक प्रायोगिक प्रक्रिया जो कम महंगी होती है , ल्यूकोसाइट अपव्यय और ऊतक प्रवास32,33,34को समझने के लिए कीमोकीन ग्रेडिएंट के संयोजन में माइक्रोफ्लूइडिक्स का उपयोग करती है . इन प्रणालियों वैज्ञानिक मूल्य पकड़ क्योंकि वे सेल गतिज की जटिलताओं है कि endothelial कोशिकाओं, जो microfluidic प्रणालियों के केशिकाओं पर उगाया जा सकता शामिल है का आकलन. इसके अलावा, इन microfluidic प्रणालियों के पालन प्रोटीन के महत्व का आकलन (उदा., ई-cadherin) endothelial कोशिकाओं पर और रक्त प्रवाह के तहत सेल पालन की प्रक्रिया में प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर integrins. फिर भी इन प्रणालियों विशेष उपकरण और जटिल कम्प्यूटेशनल प्रोग्रामिंग और आँकड़े प्रत्येक उपचार की स्थिति के महत्व को निर्धारित करने की आवश्यकता है. इसलिए, हालांकि यहाँ प्रस्तुत transmigration विधि की सीमा यह है कि यह प्रकृति में कृत्रिम है, यह एक महत्वपूर्ण स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है vivo तरीकों में बाद में अनावश्यक अभिकर्मकों की बर्बादी को सीमित करने के लिए. विधि का महत्व यह है कि के रूप में नई कोशिकाओं की खोज कर रहे हैं, के रूप में ILC2 के लिए मामला है, हम ज्ञात chemokines के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए इन कोशिकाओं स्क्रीन कर सकते हैं. यह आईएलसी 2 और संभावित उपचारों से जुड़े भावी अनुप्रयोगों में से एक है जो अस्थमा की उत्तेजना के दौरान फेफड़ों में उनके प्रवास को बाधित कर सकते हैं। इस स्थानांतरण प्रोटोकॉल विभिन्न inhibitors कि CCR4 या अन्य chemotactic मध्यस्थों ILC2 की भर्ती में शामिल सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कुल मिलाकर, इस पूर्व vivo स्थानांतरण प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण डेटा है कि vivo प्रयोगों में भविष्य के साथ सत्यापित किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए नेतृत्व करेंगे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों कोई वित्तीय खुलासे या ब्याज के संघर्ष का खुलासा किया है.

Acknowledgments

यह काम अमेरिकी फेफड़े एसोसिएशन (K.J.W.), मेमोरियल यूजीन Kenney निधि T.A.W. और K.J.W. को सम्मानित किया, K.J.W. के लिए यूटा विश्वविद्यालय से उदार शुरू समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और T.A.W. (VA I01BX0003635) के लिए दिग्गजों मामलों के पुरस्कार के एक विभाग. T.A.W. दिग्गजों मामलों के विभाग से एक अनुसंधान कैरियर वैज्ञानिक पुरस्कार (IK6 BX003781) के प्राप्तकर्ता है. लेखक सुश्री लिसा चुडोमेल्का से संपादकीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक इस पांडुलिपि के लिए उत्पन्न प्रवाह साइटोमेट्री डेटा एकत्र करने में उनके समर्थन के लिए UNMC फ्लो साइटोमेट्री कोर का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 सीसीएल17 (सी-सी मोटिफ चेमोकिन 17)/TARC (थाइमस और सक्रियण संबंधित chemokine) CCL22 (सी-सी मोटिफ चेमोक 22)/MDC (मैक्रोफेज व्युत्पन्न Chemokine) CCR4 (CC Chemokine Receptor 4) CD4 Tcell /C/ ILC2: (समूह 2 सहज लिम्फोइड सेल) OVA (चिकन अंडे Ovalbumin)
एक पूर्व Vivo प्रवास प्रणाली में लिम्फोसाइट प्रवास का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter