Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering av overføring av lymfocytter i et ex vivo Transmigration system

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

I denne protokollen, er lymfocytter plassert i øverste kammeret i et Transmigration system, adskilt fra bunnen kammer av en porøs membran. Chemokine legges til bunnen kammer, som induserer aktiv migrasjon langs en chemokine gradient. Etter 48 h, er lymfocytter telles i begge kamre for å quantitate Transmigration.

Abstract

Heri, presenterer vi en effektiv metode som kan utføres med grunnleggende laboratorie ferdigheter og materialer for å vurdere lymfocytter chemokinetic bevegelse i et ex vivo Transmigration system. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) og CD4+ T helper celler ble isolert fra spleens og lunger av kylling egg OVALBUMIN (OVA)-utfordret BALB/c mus. Vi bekreftet uttrykk for CCR4 på både CD4+ T celler og ILC2, relativt. CCL17 og CCL22 er de kjente ligander for CCR4; Derfor, ved hjelp av denne ex vivo Transmigration metoden vi undersøkt CCL17- og CCL22-indusert bevegelse av CCR4+ lymfocytter. Å etablere chemokine graderinger, CCL17 og CCL22 ble plassert i bunnen kammer av Transmigration systemet. Isolerte lymfocytter ble deretter lagt til toppen kamre og over en 48 h perioden lymfocytter aktivt migrert gjennom 3 μm porene mot chemokine i bunnen kammeret. Dette er et effektivt system for å bestemme chemokinetics av lymfocytter, men forståelig nok, ikke etterligne kompleksiteten funnet i in vivo organ microenvironments. Dette er en begrensning av metoden som kan overvinnes ved tilsetning av in situ Imaging av orgel og lymfocytter under studien. I kontrast, fordelen med denne metoden er som kan utføres av en entry-level tekniker på en mye mer kostnadseffektiv hastighet enn Live Imaging. Som terapeutiske forbindelser blir tilgjengelig for å forbedre migrasjon, som i tilfelle av tumor infiltrere cytotoksisk immunceller, eller for å hemme migrasjon, kanskje i tilfelle av autoimmune sykdommer der immunopathology er av interesse, kan denne metoden brukes som en verktøy for screening. Generelt er metoden effektivt hvis chemokine av interesse konsekvent genererer chemokinetics på et statistisk høyere nivå enn medie kontrollen. I slike tilfeller kan graden av hemming/forsterkning av en gitt sammensatte bestemmes også.

Introduction

Denne originale Transmigration metoden ble presentert av Stephen Boyden i 1962 i Journal of Experimental Medicine1. Mye av det vi vet om chemotaxis og chemokinetics ville ikke være mulig uten utviklingen av Boyden kammeret. Før oppdagelsen av den første chemokine i 1977, ex vivo Transmigration systemer ble brukt til å lære om serum-faktorer som kan arrestere mobilnettet bevegelse i makrofager mens forsterke mobilnettet motilitet i nøytrofile1,2. En massiv vell av kunnskap har blitt utviklet om immun celle migrasjon, og hittil har 47 chemokiner nå blitt oppdaget med 19 tilsvarende reseptorer3,4. I tillegg mengder av hemmere/enhancers av disse chemokine trasé har gjennomgått utvikling for terapeutiske formål5,6,7,8. Mange av disse forbindelsene har blitt testet i lignende Transmigration kamre for å forstå direkte interaksjoner mellom forbindelsene og immun cellen respons til en gitt chemokine9.

Transmigration, eller diapedese, i betent vev er en viktig prosess til en sunn inflammatorisk respons for å fjerne smitte10,11. Et Boyden kammer, Transmigration system, eller transwell apparat er vanligvis sammensatt av to kamre adskilt av en porøs membran1,12. Den nederste kammer oftest har medier som inneholder chemokine av interesse, mens leukocytter er plassert i øverste kammeret. Størrelsen på pore i membranen kan velges basert på størrelsen på cellen av interesse. For dette prosjektet, valgte vi en 3 μm porøs membran, som lymfoide celler er 7-20 μm i størrelse, avhengig av stadium av cellulær utvikling. Denne størrelsen på porene sikrer at disse cellene ikke er passivt å falle gjennom porene, men at de er aktivt migrerer som svar på chemokine gradient.

Den store fordelen med denne protokollen er dens kostnadseffektivitet. In vivo Transmigration er vanskelig fordi det krever omfattende opplæring i dyr håndtering og kirurgi, og ofte innebærer høy-drevet mikroskopi som ikke alltid er tilgjengelig for en forsker. Kostnadseffektiv screening av forbindelser som antas å forsterke eller hemme Transmigration kan oppnås i forkant av in vivo Imaging. Fordi Transmigration systemet er strengt kontrollert, celler kan behandles i utgangspunktet deretter lagt til transwell apparatet, eller omvendt, kan chemokine behandles først med en chemokine inhibitor deretter celler lagt til transwell apparatet. Til slutt, endothelial celler og/eller kjeller membran proteiner kan legges til bunnen av transwell sette inn 1-2 dager før Transmigration eksperimentet for å forstå involvering av disse barriere celler i chemokinetics. Igjen, disse manipulasjoner av systemet gir en kraftig måte å bestemme viktig informasjon om effektiviteten av en gitt sammensatte i forkant av mer kompliserte in vivo studier.

Bruk av et Transmigration kammer system er en effektiv måte å vurdere mobilitet av lymfocytter under forskjellige in vivo-og in vitro-betingelser12,13,14. Her beskriver vi en optimalisert metode for å vurdere respons på ex vivo-lymfocytter for å chemokiner i et Transmigration kammer. I dette eksempelet eksperimentet, CD4+ T celler og gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) ble isolert fra mannlige og KVINNELIGE, BALB/c mus etter OVA-allergen eksponering. En hypotese ble generert at CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 fra allergen-utfordret mus ville MIGRERE mer effektivt mot CCL17 og CCL22 enn CCR4+ CD4+ T hjelper celler. CCL17 og CCL22 er chemokiner vanligvis produsert av dendrittiske celler og makrofager av m2 (allergisk) fenotype, blant andre celler, i allergi15,16. CCL17 og CCL22 kan betraktes som biomarkører av allergisk betennelse som de er lett oppdages i lungene under luftveiene eksaserbasjoner16,17,18. Viktigere, CCR4 uttrykk er forhøyet i forhold til ubehandlede kontroller, som avslørt i Bioinformatic data generert fra ILC2 isolert fra huset støv midd behandlede dyr, og tilsvarende ILC2 fra naive dyr behandlet ex vivo med IL-33 ( allergen-fremme medfødt cytokin) upregulates CCR419,20. Videre, ifølge data for ILC2 i immunologiske Genova Project database (www.immgen.org), CCR4 mRNA er svært uttrykt i disse medfødte immunceller. Hittil er lite kjent om handel med ILC2 i vev, men det er sannsynlig at ILC2 og CD4+ T celler bruk lignende chemokiner og reseptorer for chemotaxis og chemokinetics som de uttrykker lignende transkripsjon faktorer og reseptorer. Således, sammenlignet vi CCL17 versus CCL22 respons, av ILC2 og CD4+ T-lymfocytter, fra både mannlige og KVINNELIGE, OVA-utfordret dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) og University of Utah.

1. oppsett og tilberedning av reagenser

  1. Forbered komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Media.
    1. Tilsett 10 mL varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS) til 90 mL RPMI.
    2. Tilsett 1 mL 100 prosent penicillin-Streptomycin-glutamin til 100 mL på 10% FBS RPMI.
  2. Forbered ILC2 Expansion Media.
    1. Legg IL-2 og IL-33 (20 ng/mL hver cytokin) til 10 mL komplett RPMI.
    2. Hvis lager cytokiner er 10 μg/mL, Pipetter 20 μL av IL-2 og IL-33 i et 15 mL rør som inneholder 10 mL komplett RPMI-medium.
  3. Forbered Lung dissosiasjon medium.
    1. Tilsett 50 mg av type 1 kollagenase til 250 mL unsupplemented RPMI.
    2. Legg til 2,5 mL av 100 Streptomycin-glutamin til 250 mL av mediet i trinn 1.3.1.
    3. Bland mediene forsiktig for å sikre at type 1-Kollagenase er helt oppløst før bruk.
  4. Klargjør serum fri RPMI.
    1. Fortynne 1 g av lyofilisert storfe serum albumin (BSA) i 200 mL av RPMI.
    2. Tilsett 2 mL av 100-Streptomycin-glutamin.
    3. Bland mediene forsiktig for å sikre at BSA er fullstendig oppløst i mediene før bruk.
  5. Klargjør migrering medium med CCL17.
    1. Skaff 10 mL serum fri RPMI og Legg til CCL17 [50 ng/mL].
      1. Hvis lager CCL17 er 10 μg/mL, tilsett 50 μL av CCL17 lager til 10 mL serum fritt RPMI-medium.
  6. Klargjør migrering medium med CCL22.
    1. Skaff 10 mL serum fri RPMI og Legg til CCL22 [50 ng/mL].
    2. Hvis lager CCL22 er 10 μg/mL, tilsett 50 μL av CCL22 lager til 10 mL serum fritt RPMI-medium.
  7. Forbered CCR4 antistoff farging cocktail.
    1. For 10 tester totalt, tilsett 5 μL av hver av de følgende antistoffer mot et 5 mL rør: anti-mus CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 og ICOER.
      Merk: Eksempel på hvordan du lager antistoff-cocktail for 10 prøver: 0,5 μL av hvert antistoff x 10 prøver = 5 μL av hver av Antistoffene som er listet i 1.7.1.
    2. For 10 tester totalt, tilsett 2,5 μL av følgende antistoffer mot antistoff cocktail fra trinn 1.7.1: anti-mus CD3, CD11c, og NK 1.1.
      Merk: Eksempel for å fullføre antistoff-cocktail for 10 prøver: 0,25 μL x 10 prøver = 2,5 μL av CD3, CD11c og NK 1.1 antistoffer.
    3. Oppbevar CCR4 antistoff farging cocktail ved 4 ° c inntil klar til å legge til prøvene. Kast antistoff cocktail etter 1 uke hvis den ikke brukes.
  8. Forbered 1x stabiliserende bindemiddel.
    1. Tilsett 10 mL deionisert-destillert vann til 5 mL 3x stabiliserende bindemiddel konsentrat

2. utarbeidelse av allergen-utfordret BALB/c mus

Merk: Mannlige og kvinnelige BALB/c mus ble kjøpt fra Charles-elven (UNMC) eller Jackson Laboratories (University of Utah) ved 6 til 8 ukers alder.

  1. Etter acclimation (1 uke), sensitize alle dyrene til OVA.
    1. Kombiner 100 μg/mL OVA adsorberes til aluminiumsfolie (20 mg/mL) i et 5 mL polystyren rør.
    2. Bland røret og umiddelbart trekke 500 μL av OVA-Alun suspensjon i en 1 mL, 28 G sprøyte (insulinsprøyte).
    3. Plasser en mus i en bjelle krukke som inneholder isoflurane (1 – 2 mL under et falskt gulv, slik at dyret ikke står direkte i isoflurane). La musen til å gå under anestesi for ca 1-2 min, eller til frekvensen av åndedrett dråper.
    4. Raskt plukke opp musen ved pelsen på ryggen og skuldrene og injisere 100 μL av OVA-Alun intraperitonealt per mus21,22.
    5. Plasser musen tilbake i buret sitt og se for å sikre at de gjenvinne mobilitet; Dette skal skje innen 2 – 5 min.
  2. Syv dager etter overfølsomhet, underlagt alle dyr til intranasal (i.n.) 1,5% OVA fortynnet i steril saltvann i et forstøvning kammer (data Sciences International) i 20 min.
    1. Fjerne mus fra deres burene og sted seg inne dyret forstøvning kammeret. Lukk lokket på kammeret.
    2. Fest forstøvning slangen til inngangs tuten på forstøvning kammeret.
    3. Tilsett 30 mL 1,5% OVA fortynnet i sterilt saltvann til forstøvning koppen på forstøveren.
    4. Slå på forstøveren og la kammeret å fylle med tåke i 20 min.
    5. Slå av forstøveren og la tåken bosette seg.
    6. Returner dyr til burene.
  3. Gjenta trinn 2,2 for totalt 5 ganger, på 5 påfølgende dager, for å indusere allergisk betennelse.

3. isolering av CD4+ T celler fra Spleens og LUNGER av OVA-utfordret mus

  1. Humant euthanize alle OVA-behandlet mannlige og kvinnelige dyr av CO2 kvelning henhold til godkjente IACUC protokoller, bruker 2 til 3 dyr per gruppe, per eksperiment.
  2. Avgiftsdirektoratet lunger og spleens fra dyr og plassere vev i separate dissosiasjon rør basert på vevet type og sex av dyret23.
  3. Distansere lunge vev i 500, μL av Lung dissosiasjon Media (25 U/mL; kollagenase, type 1) i det automatiserte vevet dissociator ved bruk av ' lunge ' protokollen.
    1. Gjenta 3,2 og 3,3 totalt to ganger.
  4. Distansere milt vev i 500 μL av komplett RPMI Media ved hjelp av "milt"-protokollen på automatiserte vev dissociator.
    Merk: De resterende trinnene skal utføres i en biologisk sikkerhet kabinett ved hjelp av steril teknikk.
  5. Skyll dissosiasjon rørene som inneholder lunge og milt homogenater med 5 mL ekstra lunge dissosiasjon medium eller Complete RPMI, henholdsvis.
  6. Filter celle suspensjoner gjennom en 40 μm celle sil og samle inn 50 mL koniske rør.
  7. Ruge lunge homogenater for 15 – 30 min i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 til ytterligere distansere lunge vev.
  8. Tilsett 5 mL komplett RPMI til lunge-og milt homogenater og pellet cellene i bunnen av 50 mL rør ved hjelp av sentrifugering; 378 x g ved romtemperatur (RT) i 5 min.
  9. Kombiner splenocytes og lunge celler til et enkelt 50 mL konisk rør og Bestem total celle telling ved hjelp av den automatiserte celle telleren.
  10. Juster mannlige og kvinnelige celle suspensjoner til 1 x 108 celler/ml i separasjon buffer og legge til en 5 ml polystyren tube.
    Merk: Den berikelse protokollen kan justeres opp til 14 mL polystyren rør når flere celler er ervervet fra milt og lunger. Denne protokollen ble utviklet for vev fra 2 – 3 mus per gruppe; Derfor bør et 5 mL rør være tilstrekkelig.
  11. Bruk omtrent to tredjedeler av de totale cellene for ILC2 isolasjon i henhold til ILC2 berikelse protokollen.
    1. Tilsett antistoff cocktail (50 μL/mL) til celle fjæringen og ruge i 5 min ved RT.
    2. Vortex raske kuler for 30 s og legge til prøven med en hastighet på 75 μL/mL av celle fjæring. Bland forsiktig og ruge i 5 minutter ved RT.
    3. Topp røret opp til 3 mL total volum med separasjon buffer og plass i 8-kammer lett separasjon magnet. Ruge for 3 min ved RT.
    4. Spissen magneten fremover (vekk fra sfæren-antistoff-celle komplekser levd på baksiden av røret) og pipette av cellen suspensjon til en ren 5 mL tube.
    5. Tilsett 1,5 mL komplett RPMI til rørene og sentrifuger på 378 x g i 5 min ved RT.
    6. Hell av Media fra cellen pellet og resuspend den ILC2 ved 1 x 107 celler per ml.
    7. Plasser 100 uL av mannlige og kvinnelige ILC2 per brønn i en U-bunn, 96-brønn plate og tilsett 100 μL av ILC2 Expansion Media til hver brønn.
    8. Ruge cellene for 4 – 5 dager for å utvide ILC2.
    9. Samle ILC2 i et 5 mL rør og tilsett opptil 4,5 mL serum fri RPMI. Sentrifuger cellene på 378 x g i 5 min ved RT.
    10. Tell celler ved hjelp av en hemacytometer og resuspend ved 1 x 107 ILC2 per ml i serum fri RPMI.
  12. Bruk de resterende cellene for CD4+ t celle isolasjon prosedyre, som er utført i henhold til musen CD4+ t celle isolasjon protokollen med få modifikasjoner.
    1. Tilsett rotte serum (50 μL/mL) til CD4 T celle berikelse suspensjon.
    2. Legg isolasjon cocktail (50 μL/mL) til prøven og ruge i 10 min ved RT.
    3. Vortex raske kuler for 30 s og legge til prøven med en hastighet på 75 μL/mL.
    4. Bland forsiktig celle fjæringen og ruge for 2,5 min og RT
    5. Topp prøvene opp til 3 mL og plasser 5 mL rør inn i 8-kammer lett separasjon magnet og ruge i 5 min ved RT.
    6. Tips magneten forover og Pipetter celle fjæringen til et rent 5 mL rør.
    7. Tilsett 1,5 mL serum fri RPMI til rørene og sentrifuger på 378 x g i 5 min ved RT.
    8. Hell av Media fra cellen pellet og resuspend på CD4+ T celler ved 1 x 107 celler per ml i serum fri RPMI.

4. Bestem CCR4 uttrykk på CD4+ T celler og gruppe 2 medfødte lymfoide Cells (ILC2) fra OVA-utfordret dyr av Flow flowcytometri

Merk: Følgende trinn kan utføres på en åpen benkeplate som de er ikke-sterile teknikker.

  1. Tilegne seg ca 1-2,5 x 105 ILC2 celler fra trinn 3.11.10 og 1-2.5 x 106 CD4+ T celler fra trinn 3.12.8 i separate 5 ml rør.
    1. Hold en ekstra tube på minst 5,0 x 104 CD4 + T celler som en unstained kontroll.
  2. Suspendere cellene i 100-200 μL av FACS buffer og tilsett 1 μL av FC Block til hvert rør, deretter ruge på is (eller i et 4 ° c kjøleskap) i 10 min.
  3. Tilsett 1 – 2 mL FACS buffer til hvert rør og sentrifuge ved 378 x g i 5 min ved RT.
  4. Hell av supernatanten og resuspend cellene i 100 – 200 μL av FACS buffer.
  5. Tilsett 37,5 μL av CCR4 antistoff farging cocktail til cellen suspensjon i hvert rør unntatt røret inneholder ' unstained ' celler.
  6. Ruge rørene på is, eller i et kjøleskap på 4 ° c, i 20 – 30 min.
  7. Tilsett 1 – 2 mL FACS buffer til hvert rør og sentrifuge ved 378 x g i 5 min ved RT.
  8. Hell av supernatanten.
  9. Gjenta trinn 4,7 og 4,8.
  10. Tilsett 250 – 300 μL av 1x stabiliserende bindemiddel (se tabell over materialer) til hvert rør.
  11. Forbered enkelt fargede perle kontroller for hvert antistoff i CCR4 antistoff-cocktail i henhold til protokollen som følger med kompensasjons perlene.
    1. Vortex kompensasjonen perler.
    2. Legg en dråpe perler til hver enkelt farget kontroll rør.
    3. Tilsett 1 μL av hvert antistoff i CCR4 antistoff-cocktail med et eget merket rør.
    4. Bland og ruge forsiktig i 10 minutter i et kjøleskap på 4 ° c eller på is.
    5. Tilsett 1 – 2 mL FACS buffer til alle rørene og sentrifuger på 378 x g i 5 min ved RT.
    6. Hell av supernatanten og resuspend perlene i 200 μL av FACS buffer.
    7. Kjøle den single-fargede kontroller til alle prøvene er beiset og klar til å bli analysert på flyten flowcytometer.
  12. Analysere unstained celler, Single-fargede kontroller og eksperimentelle prøver på flyten flowcytometer innen 24 h av fiksering.

5. ex vivo Transmigration prosedyre

Merk: Følgende trinn bør utføres i en biologisk sikkerhet kabinett, som de krever steril teknikk.

  1. Tilegne seg ILC2 fra trinn 3.11.10 og CD4 T-celler fra trinn 3.12.8 og bestemme antall transwell innsatser som trengs for eksperimentet.
    Merk: Eksempel: for 1,2 mL beriket CD4 T-celler fra trinn 3.12.8, Multipliser 1,2 x 1 000 μL = 1 200 μL; deretter dele 1 200 uL med 100 μL = 12, antall innsatser som trengs for CD4 T-Transmigration.
  2. Beveg forsiktig de 3 μm transwell inn fra de midterste radene av en 24-brønn plate.
  3. Tilsett 500 μL av overføringsmedier med CCL17 til ca. en tredjedel av brønnene.
  4. Tilsett 500 μL av overføringsmedier med CCL22 til en tredjedel av brønnene.
  5. Tilsett 500 μL av serum fri RPMI som ikke inneholder noen chemokine til den siste en tredjedel av brønnene.
  6. Tydelig merke lokket på tallerkenen med riktig Transmigration medium plassert i bunnen brønner.
  7. Plasser transwell setter inn igjen i brønnene som inneholder de ulike behandlingene.
  8. Forsiktig legge til 100 μL av CD4 T-celler eller ILC2 til toppen godt av hver innsats. Ikke bland eller Pipetter celle fjæringen opp og ned i transwells, da dette kan forvirre resultatene av eksperimentet.
  9. Tydelig merke lokket på tallerkenen med cellen type plassert i hver brønn og skrive dato og klokkeslett på dagen at cellene ble lagt.
  10. Gjenta trinn 5,2 til 5,9 til alle cellene er plassert i transwell innsettinger med medier.
  11. Plasser platen forsiktig i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 for 48 h. Minimer kontakten med platen over inkubasjonsperioden.

6. kvantifisering av ex vivo Transmigration

  1. Fjern forsiktig platen fra inkubator og fjerne alle transwell inserts fra midten rader i tomme brønner like over eller under.
  2. Samle cellene fra bunnen og toppen brønner av transwell setter inn rør merket med topp eller bunn, med CCL17, CCL22, eller Media, med celle type, og med replikere nummer (minst 3 replikerer per eksperiment).
  3. Skyll de nederste brønnene med 500 μL av 1x PBS og samle denne skylle i tilsvarende rør.
  4. Skyll de øverste brønnene med 250 μL av 1x PBS og samle denne skylle i tilsvarende rør.
  5. Pellet cellene ved sentrifugering ved 378 x g for 5 min på RT.
  6. Pipetter forsiktig av alle supernatanten fra celle pellet.
  7. Resuspend T-celler og ILC2 til 50 μL av 1x PBS.
  8. Ta 10 μL av celle suspensjonen og tilsett til 90 μL av 0,4% trypan blå.
  9. Tell cellene på den automatiserte celle telleren.
    1. Record% levedyktighet.
    2. Noter celle tellingen per mL for hver prøve.
    3. Bestem det totale antall celler per behandling i toppen og bunnen kammer; registrere celle tellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CCR4 uttrykk på CD4 + T celler og ILC2.

For suksessen av ex vivo Transmigration eksperimentet, er det viktig å avgjøre om lymfocytter er mottakelig for CCL17 og CCL22 gjennom CCR4; Derfor har vi bestemt CCR4 uttrykk på både CD4+ T celler og ILC2 av Flow flowcytometri. Mens det er velkjent at OVA-spesifikke CD4+ Helper T-celler uttrykke CCR4, mindre er kjent av UTTRYKKET av CCR4 på ILC2. Figur 1 viser representative resultater av CCR4 uttrykk, relativt, på CD4+ T celler (figur 1A, C) og ILC2 (figur 1B, D) fra mannlige og kvinnelige, OVA-utfordret BALB/C mus. Flow-flowcytometri ble brukt til å detektere CCR4 ved hjelp av et monoklonale antistoff som ble bøyd til allofykocyanin (APC). Ved hjelp av enveis analyse av varians (ANOVA), fant vi ut at det var ingen forskjeller i CCR4 uttrykk mellom mannlige og kvinnelige verter (figur 1A-D), men uttrykket av CCR4 på en per celle basis (MFI) på ILC2 var høyere i forhold til CD4 + T-celler (figur 1C sammenlignet med figur 1d). Disse resultatene er viktige i å vise at ILC2 og CD4+ T-celler skal REAGERE på CCL17 og CCL22 i følgende eksperiment.

Respons av CD4+ T celler til CCR4 ligander i toppen og bunnen kamre av et Transmigration system.

CD4+ T celler fra HANN, OVA-utfordret BALB/c mus ble isolert fra lungene og spleens og plassert i øverste kammeret i et Transmigration apparat atskilt med en 3 μM porøs membran (figur 2). En oppsummering av in vivo utarbeidelse av OVA-behandlede mus (figur 2a) og Transmigration prosedyren (figur 2b) vises som referanse. En kombinasjon av CCL17 (25 ng/mL) og CCL22 (25 ng/mL) ble plassert i øverste kammer, bunnen kammer eller både toppen og bunnen kamre for å bekrefte (figur 2C), (1) at CD4+ T celler fra OVA-utfordret dyrene var mottakelig for CCR4 ligander, og (2) at chemokine migrasjon var en aktiv prosess der T celler beveget seg gjennom porene som svar på chemokine gradient, og at lymfocytter ikke var beveger seg gjennom porene uavhengig av chemokine. En Media (no chemokine) kontroll ble inkludert for å vise at CD4+ T celler kunne ikke migrere gjennom 3 μM porene uten stimulering. I denne tilstanden forble den høyeste prosentandelen av celler i øverste kammeret. Når chemokiner ble plassert i toppen og bunnen kammer samtidig, oppdaget vi 52% av den totale T-celler i bunnen kammer og 48% av cellene i øverste kammeret (topp/bunn behandling). Som forventet, flyttet fordelingen av celler som svar på chemokine plassert bare i toppen eller bare i bunnen kammer, som vi oppdaget den høyeste prosentandelen av celler i rommet der chemokine var tilstede.

Respons av CD4+ T celler og ILC2 til CCL17 og CCL22 i et ex vivo Transmigration apparat.

CD4 T-celler og ILC2 fra mannlige og kvinnelige, OVA-utfordret mus ble isolert fra lungene og spleens deretter plassert i øverste kammeret i en transwell Transmigration apparat (Figur 3). Den nederste kammer av apparatet var fylt med ubehandlet cellekultur medier, medier som inneholder CCL17, eller medier som inneholder CCL22. Representative resultatene viser at mindre enn 14% (13,37 + 6,5%) av cellene som ble migrert i mediekontroll tilstander (Figur 3A – D). Som svar på CCL22, begge celletyper, uavhengig av om de var fra mannlige eller kvinnelige verter, svarte på CCL22 (Figur 3A-D), men resultatene for CCL17 var mindre konsekvente. CCL17 bare indusert betydelig migrasjon for kvinnelige CD4 T-celler og ILC2 i forhold til Media alene (Figur 3C, D). CCL17 behandling var ikke annerledes enn Media for mannlige CD4+ T celler eller mannlig ILC2 (Figur 3A, B), og CCL22 indusert større migrasjon enn CCL17 i mannlige ILC2 (figur 2b).

Suboptimal Transmigration resultater for CD4+ T celler med lav levedyktighet.

Suboptimal resultatene ble generert for å gi forskeren et eksempel på hva du kan forvente når Transmigration eksperimentet ikke fungerer (Figur 4). Vi isolerte mannlige CD4+ T celler fra dyr i henhold til denne protokollen og plassert dem i toppen godt av Transmigration system. Etter CD4+ T celler ble lagt, men platen forble ved romtemperatur for de første 24 h, da platen ble flyttet inn i inkubator for de resterende 24 h av inkubasjonsperioden. Ikke overraskende, fant vi ingen migrasjon mot CCL17 og CCL22 (figur 4a) og levedyktigheten av cellene var spesielt lav (< 15%) for cellene i toppen (figur 4b). Disse feilaktige resultatene fremhever viktigheten av å bruke riktige temperaturer og forhold som er beskrevet i denne protokollen, for å oppnå optimale resultater.

Figure 1
Figur 1: CCR4 uttrykk på CD4+ T celler og ILC2. 7 til 9 uke gammel, mann og kvinne, BALB/c mus ble injisert en gang med 100 μL av OVA-adsorberes til aluminiumsfolie (500 μg/ml; OVA og 20 mg/mL aluminium natriumhydroksid) 7 dager før den første av 5, repeterende, daglige luftveier utfordringer med 1,5% OVA i saltvann. Allergen-utfordret dyr ble humant euthanized, og lunge og milt vev ble samlet for ILC2 og CD4+ T Cells Isolation. En liten alikvot av celler ble deretter farget og analysert av Flow flowcytometri å bestemme nivået av CCR4 på hver celle type. (A) HYPPIGHETEN av CD4+ T celler som er CCR4+ fra OVA + mus, der feilen barer representerer standard feil av gjennomsnittet (+ SEM). (B) HYPPIGHETEN av ILC2 som var CCR4+ (+ SEM). (C, D) Mean fluorescens intensitet (+ SEM) av CCR4 på (C) CD4 + T celler og (D) ILC2. Totalt 13 mus ble brukt til å generere disse dataene, og Flow eksperimentet ble gjentatt to ganger, med 3 replikerer av hver behandling per eksperiment. Betydning ble bestemt av enveis ANOVA; n.d. indikerer at det ikke var noen forskjeller mellom gruppene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: respons av CD4+ T celler å CCR4 ligander i toppen og bunnen kamre av et Transmigration system. MANNLIGE BALB/c mus sensibilisert og utfordret med kylling egg ovalbumin (OVA) og CD4 + T celler ble isolert fra spleens og lunger (A, B). For denne Transmigration eksperimentet, CD4+ T celler ble suspendert i serum-frie medier på 1 x 107 celler/ml. CCL17 og CCL22 ble tilsatt serum frie medier ved en konsentrasjon på 50 ng/mL (25 ng/mL av hver chemokine for å oppnå totalt 50 ng/mL). Chemokine medier ble lagt til toppen kammer bare, til bunnen kammeret bare, eller til både toppen og bunnen kamre. Et samlet volum på 500 μL av Transmigration medier ble tilsatt til bunn brønnene og 100 μL av cellulær fjæring (1 x 106 celler/brønn) ble lagt til toppen godt. Transmigration ble målt etter 48 h i kultur (C). Disse dataene ble generert fra et enkelt eksperiment, 3 OVA-behandlet, mannlige mus ble brukt til vev samling, og 3 replikerer ble gjort per behandling. Statistisk betydning ble bestemt av enveis ANOVA; *p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: respons av CD4 + T-celler og ILC2 til CCL17 og CCL22 i en ex vivo Transmigration-apparat. Mus var forberedt som i figur 1 for CD4+ T celle og ILC2 isolert fra spleens og lunger. CD4+ T celler og ILC2 ble suspendert i serum-frie medier ved 1 x 107 celler/ml. CCL17 eller CCL22 ble tilsatt serum frie medier ved en konsentrasjon på 50 ng/mL. 500 μL av Transmigration medier ble tilsatt til bunn brønnene og 100 μL av cellulær fjæring (1 x 106 celler/brønn) ble lagt til toppen godt. Transmigration ble målt etter 48 timer i kultur. (A) CD4+ T celler og (B) ILC2 fra mannlige verter ble behandlet med Media som kontroll, CCL17, eller CCL22. Tilsvarende (C) kvinnelige CD4+ T celler og (D) kvinnelige ILC2 ble behandlet med Media, CCL17, eller CCL22. Totalt 14 mus ble brukt til å generere disse dataene. Det Transmigration eksperimentet ble gjentatt 4 ganger, med 3 – 6 replikerer av hver behandling per eksperiment. Betydning ble bestemt av enveis ANOVA; *p < 0,05, * * *p < 0,001, * * * *p < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: suboptimal Transmigration resultater for CD4 T-celler med lav levedyktighet. Naive mannlige BALB/c mus ble kjøpt for lunge og milt vev samling og CD4+ T celle isolasjon som i figur 1, figur 2, og Figur 3. CD4 T-celler ble lagt til toppen kammeret av Transmigration apparater og serum-frie medier som inneholder CCL17, CCL22 eller ingen chemokine (Media kontroll) ble lagt til bunnen godt. For første 24 h av eksperimentet platen ble forlatt ved romtemperatur, så ble det flyttet til en 37 ° c inkubator med 5% CO2 for ytterligere 24 h. (a) prosentandel av cellene igjen i øvre og nedre brønner etter 24 h. (B) levedyktigheten til C D4 + T celler i øverste og nederste kammer etter dårlige inkubasjons forhold. Disse dataene ble generert fra et enkelt eksperiment, 3 naive mannlige mus ble brukt til vev samling, og 3 replikerer ble gjort per behandling. Statistisk betydning ble ikke fastslått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri presenterer vi en veletablert metode for vurdering av chemokine-indusert migrering av lymfocytter i et ex vivo Transmigration-system. Det er flere kritiske trinn i protokollen, hvorav den første er å verifisere uttrykket av riktig chemokine reseptor på immunceller i eksperimentet. I våre hender, valgte vi CCR4 grunn av kroppen av litteraturen som fremhever viktigheten av CCR4 på Th2 Helper T-celler i allergisk betennelse. Ovalbumin-indusert betennelse ble vist tidligere å være begrenset av minst to CCR4 motstandere24,25; men dette var før oppdagelsen av gruppen 2 medfødte lymfoide celler (ILC2)26,27. Vi genererte romanen data som viser at ILC2 celler uttrykker høyere CCR4 enn CD4+ T celler og viste at disse cellene var konsekvent RESPONSIVE til CCL22.

En annen kritisk skritt å følge i protokollen er å sikre at cellene holdes i optimal medium for kultur før begynnelsen den Transmigration delen av protokollen. I tilfelle av ILC2, måtte vi kultur disse cellene i ILC2 Expansion Media som inneholder både IL-2 og IL-33. Il-2 og Il-7 er begge rapportert i litteraturen for å støtte ILC2 i kultur i opptil 14 dager28,29. Hvis levedyktighet blir et problem for CD4+ T celler og ILC2 i fremtidige eksperimenter, tillegg av Il-2 eller Il-7 vil trolig forbedre overlevelse av lymfocytter til endepunktet av eksperimentet. Hver av mediene som presenteres her, ble definert i løpet av flere eksperimenter og ble optimalisert for bruk i denne protokollen14,30,31. I Figur 4, presenterte vi feil resultater å demonstrere viktigheten av å bruke en inkubator med riktig temperatur og 5% co2. Holde Transmigration platene i inkubator der de ikke vil bli forstyrret er et kritisk skritt for å lykkes med protokollen.

Som nevnt tidligere, er det fordeler ved å bruke in vivo-mikroskopi som er tilgjengelig på de fleste institusjoner, men in vivo Imaging kan være tidkrevende og kostbart. En alternativ eksperimentell prosedyre som er mindre kostbare bruker materialer i kombinasjon med chemokine graderinger å forstå leukocytter Ekstravasasjon og vev migrasjon32,33,34. Disse systemene holder vitenskapelig verdi fordi de vurderer kompleksiteten i celle Kinetics som involverer endothelial celler, som kan dyrkes på blodkar av mikrovæskebasert systemer. Videre disse mikrovæskebasert systemer vurdere viktigheten av tiltakene proteiner (f. eks E-cadherin) på endothelial celler og integrins på immunceller i ferd med celle overholdelse under blodstrøm. Likevel disse systemene krever spesialisert utstyr og komplekse beregningsorientert programmering og statistikk for å fastslå viktigheten av hver behandling forhold. Derfor, selv om begrensningen av Transmigration metoden som presenteres her er at det er kunstig i naturen, kan den brukes som et viktig screening verktøy for å begrense sløsing med unødvendige reagenser i etterfølgende in vivo metoder. Betydningen av metoden er at når nye celler blir oppdaget, slik tilfellet er for ILC2, kan vi skjermen disse cellene for deres respons til kjente chemokiner. Dette er en av de fremtidige programmer som involverer ILC2 og potensielle terapier som kan hemme deres migrasjon inn i lungene under astma forverring. Denne Transmigration protokollen vil bli brukt til skjermen ulike hemmere som kan brukes til å begrense CCR4 eller andre chemotactic meglere involvert i rekruttering ILC2. I alt vil denne ex vivo Transmigration-protokollen føre til generering av kritiske data som kan verifiseres med fremtidige in vivo-eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske avsløringer eller interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av American Lung Association (K.J.W.), Memorial Eugene Kenney fondet tildelt T.A.W. og K.J.W., sjenerøs oppstart støtte fra University of Utah for K.J.W., og en Department of Veterans Affairs prisen til T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. er mottaker av en forskerkarriere forsker Award (IK6 BX003781) fra Department of Veterans Affairs. Forfatterne ønsker å anerkjenne redaksjonell bistand fra MS Lisa Chudomelka. Forfatterne takker UNMC Flow flowcytometri kjerne for deres støtte i å samle inn flyten flowcytometri data generert for dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon CCL17 (C-C Motif chemokine 17)/TARC (thymus og aktivisering relaterte chemokine) CCL22 (C-C Motif chemokine 22)/MDC (macrophage-avledet chemokine) CCR4 (CC chemokine reseptor 4) CD4 T-celle (CD4 + T hjelper Cell)/Th2 celle ILC2: (gruppe 2 medfødt lymfoide Cell) OVA (kylling egg ovalbumin)
Vurdering av overføring av lymfocytter i et ex vivo Transmigration system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter