حجب الأجسام المضادة المستهدفة بواسطة متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وFc-III Mimetics (DCAF)
Summary
تطوير متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وfc-III mimetics (DCAF) هو رواية للقضاء على الأجسام المضادة الضارة. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتركيب جزيء DCAF1، والتي يمكن أن تمنع بشكل انتقائي 4G2 الأجسام المضادة للقضاء على تأثير تعزيز الأجسام المضادة تعتمد خلال عدوى فيروس حمى الضنك.
Abstract
القضاء على الأجسام المضادة الضارة من الكائنات الحية هو نهج قيم لتدخل الأمراض المرتبطة بالأجسام المضادة، مثل حمى الضنك النزفية وأمراض المناعة الذاتية. منذ الآلاف من الأجسام المضادة مع النعوت مختلفة تنتشر في الدم، أي طريقة عالمية، باستثناء conjugate مزدوجة وظيفية من الببتيد المضادة للجينات وfc-III mimetics (DCAF)، وذكر لاستهداف الأجسام المضادة الضارة محددة. تطوير جزيئات DCAF يساهم بشكل كبير في تقدم العلاج المستهدف، والتي ثبت للقضاء على تأثير تعزيز تعتمد على الأجسام المضادة (ADE) في نموذج عدوى فيروس حمى الضنك (DENV) وتعزيز أستيل نشاط مستقبلات في نموذج الوهن العضلي الوبيل. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتركيب جزيء DCAF (DCAF1)، الذي يمكن أن يمنع بشكل انتقائي الأجسام المضادة 4G2 للتخفيف من تأثير ADE أثناء عدوى فيروس حمى الضنك، ويوضح ربط DCAF1 إلى 4G2 الأجسام المضادة عن طريق فحص ELISA. في طريقتنا، يتم تصنيع DCAF1 عن طريق اقتران مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III ومؤتلف أعرب طويل α-اللولب مع تسلسل مضاد للجينات من خلال الربط الكيميائي الأصلي (NCL). وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة 1 وكذلك على جزيئات أخرى من قوات جنيف للرقابة على الأجسام المضادة.
Introduction
الأجسام المضادة تلعب أدوارا هامة في الاستجابة المناعية الفكاهية لتحييد البكتيريا المسببة للأمراض والفيروسات1. ومع ذلك، فإن بعض الأجسام المضادة تظهر آثار ضارة على الكائنات الحية، مثل الأجسام المضادة عبر رد الفعل في تأثير ADE أثناء عدوى DENV والأجسام المضادة المفرطة في رد الفعل في الوهن العضلي الوبيل، وهو أمراض المناعة الذاتية2،3. يتم التوسط تأثير ADE من قبل الأجسام المضادة عبر رد الفعل التي تجعل الجسر لربط DENV ومستقبلات Fc تقديم الخلايا4,5, في حين أن الوهن العضلي الوبيل هو سبب الأجسام المضادة المفرطة التي تهاجم مستقبلات أستيل بين تقاطعات الخلايا في أنسجة العضلات6،7. على الرغم من أنه تم وضع نُهج فعالة جزئياً لعلاج هذه الأمراض8و9،فإن القضاء المباشر على هذه الأجسام المضادة الضارة من شأنه أن يحرز تقدماً في التدخلات.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير جزيئات DCAF، التي لديها مجموعات مزدوجة الوظائف، لحجب الأجسام المضادة المستهدفة10. DCAF هو الببتيد الطويل الذي يتكون من 3 أجزاء: 1) جزء مستضد التي يمكن أن تعترف محددة الأجسام المضادة كونيات، 2) علامة Fc-III أو Fc-III-4C لربط بقوة إلى منطقة Fc من الأجسام المضادة لمنع مستقبلات Fc أو تكملة البروتينات المكون ، 3) وصلة طويلة α-حلزونية التي تترافق بين هاتين المجموعتين الوظيفيتين10. تم تحسين جزء الرابط، الذي تم تصميمه من مجال Moesin FERM، من قبل برنامج Rosseta لضمان الجزء مستضد وجزء Fc-III في جزيء DCAF يمكن ربط إلى مناطق Fab وFc من IgG في وقت واحد. وقد تم تصنيع أربعة جزيئات من قوات جنيف للرقابة الديمقراطية على الرقابة على المواد النارية لاستهداف 4 أجسام مضادة مختلفة، من بينها استخدام DCAF1 للقضاء على الأجسام المضادة 4G2، وهو جسم مضاد عبر رد الفعل أثناء عدوى DENV للمساهمة في تأثير ADE. وتم تصميم DACF4 لإنقاذ مستقبلات أستيل عن طريق منع ماب35 الأجسام المضادة في الوهن العضلي الوبيل10.
في هذه الدراسة، التي أخذت DCAF1 على سبيل المثال، أظهرنا بروتوكولات لتركيب جزيء DCAF والكشف عن التفاعل بين مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة وجسمه المضاد للكونيات. وDCAF1 هو شبه توليفها من قبل نهج NCL11،12،13،14، الذي يترافق مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III وأجزاء مستضد الرابط أعرب معا. وللنهج الذي تتبعه اللجنة مزايا كبيرة على التركيب الكيميائي الكامل والتعبير المؤتلف بالكامل لتوليف مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على الفي مكاف، لأن هاتين الطريقتين تؤديان إلى انخفاض الغلة وارتفاع التكلفة. النهج الحالي ليس فقط الطريقة الأكثر فعالية من حيث التكلفة للحصول على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة، ولكن أيضا يمكن الحفاظ على مطابقة جزء الرابط مماثلة لشكله الأصلي. وبما أن جزيئات مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة المختلفة لها تسلسلات مماثلة باستثناء أجزاء المستضد، فإن أساليبنا لتوليف DCAF1 والفحص التفاعلي بين DCAF1 و4G2 يمكن تطبيقها على جزيئات DCAF الأخرى لمنع أجسامها المضادة من الكونات أيضاً.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول هنا شبه التوليف والكشف عن DCAF1 باستخدام نهج NCL، والذي يظهر في الشكل 1. وباختصار، فإن جزتي اللجنة الثانية للقوات المسلحة هي أجزاء كيميائية مركبة ومعبر عنها بصورة مُدمجة، على التوالي؛ ثم، يتم تجميع جزيء DCAF1 طول كامل، وتعديلها وتنقيتها. بالنسبة لتوليف جزء Fc-III الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جزئيا مؤسسة جامعة تسينغهوا – غيتس (لا. OPP1021992)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 21502103 و 21877068 و041301475)، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
