抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断
Summary
抗原ペプチドおよびFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートの開発は、有害な抗体の排除のために新規である。ここでは、デングウイルス感染時に抗体依存性増強効果を排除するために4G2抗体を選択的にブロックできるDCAF1分子の合成に関する詳細なプロトコルについて説明する。
Abstract
生物からの有害な抗体の除去は、デング熱や自己免疫疾患などの抗体関連疾患の介入のための貴重なアプローチです。異なるエピトープを持つ何千もの抗体が血液中を循環しているため、抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートを除いて、特異的な有害抗体を標的とする普遍的な方法は報告されなかった。DCAF分子の開発は、デングウイルス(DENV)感染モデルにおける抗体依存性増強(ADE)効果を排除し、アセチルコリンを高めることが実証された標的治療の進行に大きく寄与する。重症筋症モデルにおける受容体活性。ここでは、デングウイルス感染時にADE効果を減衰させるために4G2抗体を選択的に遮断できるDCAF分子(DCAF1)の合成に関するプロトコルを説明し、ELISAアッセイによるDCAF1~4G2抗体の結合を例示する。我々の方法では、DCAF1は、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と、天然化学ライゲーション(NCL)を介して抗原配列を有する長いαらせんを発現した組換えによって合成される。このプロトコルは、そのコグネイト抗体を標的とする他のDCAF分子と同様に、DCAF1にも適用されています。
Introduction
抗体は、病原性細菌およびウイルス1の中和のための体液性免疫応答において重要な役割を果たす。しかしながら、一部の抗体は、DENV感染時のADE効果における交差反応性抗体や、自己免疫疾患である重症筋無力症における過剰反応抗体など、生物に有害な影響を示す。ADE効果は、DENVとFc受容体提示細胞4、5を接続するためのブリッジを作るクロス反応性抗体によって媒介され、重症筋無力症はアセチルコリン受容体を攻撃する過剰な抗体によって引き起こされる筋肉組織6、7の細胞接合部間。これらの疾患を治療するために部分的に有効なアプローチが開発されているが、これらの有害な抗体の直接的な排除は間違いなく介入のために進歩するだろう。
近年、二重機能基を有するDCAF分子は、標的抗体ブロッキング10用に開発されている。DCAFは、3つの部分からなる長いペプチドです:1)コグネート抗体を特異的に認識できる抗原部、2)Fc-IIIまたはFc-III-4Cタグを抗体のFc領域に強く結合してFc受容体または補体成分タンパク質を阻害する、3)これら2つの機能基10を結合する長いαヘリカルリンカー。Moesin FERMドメインから設計されたリンカー部分は、DCAF分子の抗原部分とFc-III部分が同時にIgGのFabおよびFc領域に結合できることを保証するためにロセタソフトウェアによって最適化されました。4つのDCAF分子を4種類の抗体を標的に合成し、その中でもDCAF1を用いて4G2抗体を排除し、DENV感染時の交差反応抗体であるADE効果に寄与した。そしてDACF4は、重症筋症10におけるmab35抗体を遮断することによってアセチルコリン受容体の救助のために設計された。
本研究では、DCAF1を例にとり、DCAF分子の合成及びDCAFとその歯車抗体との相互作用の検出のためのプロトコルを示した。DCAF1は、NCLアプローチ11、12、13、14によって半合成され、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と発現リンカー抗原部分を一緒に結合する。NCLアプローチは、これらの方法の両方が低収率と高コストにつながるので、DCAF1合成のための完全な化学合成と完全に組換え発現よりも大きな利点があります。現在のアプローチは、フルレングス DCAF を取得する最も費用対効果の高い方法であるだけでなく、リンカー部分のコンフォメーションをネイティブフォームと同様に維持することもできます。異なるDCAF分子は抗原部分を除いて類似した配列を有するので、DCAF1合成とDCAF1と4G2抗体間の相互作用アッセイの方法は、他のDCAF分子に適用して、その歯車抗体を標的ブロックすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでのプロトコルは、図 1 に示す NCL アプローチを使用して DCAF1 の半合成と検出について説明します。簡単に言えば、DCAF1の2つの断片は、それぞれ化学的に合成され、組換え的に発現される。その後、全長DCAF1分子が組み立てられ、修飾され、精製される。ヒドラジン由来Fc-IIIフラグメント合成の場合、高容量はヒドラジン生成に悪影響を及ぼし、製品の収率が低く?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は清華大学ゲイツ財団の一部で支援されました(いいえ。OPP1021992)、中国国家自然科学財団(No.21502103、21877068および041301475)、および中国国家主要研究開発プログラム(No. 2017YFA0505103)。
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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