Summary
抗原ペプチドおよびFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートの開発は、有害な抗体の排除のために新規である。ここでは、デングウイルス感染時に抗体依存性増強効果を排除するために4G2抗体を選択的にブロックできるDCAF1分子の合成に関する詳細なプロトコルについて説明する。
Abstract
生物からの有害な抗体の除去は、デング熱や自己免疫疾患などの抗体関連疾患の介入のための貴重なアプローチです。異なるエピトープを持つ何千もの抗体が血液中を循環しているため、抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートを除いて、特異的な有害抗体を標的とする普遍的な方法は報告されなかった。DCAF分子の開発は、デングウイルス(DENV)感染モデルにおける抗体依存性増強(ADE)効果を排除し、アセチルコリンを高めることが実証された標的治療の進行に大きく寄与する。重症筋症モデルにおける受容体活性。ここでは、デングウイルス感染時にADE効果を減衰させるために4G2抗体を選択的に遮断できるDCAF分子(DCAF1)の合成に関するプロトコルを説明し、ELISAアッセイによるDCAF1~4G2抗体の結合を例示する。我々の方法では、DCAF1は、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と、天然化学ライゲーション(NCL)を介して抗原配列を有する長いαらせんを発現した組換えによって合成される。このプロトコルは、そのコグネイト抗体を標的とする他のDCAF分子と同様に、DCAF1にも適用されています。
Introduction
抗体は、病原性細菌およびウイルス1の中和のための体液性免疫応答において重要な役割を果たす。しかしながら、一部の抗体は、DENV感染時のADE効果における交差反応性抗体や、自己免疫疾患である重症筋無力症における過剰反応抗体など、生物に有害な影響を示す。ADE効果は、DENVとFc受容体提示細胞4、5を接続するためのブリッジを作るクロス反応性抗体によって媒介され、重症筋無力症はアセチルコリン受容体を攻撃する過剰な抗体によって引き起こされる筋肉組織6、7の細胞接合部間。これらの疾患を治療するために部分的に有効なアプローチが開発されているが、これらの有害な抗体の直接的な排除は間違いなく介入のために進歩するだろう。
近年、二重機能基を有するDCAF分子は、標的抗体ブロッキング10用に開発されている。DCAFは、3つの部分からなる長いペプチドです:1)コグネート抗体を特異的に認識できる抗原部、2)Fc-IIIまたはFc-III-4Cタグを抗体のFc領域に強く結合してFc受容体または補体成分タンパク質を阻害する、3)これら2つの機能基10を結合する長いαヘリカルリンカー。Moesin FERMドメインから設計されたリンカー部分は、DCAF分子の抗原部分とFc-III部分が同時にIgGのFabおよびFc領域に結合できることを保証するためにロセタソフトウェアによって最適化されました。4つのDCAF分子を4種類の抗体を標的に合成し、その中でもDCAF1を用いて4G2抗体を排除し、DENV感染時の交差反応抗体であるADE効果に寄与した。そしてDACF4は、重症筋症10におけるmab35抗体を遮断することによってアセチルコリン受容体の救助のために設計された。
本研究では、DCAF1を例にとり、DCAF分子の合成及びDCAFとその歯車抗体との相互作用の検出のためのプロトコルを示した。DCAF1は、NCLアプローチ11、12、13、14によって半合成され、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と発現リンカー抗原部分を一緒に結合する。NCLアプローチは、これらの方法の両方が低収率と高コストにつながるので、DCAF1合成のための完全な化学合成と完全に組換え発現よりも大きな利点があります。現在のアプローチは、フルレングス DCAF を取得する最も費用対効果の高い方法であるだけでなく、リンカー部分のコンフォメーションをネイティブフォームと同様に維持することもできます。異なるDCAF分子は抗原部分を除いて類似した配列を有するので、DCAF1合成とDCAF1と4G2抗体間の相互作用アッセイの方法は、他のDCAF分子に適用して、その歯車抗体を標的ブロックすることができます。
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Protocol
1. Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体の化学合成
- 2-Cl-(Trt)-Cl樹脂を2-Cl-(Trt)-NHNH2樹脂に変換
- 2-Cl-(Trt)-Cl樹脂(0.25 mmol)の625mgを25mLペプチド合成容器に計量する。
- N、N-ジメチルホルミド(DMF)の5 mLを容器の上部から樹脂に加え、キャップを戻し、15sのために静かに振ってから排水します。DMF洗浄をもう2回繰り返します。
- 容器にジクロロメタン(DCM)の5 mLを追加し、キャップを戻し、15sのために穏やかに容器を振り、それを排水します。DCM洗浄をもう2回繰り返します。
- ステップ 1.1.2 を 3 回繰り返します。
- 50%(vol/vol)DMF/DCMの6 mLを使用して樹脂を30分間膨らみ、その後排水します。
- DMFで6 mL 5%(vol/vol)NH2NH2を反応容器に移し、混合物を120rpm、30°Cで30分間振り、真空ポンプで溶液を排出する。
注:DMFの5.7 mLにヒドラジン水和物の0.3 mLを追加し、5%(vol/vol)NH2NH2を得る。NH2NH2を使用する前に新鮮に準備してください。
注意:ヒドラジン水和物は危険な物質であり、癌を引き起こす可能性があります。ラボコート、手袋、マスクを着用してください。ヒュームフードで実験を行います。 - 容器にDMFの5 mLを追加し、15sのために穏やかにそれを振り、それを排水します。
- ステップ1.1.6を繰り返し、ステップ1.1.2-1.1.4を2回繰り返して樹脂を洗浄します。
- 5%(vol/vol)MeOH/DMFの6mLを容器に加え、10分間ゆっくりと振り、それを排水します。
注:このステップは、樹脂上の反応しない部位が上限を設けられるようにするために非常に重要です。 - 手順1.1.2-1.1.4を繰り返して、樹脂を十分に洗います。
- 樹脂に5mLのDCMを加え、15sで軽く振り、2-Cl-(Trt)-NHNH2樹脂を得るためにそれを排出します。
注:置換が成功すると、樹脂は黄色または薄緑色になります。
- ペプチド伸長
- Fmoc-Ala-OH(934 mg)の1mmolと0.95 mmolの1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b] ピリジニウムヘキサフルオロリン酸3-酸化物(HATU)(360mg)をmMfに添加する
注意: HATU への暴露は、アレルギー反応を引き起こす可能性があります。ラボコート、手袋、マスクを着用してください。 - 溶解溶液にN、N-ジソプロプチラミン(DIEA)(0.36 mL)の2mmolを加え、渦を0.5〜1分間添加する。
注:クリティカルステップ:活性化アミノ酸が、より活性なO型からより活性の低いN形態に時間の経過とともに異性体化するように、活性化は5分以下であるべきである。 - 活性化されたFmoc-Ala-OHを2-Cl-(Trt)-NHNH2樹脂を含む反応容器に加え、ステップ1.1から調製した。120rpm、30°C、一定温度シェーカーで20分間ゆっくりと振り、真空ポンプで溶液を排出します。
- DMFの5 mLを加えて樹脂を洗浄し、15sで軽く振ってから水切りします。
- Fmoc-Ala-OH(934mg)の1mmolおよび2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-yl)-1,1,3-テトラメチルチラミニウムヘキサフッ素リン酸(HCTU)(390mg)を含有する5mLチューブに加える。
注意: HCTUへの暴露は、アレルギー反応を引き起こす可能性があります。ラボコート、手袋、マスクを着用してください。 - 2 mmol の DIEA (0.36 mL) をチューブに加え、0.5~1 分間渦を溶かします。
- 活性ドFmoc-Ala-OHを反応容器に加えます。120rpm、30°C、一定温度シェーカーで40〜60分間ゆっくりと振り、真空ポンプで溶液を排出します。
- 手順 1.1.2-1.1.4 を繰り返して樹脂を洗浄します。
- DMFの20%(vol/vol)ピペリジンの4mLを樹脂に加え、室温で5分間ゆっくりと振り、溶液を排出します。
注意:ピリジンは非常に可燃性と有毒です。ヒュームフードで実験を行います。 - DMFの20%(vol/vol)ピペリジンの4mLを樹脂に加え、室温で15分間ゆっくりと振り、溶液を排出します。
- 手順 1.2.1-1.2.10 に従って、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-His-OH および Fmoc-Ala-OH を組み立て、保護を解除します。手順 1.2.5-1.2.10 を繰り返して、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH および Fmoc-Asp-OH を組み立て、保護を解除します。
- 手順1.1.2-1.1.4を繰り返し、樹脂を十分に洗います。
- ステップ1.1.3を繰り返して樹脂を洗浄し、樹脂を5分間真空乾燥させます。
- Fmoc-Ala-OH(934 mg)の1mmolと0.95 mmolの1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b] ピリジニウムヘキサフルオロリン酸3-酸化物(HATU)(360mg)をmMfに添加する
- ヒドラジン由来Fc-III粗ペプチドの切断
- カクテルトリフルオロ酢酸(TFA)/2'-(エチレンジオキシ)ジエタネチオール(DODT)/トリソプロピルシラン(TIPS)/H2O(92.5/2.5/2.5/2.5)を樹脂に添加し、 そして、200rpmで樹脂からペプチドを切断するために一定温度シェーカーを使用し、37 °C 約2 h. 混合物を50 mL遠心管に濾過します。
- 樹脂に1mLのカクテルを加えて洗浄し、50mL遠心管に濾液を集めます。2回繰り返します。
- ヒュームフードにvaperローターで混合物を2mLに濃縮し、その後、原油ペプチドを沈殿させるためにチューブに予冷化されたジエチルエーテルの20 mLを追加します。
注:無水エーテルは、粗ペプチドの副反応を引き起こす可能性があり、激しい熱放出を避けるために0°Cに予め冷却する必要があります。 - ペプチド沈殿を-20°Cで1-2hでインキュベートします。
- 遠心分離機 5,000 x g,4 °C 10 分間、遠心管から溶媒を慎重に取り除きます。
- 予熱したジエチルエーテルの20 mLを1.3.3-1.3.5のステップに従ってチューブに2回加え、沈殿物を洗浄します。ペプチド製品をウォッチグラスで約15分間空気乾燥し、乾燥した粗ペプチドを4°Cで保存し、さらなる分析を行います。
- Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体の精製
- 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを使用して、ペプチドを30分の勾配溶出液(0-1分、5%B、1-20分、50%B、20-25分、85%B;25-30分、85%B)の流量で1mL/mの流量で精製します。
注:カラムはC-18樹脂を詰めた4.6mmのID、250のmmの長さである。移動相Aは水中で0.1%TFA、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%TFAで構成された。
- 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを使用して、ペプチドを30分の勾配溶出液(0-1分、5%B、1-20分、50%B、20-25分、85%B;25-30分、85%B)の流量で1mL/mの流量で精製します。
2. リンカーおよび抗原部品のタンパク質発現と精製
- プラスミド構造
- SUMOリンカー抗原を発現できる遺伝子配列全体を合成する(材料の表を参照)。
- 37°Cの水浴でNcoIとXhoIを用いて、PET-28a空ベクターの10ngと合成SUMOリンカー抗原DNA断片の50ngを3時間カットします。
- DNAゲル抽出キットにより、二重酵素消化ベクターとDNA断片を精製します。
- DNA消化DNA断片の5 μL、消化ベクターの5μL、T4 DNAリゲスの1μL、10倍のリゲスバッファーの2μL、ddH2 Oの7μLを反応管に加え、16°Cで一晩インキュベートします。
- 2.1.4から100μLの有能な細胞(DH5α)にライゲーション積物の10 μLを混合し、30分間氷浴に置き、42°Cの水浴に90sの水浴に入れ、2分間の氷浴に速く移す800 mLを追加します。LB液体培地(抗生物質を含まない)をチューブに振り、1時間180rpmで振り、有能な細胞をカナマイシンLBプレートに塗り、プレートを均等に分散させ、プレートを一晩37°Cインキュベーターに入れます。
- プレートから5つの単一コロニーを選び、37°Cシェーカーを用いて試験管内のLB培地の5mLで細菌を培養する。
- プラスミド抽出キットを使用してステップ2.1.6から採取した細菌からプラスミドを抽出します。
- 遺伝子シーケンシング用のプラスミドを送り、SUMOリンカー抗原融合タンパク質を発現できる陽性コロニーを選択します。ステップ2.1.5に続いて、陽性プラスミドをBL21(DE3)plysSに変換します。
- タンパク質精製
- ステップ2.1.7からカナマイシンを含むLB液体培地の5 mL(50 μg/mL)に変圧体の単一のコロニーを選択します。200 rpm、37 °Cで一晩培養物を振ります。
- 一晩培養物の5mLを有するフラスコにカナマイシン(50μg/mL)を含む予め温められたLB培地の1Lを接種し、激しい揺さぶりを伴って37°Cで成長し、OD600が0.6になるまで成長する。
- イソプロピルβ-D-チオガラクシド(IPTG)を0.4mMの最終濃度に培地に加え、フラスコを20°Cで一晩200rpmで振る。
注:タンパク質誘導のための低温は、含有体形成を避けるために重要ですので、温度が22 °C以下であることを確認してください。 - 細胞を収穫した後、細胞ペレットに50mLのリシスバッファーを追加し、細胞を再中断する。細胞を200Wで5分間2回、超音波3秒、氷上の間隔3秒で2回ライザットします。15,000 x gで4°Cで30分間遠心分離し、上清を回収します。
注:リシスバッファーは、50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、10 mMイミダゾールで構成されています。NaOH を使用して pH 値を 8.0 に調整します。 - 50%Ni-NTAセフォラーゼの2mLを、ライシスバッファーで平衡化し、クリアした上清に加え、4°Cで4°C(ロータリーシェーカー上で200rpm)を振って穏やかに混ぜます。
- リサートとNi-NTAの混合物を底部の出口をキャップしたカラムにロードし、ボトムキャップを取り外し、カラムフロースルーを破棄します。
- 6 mLの洗浄バッファーで3回洗浄し、1.5mLの溶出バッファーで標的タンパク質を3回溶出させる。1つのチューブで溶出物を収集します。
注:洗浄バッファーは50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、30 mMイミダゾールで構成されています。NaOH を使用して pH 値を 8.0 に調整します。溶出バッファーは、50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、250 mMイミダゾールで構成される。NaOH を使用して pH 値を 8.0 に調整します。 - 溶出液を4°Cで50mM PBSの1Lで透析袋に入れ、タンパク質を脱塩する。新しいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を3回交換してください。
- SUMO タグの切断
- 1mg/mLの濃度で小さなユビキチン様修飾子(SUMO)の2mLを加え、SUMOプロテアーゼの1mL(材料表参照)、10倍SUMOプロテアーゼバッファーの1mL、ddH2Oの6mLを加えて反応溶液を調製する。
注:SUMOタグタンパク質濃度は約1mg/mLです。酵素消化後の過度の濃度は、タンパク質の凝固を引き起こす可能性があります。 - 4°Cで12〜16時間混合物をインキュベートします。
- 4°Cで10分間15,000 x gで混合物を遠心分離し、凝集体を廃棄する。50 mM PBSで平衡化した50%Ni-NTAスラリーの0.5mLを10mLクリアした上清に加え、4°Cで4°C(ロータリーシェーカー上の200rpm)を振って穏やかに混ぜます(ロータリーシェーカーで200rpm)。
- リサートとNi-NTAの混合物を、底部の出口をキャップしたカラムにロードします。下のキャップを取り外し、15 mL遠心管に流れを保存します。
注:ヒスタドモ相撲タンパク質は、列に結合しています。NCL反応のためのCysで始まるリンカー抗原部分は、流れの中にあります。 - 4 °Cで10分間15,000 x gで流れを遠心分離し、凝集体を廃棄します。HPLCを用いてリンカー抗原部を25分の勾配溶出(0-1分、5%B、1-3分、15%B;3-20分、45%B、20-21分、85%B;21-25分、85%B)の流量で1m/mの流量で精製する。
注:カラムはC-18樹脂を詰めた4.6mmのID、250のmmの長さである。移動相Aは水中で0.1%TFA、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%TFAで構成された。 - HPLCから精製された製品を収集し、リンカー抗原製品を得るために一晩凍結乾燥します。
- 1mg/mLの濃度で小さなユビキチン様修飾子(SUMO)の2mLを加え、SUMOプロテアーゼの1mL(材料表参照)、10倍SUMOプロテアーゼバッファーの1mL、ddH2Oの6mLを加えて反応溶液を調製する。
3. 天然化学ライゲーションによるDCAF1の組み立て
- Fc-IIIペプチドとリンカー抗原部分を一緒に結合する
- Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体の1.8mg(1μmol)を2mL EPチューブに加え、0.2 M NaH2PO4(pH 3.0)溶液に6M GnHClの0.8mLを加えて渦で溶解させる。
注:0.2 M NaH2PO4(pH 3.0)溶液中の6M GnHClは、HClまたはNaOHでpH値を調整することによって調製される。
注意:NaOHとHClは非常に腐食性があります。ラボコート、手袋、マスクを着用してください。 - 室温で1分間7,200 x gでチューブを遠心分離した後、氷塩浴にチューブを入れ、磁気攪拌を使用して15分間静かに溶液を攪拌します。
- 0.5M NaNO2の40 μLを溶液に加え、ヒドラジン群を酸化する。氷塩浴でさらに15分間溶液を静かに攪拌します。
- 重み付けし、4-メルカプトフェニル酢酸(MPAA)のステップ2.3および13.6mgから調製した精製リンカー抗原部分の11mgを氷塩浴中の反応管に加え、5分間撹拌し、6M NaOHで室温でpH値を6.8〜7.0に調整する。
注:pH値をニュートラルに調整することは、ライゲーション反応を開始するための重要なステップです。 - 12時間後、0.1 Mトリス(2-カルボキシチル)の0.4 mLを反応系に塩酸リン(TCEP)中性溶液(pH7.0)を加え、反応を終了させるために20分間撹拌する。
注:0.1 M TCEP中性溶液(pH 7.0)は、0.2 M NaH2PO 4(pH 3.0)溶液で6M GnHClにTCEPを溶解し、NaOHを使用してpH値を7.0に調整することによって調製される。 - 10分間15,000 x gでチューブを遠心分離し、次いで26分の勾配溶出(0-1分、5%B、1-21分、45%B;21-22分、B22-26分、1m/mで15%)でライゲーション産物を分析し、精製する。ライゲーション反応の期待歩留まりは50%を超える。
注:カラムはC-18樹脂を詰めた4.6mmのID、250のmmの長さである。移動相Aは水中で0.1%TFA、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%TFAで構成された。
- Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体の1.8mg(1μmol)を2mL EPチューブに加え、0.2 M NaH2PO4(pH 3.0)溶液に6M GnHClの0.8mLを加えて渦で溶解させる。
- コンジュゲートの脱硫
- 0.2 M NaH2PO 4 (pH 7.0) 溶液で 6 M GnHCl の 50 μL でステップ 3.1.6 から調製したコンジュゲート (3.4 mg, 0.3 μmol) を溶解します。
- 上記の混合物に1M TCEPの50 μL、tBuSHの10 μLおよび0.1 M VA-044溶液の5μLを加えます。
注:0.1 M VA-044溶液は、0.2 M NaH2PO4(pH 7.0)溶液中の6M GnHClの0.3 mLにVA-044粉末の9.7mgを溶解することによって調製される。VA-044は空気への暴露によって容易に酸化されるので、VA-044の解決は使用前に新たに準備されるべきである。 - 溶液の最終的なpHを6.9に調整し、ソルチオマット37 °Cを約5時間撹拌しながら保ちます。
- チューブを15,000 x gで10分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。26分の勾配溶出(0-1分、20%B、1-21分、45%B;21-22分、85%B、22-26分、85%B)でHPLCを用いてライゲーション積を分析し、精製します。脱硫反応の期待歩留まりは約40%である。
注:カラムはC-18樹脂を詰めた4.6mmのID、250のmmの長さである。移動相Aは水中で0.1%TFA、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%TFAで構成された。
- 最終製品DCAF1を得るためにAcmの除去
- 32 mM AgOAcの200 μLでステップ3.2.4から調製したペプチド(1.35mg、0.11μmol)を溶解し、その後、4時間室温で反応混合物をかき混ぜます。
- ペプチド上の銀チオレートをフリーチオールに変換するために、0.2 M NaH2PO4(pH 7.0)溶液で6M GnHClに1Mジチオスレイトール(DTT)の3 μLを加えます。
- 1分間激しく撹拌した後、10分間15,000 x gでチューブを遠心分離し、不溶性物質を廃棄する。HPLCを用いて最終製品を分析し、1mL/minの流量で26分の勾配溶出(0-1分、20%B、1-21分、45%B、21-22分、85%B、85%B)の流量で分析および精製します。Acm脱保護反応の期待歩留まりは約30%である。
注:カラムはC-18樹脂を詰めた4.6mmのID、250のmmの長さである。移動相Aは水中で0.1%TFA、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%TFAで構成された。 - HPLC精製後、最終製品を一晩凍結乾燥させ、PBS(50mM NaH2PO 4、150mM NaCl、pH 8.0)で粉末を溶解する。チューブを15,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを捨てます。
- 最終製品(ステップ3.4から)およびリンカー抗原部分(ステップ2.3.6から10 μM)の濃度を調整し、1mmのパス長の25°CのCD分光計を使用して、これらの2つの製品の円形二色(CD)スペクトルを260から195nmまで記録します。
注:CDスペクトルは、最終製品におけるαヘリカル構造の量を実証するために用いられるもので、組換え物が1つ表されるものと同様である。
4. 質量分析による製品の検出
- 60分の勾配溶出によって各化学反応から製品を分離(0-8分、2%B; 8-10 分, 5% B; 10-35 分, 30% B; 35-50 分, 50% B; 50-58 分, 80% B; 80% B; 50% B; 2% B; 59-60 分, 2% B) の流量で μL/30.m.高分解能質量分析計と直接インターフェースされるナノHPLCシステム。
注:分析カラムは、C-18樹脂を詰めた75μmのID、150 mmの長さです。移動相Aは水中のギ酸0.1%、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%のギ酸で構成された。 - フルスキャンモードで質量分析計を操作し、m/zの範囲を300~2,000、解像度を60,000に設定します。
- 質量スペクトルデータを開き、各ステップで製品のピークを見つけて、化学反応が正常にプリフォームされたことを確認します。
5. DCAF1と4G2抗体間の相互作用のELISAアッセイ
- 100 μLのコーティングバッファー/ウェルに1pmol抗GST抗体(材料表を参照)で96ウェルマイクロチタープレートをコーティングし、プレートをシールし、シェーカーで一晩4°Cでインキュベートします。
- PBSで1%BSAの200 μLで各ウェルをブロックし、プレートを密封し、シェーカーで1時間室温でインキュベートします。
- 0.05%の十二ーン20でPBSを使用して、各井戸を4回洗います。
- GST融合抗原タンパク質(ブロッキング溶液の100μLで0.05pmol)をウェルに加え、プレートをシールし、室温で2時間インキュベートします。
注:GST融合抗原タンパク質は細菌中で発現し、GSHセファローズによって精製される。 - 手順 5.3 を繰り返してプレートを洗います。
- 1pmol 4G2抗体または1pmol 4G2抗体に加えて他のリガンド:抗原、Fc-IIIまたはDCAF1を直系列量(0.1pmol、1pmol、10pmol、100pmol、1000pmol)を100μLのブロッキング溶液/ウェルに加え、温度でプレートをシールし、2時間をインキュベートする。
- 手順 5.3 を繰り返してプレートを洗います。
- 抗マウスIgG、HRP連結抗体(1:20,000希釈)を100μLのブロッキング溶液/ウェルに加え、プレートをシールし、シェーカーの室温で30分インキュベートします。
- 0.05%の十二ーン20でPBSを使用して、各井戸を6回洗います。
- TMB試薬AとB 1:1を使用直前に体積に混ぜ、100 μL/ウェルを加え、暗闇の中で室温で30分インキュベートします。
- ストップソリューションの100 μL/ウェルを追加し、プレートリーダーを使用して、30分以内に各ウェルのOD450値を測定します。
6. Fc-IIIとIgG分子との相互作用のELISAアッセイ
- 100 μLのコーティングバッファー/ウェルに1pmol抗CA抗体(材料の表を参照)で96ウェルマイクロチタープレートをコーティングし、プレートをシールし、シェーカーで一晩4°Cでインキュベートします。
- 5.2 から 5.3 までの手順を繰り返します。
- Fc-IIIまたはFc-III-4C融合CAタンパク質(0.01、0.05、0.1、0.5、1pmolを100μLのブロッキング溶液)をウェルに加え、プレートをシールし、室温で2時間インキュベートします。
注:Fc-IIIまたはFc-III-4C融合CAタンパク質は細菌中で発現し、Ni-NTAによって精製される。 - 5.7 から 5.11 までの手順を繰り返し、結果を確認します。
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Representative Results
この記事のネイティブ化学ライゲーションによる合成経路のフローチャートを図1に示します。図2-6は、Fc-IIIペプチドの化学合成ヒドラジン誘導体のクロマトグラム(A)および質量スペクトル(B)を示し、組換え発現リンカーおよび抗原部分、NCL反応から精製された生成物、精製された脱硫反応と精製最終製品DCAF1からの製品は、それぞれ。クロマトグラムは、すべての製品の精製が90%以上であることを示し、質量スペクトルは、各反応後の製品の分子量を示します。各製品の正確な分子量を反映した図3-6にも、重畳分子量を示しています。図7は、ELISAアッセイ(A)の原理と抗原ペプチドの結果を示し、Fc-IIIおよびDCAF1は4G2抗体結合を競合的に阻害する。抗原ペプチドおよびDCAF1はいずれも4G2結合を有意にブロックし、一方、Fc-IIIペプチドは抗原抗体相互作用に影響を与えない。
図 1.DCAF1分子の半合成に対する天然化学ライゲーション法のワークフロー。
まず、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体は、固相ペプチド合成により得られる。次いで、SUMOタグ融合リンカーと抗原部を細菌から発現・精製し、続いてSUMOタグ切断を行う。2つの断片のNCL反応後、製品は脱硫を受け、Acm基を除去してDCAF1分子となる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体のクロマトグラムおよび質量スペクトル。
この図は、精製ペプチド(A)のLCプロファイルとm/z 915.92のモノアイソトープピークが二重帯電ペプチド(B)と一致したことを示している。この図は、参照 10、図 2 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.リンカーおよび抗原部分のクロマトグラムおよび質量スペクトル。
この図は、精製されたフラグメント(A)のLCプロファイルを示し、この断片の重体分子量は質量スペクトル(B)から9429.0として計算される。この図は、参照10、図S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.NCL反応による共役産物のクロマトグラムおよび質量スペクトル。
この図は、ライゲーション産物を0h(上)、12h(中央)および精製ペプチド(下)(A)でモニタリングするLCプロファイルを示し、本産物の逆畳血分子量は質量スペクトル(B)から11227.0として計算される。この図は、参照10、図S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.脱硫反応後の製品のクロマトグラムおよび質量スペクトル。
この図は、精製産物(A)のLCプロファイルを示し、本産物の重体分子量は質量スペクトル(B)から11195.0として算出される。この図は、参照10、図S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.DCAF1分子のクロマトグラム、質量スペクトルおよびCDスペクトル。
この図は、精製されたDCAF1(A)のLCプロファイル、質量スペクトル(B)から11053.0として計算されたこの分子の破滅分子量、および最終生成物(実線)およびリンカー抗原部のCDスペクトル(リンカー抗原部)を示しています。FCAF1 の破線)。この図は、参照 10、図 2 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.DCAF1分子のELISAアッセイ。
(A)サンドイッチELISAアッセイのワークフロー。最初の抗GST抗体は、ウェルプレート上にコーティングされます。次いで、GST融合抗原ペプチドをインキュベートする。次に、DCAF1、抗原またはFc-IIIの異なる濃度を有する4G2抗体を着色分析のために添加する。(B)抗原、Fc-IIIおよびDCAF1のELSIA結果は、異なるリガンド濃度を用いて4G2結合の阻害効果を実証した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでのプロトコルは、図 1 に示す NCL アプローチを使用して DCAF1 の半合成と検出について説明します。簡単に言えば、DCAF1の2つの断片は、それぞれ化学的に合成され、組換え的に発現される。その後、全長DCAF1分子が組み立てられ、修飾され、精製される。ヒドラジン由来Fc-IIIフラグメント合成の場合、高容量はヒドラジン生成に悪影響を及ぼし、製品の収率が低くなるため、低容量の2-Cl樹脂を使用することは非常に重要です。リンカーと抗原部分は、2つの理由からSUMOタグで発現されます:まず、SUMOタグは融合タンパク質の溶解性を高めることができます。第二に、SUMOプロテアーゼは、さらなるライゲーション反応のためのCys残渣から始めることができる、立体構造認識プロテアーゼであり、放出された製品を開始することを可能にする。タンパク質発現および精製における最も重要なステップの1つは、SUMOプロテアーゼ切断である。SUMOタグ融合タンパク質の濃度は、適切な範囲に調整する必要があります。濃度が高すぎたり低すぎたりすると、消化後のさらなる精製にタンパク質凝集や難しさが生じかねない。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、中性バッファーで起こるべきチオールエステル交換に基づくNCL反応中のpH値を調整することです。反応バッファー内のpH値の微細な制御は、ライゲーション効率を高めるのに役立つ。
このプロトコルは、異なるDCAF分子の配列が非常に類似しており、抗原部分は通常、DCAFの全体の構造および性質にほとんど寄与しないため、異なる抗原配列を有する他のDCAF分子の合成に適している。例えば、このプロトコルを使用して、別の3つのDCAF分子を合成し、そのコグネイト抗体を標的にしました。その中で、DCAF4は、アセチルコリン受容体を中和し、ラットモデルで重症筋症を引き起こすmAb35抗体をブロックするように設計された。DCAF4を用いてmAb35誘発筋症重症のラットの臨床症状を軽減し、補体成分タンパク質を阻害してアセチルコリン受容体を救済した。
我々の技術の応用はいくつかの要因によって制限される:最初に、現在のアプローチによって合成されたDCAF分子の収率が低い(通常は10%未満)。複数の精製手順に起因する;第二に、立体構造決定要因を持つ抗体は、DCAFによって標的化することが困難である。第三に、DCAFは、従来の小さな化合物薬と比較して、生物において余分な免疫応答を誘導し得る。このプロトコルを他の抗体誘発病理学的条件に適用することは、より多くのDCAF分子を合成して有害な抗体を排除するのに役立つことを想定しています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は清華大学ゲイツ財団の一部で支援されました(いいえ。OPP1021992)、中国国家自然科学財団(No.21502103、21877068および041301475)、および中国国家主要研究開発プログラム(No. 2017YFA0505103)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J.
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
