Summary

Gerichte antilichamen blokkering door een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetics (DCAF)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

De ontwikkeling van een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF) is een roman voor de eliminatie van schadelijke antilichamen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese van DCAF1 molecuul, dat selectief 4G2 antilichamen kan blokkeren om antilichaam afhankelijke verbeterings effecten te elimineren tijdens een Denguevirus infectie.

Abstract

Eliminatie van schadelijke antilichamen tegen organismen is een waardevolle aanpak voor de interventie van met antilichamen geassocieerde ziekten, zoals dengue hemorragische koorts en auto-immuunziekten. Aangezien duizenden antilichamen met verschillende epitopen in het bloed circuleren, werd er geen universele methode gerapporteerd, met uitzondering van het dubbele functionele conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF), om specifieke schadelijke antilichamen aan te richten. De ontwikkeling van DCAF moleculen levert een aanzienlijke bijdrage aan de voortgang van gerichte therapie, die werden aangetoond dat het elimineren van het antilichaam afhankelijke verbetering (ADE) effect in een Denguevirus (DENV) infectie model en ter bevordering van de acetylcholine receptor activiteit in een myasthenia gravis model. Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van een DCAF-molecuul (DCAF1), dat selectief 4G2-antilichamen kan blokkeren om het ADE-effect te verzachten tijdens een dengue-virus infectie en de binding van DCAF1 tot 4G2-antilichaam door een ELISA-test te illustreren. In onze methode wordt DCAF1 gesynthetiseerd door de conjugatie van een hydrazine derivaat van een FC-III peptide en een recombinant uitgedrukt lange α-helix met antigene sequentie door inheemse chemische ligatie (NCL). Dit protocol is met succes toegepast op DCAF1 en andere DCAF moleculen voor de targeting van hun verwant antilichamen.

Introduction

Antilichamen spelen een belangrijke rol in de humorale immuunrespons voor de neutralisatie van pathogene bacteriën en virussen1. Sommige antilichamen vertonen echter schadelijke effecten op de organismen, zoals kruisreactieve antilichamen in het ade-effect tijdens denv-infectie en overmatige reactieve antilichamen in myasthenia gravis, een auto-immuunziekte2,3. ADE-effect wordt gemedieerd door de kruisreactieve antilichamen die de brug maken om denv en FC-receptor met cellen4,5te verbinden, terwijl myasthenia gravis wordt veroorzaakt door de overmatige antilichamen die acetylcholine-receptoren aanvallen tussen de cel-cel knooppunten in spierweefsel6,7. Hoewel er gedeeltelijk effectieve benaderingen zijn ontwikkeld voor de behandeling van deze ziekten8,9, zou ongetwijfeld directe eliminatie van deze schadelijke antilichamen vooruitgang voor de interventies.

Onlangs, DCAF moleculen, die hebben dual-functionele groepen, zijn ontwikkeld voor gerichte antilichamen blokkering10. DCAF is een lange peptide die bestaat uit 3 delen: 1) een antigeen deel dat specifiek kan herkennen de verwant antilichaam, 2) een FC-III of FC-III-4c-tag voor sterk binden aan de FC-regio van het antilichaam voor de remming van ofwel FC receptor of complement component eiwitten , 3) een lange α-spiraalvormige linker die deze twee functionele groepen10conjugaten. Het linker deel, ontworpen vanuit Moesin FERM domein, werd geoptimaliseerd door Rosseta software om ervoor te zorgen dat het antigeen deel en FC-III deel in een DCAF molecuul kan binden aan de Fab en FC regio’s van IgG tegelijkertijd. Vier DCAF moleculen zijn gesynthetiseerd om te richten op 4 verschillende antilichamen, onder hen DCAF1 werd gebruikt om te elimineren 4G2 antilichamen, dat is een cross-reactieve antilichaam tijdens DENV-infectie om bij te dragen aan ADE-effect; en DACF4 is ontworpen voor de redding van acetylcholine-receptoren door het blokkeren van mab35 antilichaam in myasthenia gravis10.

In de huidige studie, genomen DCAF1 als het voorbeeld, we toonden de protocollen voor de synthese van DCAF molecuul en de detectie van de interactie tussen een DCAF en haar verwant antilichamen. De DCAF1 wordt semi-gesynthetiseerd door NCL-aanpak11,12,13,14, die het hydrazine derivaat van een FC-III-peptide en de uitgedrukte linker-antigeen delen samen conjugaten. De NCL aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van volledig chemische synthese en volledig recombinant expressie voor DCAF1 synthese, omdat beide methoden leiden tot lage opbrengst en hoge kosten. De huidige aanpak is niet alleen de meest kosteneffectieve manier om de volledige DCAF te krijgen, maar kan ook de conformatie van de linker deel vergelijkbaar als zijn oorspronkelijke vorm te handhaven. Aangezien verschillende DCAF moleculen vergelijkbare sequenties hebben, met uitzondering van de antigeen onderdelen, kunnen onze methoden voor DCAF1 synthese en de interactie test tussen DCAF1 en 4g2 antilichaam worden toegepast op andere DCAF moleculen om hun verwant antilichamen ook te blokkeren.

Protocol

1. chemische synthese van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide 2-cl-(TRT)-cl-hars omzetten in 2-cl-(TRT)-NHNH2 -hars Weeg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl Resin (0,25 mmol) in een 25 mL peptide synthese vat. Voeg 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) toe aan de hars van de bovenkant van het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DMF-wassing nog twee keer. Voeg 5 mL dichloormethaan (DCM) toe aan het v…

Representative Results

Het stroomdiagram voor de syntheseroute door inheemse chemische ligatie in dit artikel wordt weergegeven in Figuur 1. Figuren 2-6 Toon de chromatogrammen (A) en massa spectra (B) van chemisch gesynthetiseerd hydrazine derivaat van een FC-III-peptide, recombinant uitgedrukt linker-en antigeen-deel, het gezuiverde product van de NCL-reactie, de gezuiverde product uit de ontzwavelings reactie en het gezuiverde eindproduct DCAF1, respectievelijk…

Discussion

Het protocol hier beschrijft de semi-synthese en detectie van DCAF1 met behulp van NCL benadering, die wordt weergegeven in Figuur 1. Kort, de twee fragmenten van DCAF1 zijn chemisch gesynthetiseerd en recombinantly uitgedrukt, respectievelijk; dan, de volledige lengte DCAF1 molecuul wordt geassembleerd, aangepast en gezuiverd. Voor de door hydrazine afgeleide FC-III-fragment synthese is het gebruik van 2-cl-hars met lage capaciteit heel belangrijk, omdat een hoge capaciteit een negatief eff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd deels gesteund door de Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), de National Natural Science Foundation of China (nr. 21502103, 21877068 en 041301475), en het nationale sleutel onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van China (nr. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

View Video