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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

O desenvolvimento de um conjugado dual-functional do peptide antigénico e do mimetics FC-III (DCAF) é novo para a eliminação de anticorpos prejudiciais. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese da molécula DCAF1, que pode seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para eliminar o efeito dependente do realce do anticorpo durante a infecção do vírus de dengue.

Abstract

A eliminação de anticorpos nocivos dos organismos é uma abordagem valiosa para a intervenção de doenças associadas a anticorpos, como a febre hemorrágica da dengue e doenças auto-imunes. Desde que os milhares de anticorpos com epítopos diferentes circulam no sangue, nenhum método universal, à exceção do conjugado duplo-funcional do peptide antigénico e dos mimetics FC-III (DCAF), foi relatado para alvejar anticorpos prejudiciais específicos. O desenvolvimento de moléculas de DCAF contribui significativamente para o avanço da terapia direcionada, que foram demonstrados para eliminar o efeito do realce dependente de anticorpos (ADE) em um modelo de infecção pelo vírus da dengue (DENV) e para impulsionar a acetilcolina atividade do receptor em um modelo do gravis da miastenia. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de uma molécula de DCAF (DCAF1), que possa seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para atenuar o efeito do ADE durante a infecção do vírus de dengue, e ilustrar a ligação de DCAF1 ao anticorpo 4G2 por um ensaio de ELISA. Em nosso método, DCAF1 é sintetizado pela conjugação de um derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III e uma α-hélice longa expressa recombinante com seqüência antigênica através de ligadura química nativa (NCL). Este protocolo foi aplicado com sucesso a DCAF1 assim como outras moléculas de DCAF para alvejar seus anticorpos cognato.

Introduction

Os anticorpos desempenham papéis importantes na resposta imune humoral para a neutralização de bactérias patogênicas e vírus1. No entanto, alguns anticorpos exibem impactos nocivos para os organismos, tais como anticorpos Cross-Reactive no efeito Ade durante a infecção por DENV e anticorpos over-reativa em miastenia gravis, que é uma doença auto-imune2,3. O efeito Ade é mediado pelos anticorpos Cross-Reactive que fazem a ponte para conectar o receptor de DENV e de FC que apresenta pilhas4,5, quando os gravis da miastenia forem causados pelos anticorpos excessivos que atacam receptores da acetilcolina entre as junções célula-célula no tecido muscular6,7. Embora abordagens parcialmente eficazes tenham sido desenvolvidas para tratar essas doenças8,9, semdúvida, a eliminação direta desses anticorpos prejudiciais faria progressos para as intervenções.

Recentemente, as moléculas de DCAF, que têm grupos Dual-functional, foram desenvolvidas para o anticorpo alvejado que obstrui10. DCAF é um peptide longo que seja compor de 3 porções: 1) uma peça do antígeno que possa específico reconhecer o anticorpo cognato, 2) um tag de FC-III ou de FC-III-4C para fortemente ligar à região de FC do anticorpo para inibir o receptor de FC ou as proteínas do componente do complemento , 3) um longo vinculador α-helicoidal que conjuga esses dois grupos funcionais10. A parte do vinculador, projetada do domínio de Moesin FERM, foi aperfeiçoada pelo software de Rosseta para assegurar a parte do antígeno e a parte de FC-III em uma molécula de DCAF pode ligar às regiões de fab e de FC de IgG simultaneamente. Quatro moléculas de DCAF foram sintetizadas para alvejar 4 anticorpos diferentes, entre eles DCAF1 foi usado para eliminar o anticorpo 4G2, que é um anticorpo Cross-Reactive durante a infecção de DENV para contribuir ao efeito do ADE; e DACF4 foi projetado para o resgate de receptores de acetilcolina, bloqueando mab35 anticorpo em miastenia gravis10.

No presente estudo, DCAF1 como exemplo, foram mostrados os protocolos para a síntese da molécula de DCAF e a detecção da interação entre um DCAF e seu anticorpo cognato. O DCAF1 é semisintetizado pela aproximação de NCL11,12,13,14, que conjuga o derivado de hidrazina de um peptide de FC-III e as partes expressadas do linker-antígeno junto. A abordagem NCL tem vantagens significativas sobre a síntese totalmente química e expressão totalmente recombinante para a síntese de DCAF1, porque ambos os métodos levam a baixo rendimento e alto custo. A abordagem atual não é apenas a maneira mais rentável para obter o DCAF de comprimento total, mas também pode manter a conformação da parte do vinculador semelhante como sua forma nativa. Desde que as moléculas diferentes de DCAF têm seqüências similares à exceção das peças do antígeno, nossos métodos para a síntese DCAF1 e o ensaio da interação entre o anticorpo DCAF1 e 4G2 podem ser aplicados a outras moléculas de DCAF ao bloco alvejado seus anticorpos cognato também.

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Protocol

1. síntese química do derivado da hidrazina de um peptídeo FC-III

  1. Convertendo 2-CL-(TRT)-resina CL para 2-CL-(TRT)-NHNH2 resina
    1. Pesar 625 mg de resina 2-CL-(TRT)-CL (0,25 mmol) em uma embarcação de síntese de peptídeos de 25 mL.
    2. Adicionar 5 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para a resina a partir do topo da embarcação, coloque a tampa de volta, agitar suavemente a embarcação por 15 s e, em seguida, drená-lo. Repita a lavagem DMF por mais duas vezes.
    3. Adicionar 5 mL de diclorometano (DCM) para o navio, coloque a tampa de volta, agitar suavemente a embarcação por 15 s e depois drená-lo. Repita a lavagem de DCM por mais duas vezes.
    4. Repita o passo 1.1.2 três vezes.
    5. Use 6 mL de 50% (Vol/Vol) DMF/DCM para inchar a resina por 30 min, e depois drená-lo.
    6. Transferência 6 mL 5% (Vol/Vol) NH 2NH2 em Dmf para a embarcação de reação, agitar a mistura em 120 rpm, 30 ° c por 30 min, e depois drenar a solução por bomba de vácuo.
      Nota: Adicionar 0,3 mL de hidrazina hidratada para 5,7 mL de DMF para obter 5% (Vol/Vol) NH2NH2. Prepare recentemente o NH2NH2 antes de usar.
      PRECAUÇÃO: o hidrato de hidrazina é uma substância perigosa e pode causar cancro. Use um jaleco, luvas e uma máscara. Realize os experimentos em uma capa de fumaça.
    7. Adicionar 5 mL de DMF ao recipiente, agitá-lo suavemente por 15 s e depois drená-lo.
    8. Repita a etapa 1.1.6 e lave então a resina repetindo etapas 1.1.2-1.1.4 por duas vezes.
    9. Adicionar 6 mL de 5% (Vol/Vol) MeOH/DMF para o navio, agitá-lo suavemente por 10 min e depois drená-lo.
      Nota: esta etapa é muito importante assegurar os locais não reagidos na resina é tampado.
    10. Lave a resina completamente repetindo as etapas 1.1.2-1.1.4.
    11. Adicionar 5 mL de DCM à resina, agitá-lo suavemente por 15 s e, em seguida, drená-lo para obter 2-CL-(TRT)-NHNH2 resina.
      Nota: a resina torna-se amarela ou verde claro quando a substituição é bem sucedida.
  2. Alongamento do peptídeo
    1. Adicionar 1 mmol do fmoc-ala-Oh (934 mg) e 0,95 mmol de 1-[bis (dimethylamino) metileno]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] piridinium hexafluorfosfato 3-óxido (Hatu) (360 mg) em um tubo de 5 ml contendo 3 ml de DMF.
      PRECAUÇÃO: a exposição ao HATU pode provocar uma reacção alérgica. Use um jaleco, luvas e uma máscara.
    2. Adicionar 2 mmol de N, N-diisopropillethylamine (DIEA) (0,36 mL) à solução dissolvida e Vortex por 0,5 – 1 min.
      Nota: etapa crítica: a ativação deve demorar não mais do que 5 min, como os aminoácidos ativados isomerize dos mais ativos O-formulários para o menos ativo N-formas ao longo do tempo.
    3. Adicione o Fmoc-ala-OH ativado ao vaso de reação contendo a resina 2-CL-(TRT)-NHNH2 , preparada a partir do passo 1,1. Agitar suavemente em 120 rpm, 30 ° c por 20 min em um agitador de temperatura constante e, em seguida, drenar a solução por bomba de vácuo.
    4. Adicione 5 mL de DMF para lavar a resina, agitá-la suavemente por 15 s e depois drená-la.
    5. Adicione 1 mmol do fmoc-ala-Oh (934 MGS) e 0,95 mmol de 2-(6-chloro-1h-benzotriazole-1-YL)-1, 1, 3, 3-tetramelilamínio hexafluorfosfato (hctu) (390 MGS) em um tubo de 5 ml contendo 3 ml de DMF.
      PRECAUÇÃO: a exposição ao HCTU pode provocar uma reacção alérgica. Use um jaleco, luvas e uma máscara.
    6. Adicione 2 mmol de DIEA (0,36 mL) ao tubo e ao Vortex por 0,5 – 1 min para dissolvê-lo.
    7. Adicione o Fmoc-ala-OH ativado ao vaso de reação. Agitar suavemente a 120 rpm, 30 ° c por 40-60 min em um agitador de temperatura constante e, em seguida, drenar a solução por bomba de vácuo.
    8. Lave a resina repetindo os passos 1.1.2-1.1.4.
    9. Adicionar 4 mL de 20% (Vol/Vol) piperidina em DMF para a resina, agitar suavemente por 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, drenar a solução.
      PRECAUÇÃO: a piridina é altamente inflamável e tóxica. Realize os experimentos em uma capa de fumaça.
    10. Adicionar outro 4 mL de 20% (Vol/Vol) piperidina em DMF para a resina, agitar suavemente por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, drenar a solução.
    11. Siga os passos 1.2.1-1.2.10 para casal e desproteger o Fmoc-ala-OH, Fmoc-thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-his-OH e Fmoc-ala-OH. Repita os passos 1.2.5-1.2.10 para casal e desproteger o Fmoc-TRP-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH e Fmoc-ASP-OH.
    12. Repita as etapas 1.1.2-1.1.4 para lavar a resina completamente.
    13. Repita a etapa 1.1.3 para lavar a resina e então vácuo-seque a resina por 5 minutos.
  3. Clivagem do peptídeo bruto FC-III derivado da hidrazina
    1. Adicionar 12 mL de cocktails de ácido trifluoroacético (TFA)/2, 2 ′-(ethylenedioxy) dietanetiol (DODT)/triisopropylsilane (pontas)/H2o (92.5/2.5/2.5/2.5) à resina, e use então um abanador da constante-temperatura para Cleave o peptide da resina em 200 rpm, 37 ° c cerca de 2 h. filtre a mistura num tubo de centrifugação de 50 mL.
    2. Adicione 1 mL de cocktails na resina para o lavar e recolher o filtrado no tubo de centrifugação de 50 mL. Repita duas vezes.
    3. Concentre a mistura em 2 mL por um rotor vaper em uma capa de fumaça e, em seguida, adicione 20 mL de éter dietílico pré-resfriado no tubo para precipir peptídeos brutos.
      Nota: o éter anidro deve ser pré-arrefecido a 0 ° c para evitar a libertação violenta de calor, o que pode provocar reacções colaterais do péptido bruto.
    4. Incubar a precipitação do peptídeo em-20 ° c para 1-2 h.
    5. Centrifugador a 5.000 x g, 4 ° c por 10 min e retire o solvente do tubo de centrifugação com cuidado.
    6. Adicione 20 mL de éter dietílico pré-arrefecido no tubo duas vezes de acordo com os passos 1.3.3-1.3.5 para lavar a precipitação. Seque o produto peptídeo em um relógio-vidro por cerca de 15 min. armazene os peptídeos brutos secos a 4 ° c para posterior análise.
  4. Purificação do derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III
    1. Use o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para purificar o peptídeo por uma eluição de gradiente de 30 min (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) a uma vazão de 1 mL/min.
      Nota: a coluna está em 4,6 mm ID, 250 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu de 0,1% de TFA na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de TFA.

2. expressão da proteína e purificação de partes do vinculador e do antígeno

  1. Construção do plasmídeo
    1. Sintetizar toda a sequência genética que pode expressar SUMO-linker-Antigen (ver tabela de materiais).
    2. Corte 10 ng de PET-28A vetor vazio e 50 ng do fragmento de DNA sintetizado SUMO-vinculador-antígeno usando NcoI e XhoI em um banho de água de 37 ° c por 3 h.
    3. Purify o vetor digerido da dobro-enzima e o fragmento do ADN pelo jogo da extração do gel do ADN.
    4. Adicionar 5 μL de fragmento de DNA digerido por DNA, 5 μL de vetor digerido, 1 μL de ligase de ADN T4, 2 μL de tampão de ligase 10x e 7 μL de ddH2o a um tubo de reacção e, em seguida, incubar-o durante a noite a 16 ° c.
    5. Misture 10 μL do produto de ligadura do passo 2.1.4 para 100 μL de células competentes (DH5α) e coloque-o num banho de gelo durante 30 min. Coloque as células competentes num banho de água de 42 ° c por 90 s e transfira-a rapidamente para um banho de gelo durante 2 min. Adicione 800 mL de LB meio líquido (sem antibióticos) para o tubo e agitá-lo em 37 ° c, 180 rpm para 1 h. Cubra as células competentes em uma placa kanamycin LB para torná-los igualmente distribuídos, e colocar a placa em uma incubadora de 37 ° c durante a noite.
    6. Escolha 5 colônias individuais da placa e cultura as bactérias em 5 mL de meio LB em um tubo de ensaio usando um Shaker de 37 ° c.
    7. Extraia plasmídeo das bactérias colhidas da etapa 2.1.6 usando o kit de extração de plasmid.
    8. Emita os plasmídeos para arranjar em seqüência do gene e escolha a colônia positiva que pode expressar a proteína da fusão do sumo-linker-antígeno. Transforme o plasmídeo positivo para BL21 (DE3) plysS células competentes após o passo 2.1.5.
  2. Purificação de proteínas
    1. Escolha uma única colônia de transformantes da etapa 2.1.7 em 5 ml do meio líquido da libra que contem o canamicina (50 μg/ml). Agitar as culturas durante a noite em 200 rpm, 37 ° c.
    2. Inocular 1 L de meio de LB pré-aquecido contendo canamicina (50 μg/mL) em um balão com 5 mL de culturas durante a noite, e crescer a 37 ° c com agitação vigorosa, até que o OD600 seja 0,6.
    3. Adicionar isopropílico β-D-tiogalactosídeo (IPTG) no meio até a concentração final de 0,4 mM, e agitar o balão a 200 rpm durante a noite a 20 ° c.
      Nota: a baixa temperatura para a indução da proteína é importante evitar a formação do corpo da inclusão, assim que certifique-se que a temperatura é não mais do que 22 ° c.
    4. Após a colheita das células, adicionar 50 mL de tampão de Lise para as pelotas de células para Ressuspender as células. SONICATE o lysates da pilha duas vezes por 5 minutos em 200 W, ultra-som 3 s, intervalo 3 s no gelo. Centrifugue-o em 15, 000 x g por 30 minutos em 4 ° c para recolher os sobrenadantes.
      Nota: o tampão de Lise é composto de 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 10 mm imidazol. Ajuste o valor de pH para 8,0 usando NaOH.
    5. Adicionar 2 mL do 50% NI-NTA Sephorase, equilibrados por tampão de Lise, para os sobrenadantes limpos e misture suavemente agitando (200 rpm em um agitador rotativo) a 4 ° c por 1 h.
    6. Carregue a mistura de lisado e NI-NTA em uma coluna com a saída inferior tampada e remova a tampa inferior e descarte o fluxo da coluna.
    7. Lave três vezes com 6 ml de tampão de lavagem e, em seguida, eluir a proteína alvejada 3 vezes com 1,5 ml de tampão de eluição. Colete o eluado em um tubo.
      Nota: o tampão de lavagem é composto de 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 30 mm imidazol. Ajuste o valor de pH para 8,0 usando NaOH. O tampão de eluição é composto de 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 250 mm imidazol. Ajuste o valor de pH para 8,0 usando NaOH.
    8. Põr o eluído em um saco da diálise em 1 L de 50 milímetros de PBS em 4 ° c para desalt a proteína. Substitua a nova solução salina tamponada por fosfato (PBS) por 3 vezes.
  3. Clivagem da marca SUMO
    1. Adicionar 2 mL de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO) marcou proteína na concentração de 1 mg/mL, 1 mL de SUMO protease (ver tabela de materiais), 1 ml de 10x sumo protease de sumô e 6 ml de DDH2o para preparar a solução de reação.
      Nota: a concentração de proteína de marca SUMO é de cerca de 1 mg/mL. As concentrações excessivas após a digestão da enzima podem causar a coagulação da proteína.
    2. Incubar a mistura por 12-16 h a 4 ° c.
    3. Centrifugue a mistura a 15.000 x g durante 10 min a 4 ° c e elimine os agregados. Adicione 0,5 mL do chorume de 50% NI-NTA, equilibrados por 50 mM PBS, aos 10 mL de sobrenadantes limpos e misture suavemente agitando (200 rpm em um agitador rotativo) a 4 ° c por 60 min.
    4. Coloque a mistura de lisado e NI-NTA em uma coluna com a saída inferior tampada. Retire a tampa inferior e, em seguida, guarde o fluxo através de um tubo de centrifugação de 15 mL.
      Nota: a proteína de SUMO Histagged é obrigatória na coluna. A parte do vinculador-antígeno, que começa com Cys para a reação de NCL, está no fluxo completamente.
    5. Centrifugue o fluxo através de 15.000 x g por 10 min a 4 ° c e descarte os agregados. Purify a parte do linker-antígeno usando a HPLC por uma eluição do inclinação de 25 minutos (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
      Nota: a coluna está em 4,6 mm ID, 250 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu de 0,1% de TFA na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de TFA.
    6. Colete o produto purificado da HPLC e, em seguida, congele-seque durante a noite para obter o produto de antígeno-vinculador.

3. montagem de DCAF1 por ligadura química nativa

  1. Conjugating o peptide de FC-III e a parte do linker-antígeno junto
    1. Pesar 1,8 mg (1 μmol) de derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III em um tubo de 2 mL EP e adicionar 0,8 mL de 6 M de GnHCl em 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) solução para dissolvê-lo por vortexing.
      Nota: 6 M GnHCl em 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) solução é preparada ajustando o valor de pH com HCl ou NaOH.
      Cuidado: NaOH e HCl são altamente corrosivos. Use um jaleco, luvas e uma máscara.
    2. Depois de centrifugar o tubo a 7.200 x g durante 1 min à temperatura ambiente, coloque o tubo num banho de sal gelado e utilize a agitação magnética para agitar a solução durante 15 min suavemente.
    3. Adicionar 40 μL de 0,5 M NaNO2 à solução para oxidar o grupo hidrazina. Agitar suavemente a solução por mais 15 min no banho de sal gelado.
    4. Pesar e adicionar 11 mg de purificada linker-antígeno parte preparada a partir do passo 2,3 e 13,6 mg de 4-mercaptofenilacético ácido (MPAA) para o tubo de reacção no banho de gelo-sal, mexa por 5 min, e em seguida, ajustar o valor de pH para 6.8-7.0 em temperatura ambiente com 6 M NaOH.
      Nota: ajustar o valor de pH para neutro é a etapa crítica para iniciar a reação de ligadura.
    5. Após 12 h, adicionar 0,4 mL de 0,1 M Tris (2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP) solução neutra (pH 7,0) para o sistema de reação e mexa por 20 min para encerrar a reação.
      Nota: 0,1 M TCEP solução neutra (pH 7,0) é preparada dissolvendo TCEP em 6 M GnHCl em 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) solução, e usando NaOH para ajustar o valor de pH para 7,0.
    6. Centrifugue o tubo em 15.000 x g por 10 min, em seguida, analisar e purificar o produto de ligadura com HPLC por uma eluição de gradiente de 26 min (0-1 min, 5% b; 1-21 min, 45% b; 21-22 min, 85% b; 22-26 min, 85% b) a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. O rendimento esperado para a reação de ligadura é de mais de 50%.
      Nota: a coluna está em 4,6 mm ID, 250 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu de 0,1% de TFA na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de TFA.
  2. Dessulfuração do conjugado
    1. Dissolver o conjugado (3,4 mg, 0,3 μmol) preparado a partir do passo 3.1.6 em 50 μL de 6 M de GnHCl em 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) solução.
    2. Adicionar 50 μL de TCEP de 1 M, 10 μL de tBuSH e 5 μL de solução de 0,1 M VA-044 para a mistura acima.
      Nota: 0,1 M VA-044 solução é preparada dissolvendo 9,7 mg de VA-044 pó em 0,3 mL de 6 M de GnHCl em 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) solução. A solução VA-044 deve ser preparada recentemente antes do uso, pois o VA-044 é facilmente oxidado pela exposição ao ar.
    3. Ajuste o pH final da solução para 6,9 e mantenha o solutiomat 37 ° c com agitação por cerca de 5 h.
    4. Centrifugue o tubo a 15.000 x g durante 10 min e retire a substância insolúvel. Analisar e purificar o produto de ligadura com HPLC por uma eluição de gradiente de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) a uma vazão de 1 mL/min. O rendimento esperado para a reação de dessulfuração é de cerca de 40%.
      Nota: a coluna está em 4,6 mm ID, 250 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu de 0,1% de TFA na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de TFA.
  3. Remoção do ACM para obter o produto final DCAF1
    1. Dissolver o peptídeo (1,35 mg, 0,11 μmol) preparado a partir do passo 3.2.4 em 200 μL de 32 mM AgOAc e, em seguida, agitar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 4 h.
    2. Adicionar 3 μL de 1m de dithiothreitol (DTT) em 6 m de gnhcl em 0,2 m NaH2po4 (pH 7,0) solução para converter os e de prata no peptídeo para libertar tióis.
    3. Depois de mexer violentamente durante 1 min, Centrifugue o tubo a 15.000 x g durante 10 min para descartar a substância insolúvel. Analisar e purificar o produto final com HPLC por uma eluição de gradiente de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) a uma vazão de 1 mL/min. O rendimento esperado para a reação de desproteção do ACM é de cerca de 30%.
      Nota: a coluna está em 4,6 mm ID, 250 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu de 0,1% de TFA na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de TFA.
    4. Após a purificação de HPLC, congelar-secar o produto final durante a noite, e dissolver o pó em PBS (50 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 8,0). Centrifugue o tubo a 15.000 x g durante 10 min a 4 ° c e descarte o pellet.
    5. Ajuste as concentrações do produto final (da etapa 3,4) e do linker-antígeno parte (da etapa 2.3.6) a 10 μm, registre os espectros circulares do Dicroísmo (CD) de 260 a 195 nanômetro destes dois produtos usando um espectrómetro do CD em 25 ° c com comprimento de trajeto de 1 milímetro.
      Nota: os espectros de CD são usados para demonstrar a quantidade de estrutura helicoidal do α no produto final é tão similar quanto aquela no recombinante expressado.

4. detecção dos produtos por espectrometria de massas

  1. Separe o produto de cada reação química por uma eluição de gradiente de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a uma vazão de 0,300 μL/min com um sistema da Nano-HPLC que é interface diretamente com o espectrómetro maciço de alta resolução.
    Nota: a coluna analítica está em 75 μm de identificação, 150 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu em 0,1% de ácido fórmico na água, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico.
  2. Opere o espectrómetro maciço no modo de varredura completa e ajuste a escala de m/z em 300-2000 e a definição em 60.000.
  3. Abra os dados de espectros de massa e encontre os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química é pré-formada com sucesso.

5. ensaio ELISA da interacção entre o anticorpo DCAF1 e 4G2

  1. Revestir uma placa de de microtitulação 96-well com 1 anticorpo anti-GST pmol (ver tabela de materiais) em 100 μl de tampão de revestimento/poço, selar a placa e incubar-lo a 4 ° c durante a noite em uma coqueteleira.
  2. Bloquear cada poço com 200 μL de 1% de BSA em PBS, selar a placa e incubar-lo à temperatura ambiente durante 1 h numa coqueteleira.
  3. Lave cada poço 4 vezes usando PBS com 0, 5% Tween 20.
  4. Adicione a proteína de antígeno de GST fundido (0, 5 pmol em 100 μL de solução de bloqueio) aos poços, sele a placa e incubar por 2 h à temperatura ambiente.
    Nota: a proteína do antígeno de GST-fundido é expressada nas bactérias e purificada por GSH Sepharose.
  5. Repita o passo 5,3 para lavar a chapa.
  6. Adicionar 1 pmol 4G2 anticorpo ou 1 pmol 4G2 anticorpo mais os outros ligantes: antígeno, FC-III ou DCAF1 em quantidades de série (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol e 1000 pmol) em 100 μL de solução de bloqueio/poço, selar a placa e incubar 2 h à temperatura ambiente em um Shaker.
  7. Repita o passo 5,3 para lavar a chapa.
  8. Adicionar anti-mouse IgG, HRP-linked anticorpo (1:20000 diluição) em 100 μL de solução de bloqueio/bem, selar a placa e incubar 30 min à temperatura ambiente em uma coqueteleira.
  9. Lave cada poço 6 vezes usando PBS com 0, 5% Tween 20.
  10. Misture o reagente A e B 1:1 de TMB no volume imediatamente antes do uso, adicione 100 μL/poço, e então Incubar 30 minutos na temperatura ambiente no escuro.
  11. Adicione 100 μL/poço da solução da parada, e use um leitor da placa para medir os valores do OD450 para cada poço dentro de 30 minutos.

6. ensaio ELISA da interacção entre o FC-III e a molécula de IgG

  1. Revestir uma placa de de microtitulação 96-well com 1 anticorpo anti-CA pmol (ver tabela de materiais) em 100 μl de tampão de revestimento/poço, selar a placa e incubar-lo a 4 ° c durante a noite em uma coqueteleira.
  2. Repita os passos de 5,2 para 5,3.
  3. Adicione a proteína CA fundida FC-III ou FC-III-4C (0, 1, 0, 5, 0,1, 0,5 e 1 pmol em 100 μL de solução de bloqueio) aos poços, sele a placa e incubar por 2 h à temperatura ambiente.
    Nota: FC-III ou FC-III-4C a proteína de CA fundida é expressada nas bactérias e purified por NI-NTA.
  4. Repita os passos de 5,7 para 5,11 e verifique os resultados.

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Representative Results

O fluxograma para a rota de síntese por ligadura química nativa neste artigo é mostrado na Figura 1. As figuras 2-6 mostram os cromatogramas (a) e os espectros de massa (B) do derivado químico sintetizado da hidrazina de um peptídeo FC-III, do linker expresso recombinante e da parte do antígeno, o produto purificado da reação de NCL, o purificado produto da reação da dessulfuração e do produto final purified DCAF1, respectivamente. Os cromatogramas mostram que os purifica de todos os produtos são mais de 90%, enquanto os espectros de massa indicam o peso molecular do produto após cada reação. Os pesos moleculares deconvolutionais também são mostrados nas figuras 3-6, que refletem o peso molecular exato de cada produto. A Figura 7 mostra o princípio do ensaio ELISA (a) e os resultados do peptídeo antigénio, FC-III e DCAF1, inibindo competitivamente a ligação do anticorpo 4G2. O peptide do antígeno e o DCAF1 bloqueiam significativamente a ligação 4G2, visto que o peptide de FC-III não afeta a interação do antígeno-anticorpo.

Figure 1
Figura 1. O fluxo de trabalho do método de ligadura química nativa para a semisíntese da molécula DCAF1.
Primeiro, o derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III é obtido por síntese de peptídeos de fase sólida. Em seguida, a marca SUMO fundida linker e parte do antígeno é expressa e purificada a partir de bactérias, seguido pela clivagem de marca SUMO. Após a reação de NCL dos dois fragmentos, o produto sofre dessulfuração e removendo grupos de ACM para transformar-se molécula de DCAF1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. O cromatograma e o espectro maciço do derivado de hidrazina de um peptide de FC-III.
Esta figura mostra que o perfil LC do peptídeo purificado (a) eo pico de mono-isótopos em m/z 915,92 corresponderam ao peptídeo carregado de duple (B). Este valor foi modificado a partir da referência 10, Figura 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. O cromatograma e o espectro de massa da parte do vinculador e do antígeno.
Este valor mostra o perfil LC do fragmento purificado (a) eo peso molecular deconvolutional deste fragmento é calculado como 9429,0 do espectro de massa (B). Este valor foi modificado a partir da referência 10, figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. O cromatograma e o espectro maciço do produto da conjugação pela reação de NCL.
Esta figura mostra o perfil do LC que monitora o produto da ligadura em 0 h (parte superior), em 12 h (meio) e no peptide purificado (parte inferior) (a) e o peso molecular deconvolutional deste produto é calculado como 11227,0 do espectro maciço (B). Este valor foi modificado a partir da referência 10, figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. O cromatograma e o espectro maciço do produto após a reação do dessulfuração.
Este número mostra o perfil LC do produto purificado (a) eo peso molecular deconvolutional deste produto é calculado como 11195,0 do espectro de massa (B). Este valor foi modificado a partir da referência 10, figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. O cromatograma, espectro de massa e espectros de CD da molécula DCAF1.
Esta figura mostra o perfil LC da DCAF1 purificada (a),o peso molecular deconvolutional desta molécula calculada como 11053,0 do espectro de massa (B) e os espectros de CD do produto final (linha sólida) e a parte do antígeno-antigénio ( linha de traço) em FCAF1. Este valor foi modificado a partir da referência 10, Figura 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Ensaio ELISA da molécula DCAF1.
(A) o fluxo de trabalho do ensaio Elisa sanduíche. Primeiro anticorpo anti-GST é revestido em uma placa de poço. Em seguida, o peptídeo antigénio fundido com GST é incubado. Em seguida, o anticorpo 4G2 com diferentes concentrações de DCAF1, antígeno ou FC-III é adicionado para análise colorimétrica. (B) os resultados de Elsia do antígeno, do FC-III e do DCAF1 que demonstram efeitos da inibição da ligação 4G2 usando concentrações diferentes do ligante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo aqui descreve a semisíntese e a detecção de DCAF1 usando a abordagem NCL, que é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os dois fragmentos de DCAF1 são químicos sintetizados e recombinantemente expressos, respectivamente; Então, a molécula cheia do comprimento DCAF1 é montada, modificada e purificada. Para a síntese de fragmento de FC-III derivado de hidrazina, usar resina de baixa capacidade de 2 CL é bastante importante, pois a alta capacidade tem um efeito negativo para a geração de hidrazina e leva a um baixo rendimento do produto. A parte do linker e do antígeno é expressada com tag de SUMO por duas razões: primeiramente, a etiqueta de SUMO pode realçar a solubilidade das proteínas da fusão; em segundo, a protease de SUMO é uma protease conformation-reconhecida, que permita que o produto liberado comece com resíduo de Cys para a reação mais adicional da ligadura. Uma das etapas mais críticas na expressão protéica e purificação é a clivagem da protease SUMO. A concentração de proteína tag-fundida SUMO deve ser ajustada à escala apropriada. Uma concentração demasiado elevada ou demasiado baixa conduziria à agregação ou à dificuldade da proteína para a purificação mais adicional após a digestão. Uma outra etapa crítica deste protocolo está ajustando o valor de pH durante a reação de NCL, que é baseada na troca do Thiol-éster que deve acontecer no amortecedor neutro. O controle fino do valor de pH no amortecedor da reação é útil realçar a eficiência da ligadura.

Este protocolo é apropriado para a síntese de outras moléculas de DCAF com seqüências diferentes do antígeno, porque as seqüências de moléculas diferentes de DCAF são completamente similares e a parte do antígeno contribui geralmente pouco à estrutura e à natureza inteiras de DCAF. Por exemplo, nós usamos este protocolo para sintetizar outras três moléculas de DCAF para alvejar seus anticorpos cognato. Entre eles, DCAF4 foi projetado para bloquear o anticorpo mAb35, que pode neutralizar o receptor de acetilcolina e causar miastenia gravis em um modelo de rato. Nós usamos DCAF4 para reduzir os sintomas clínicos no rato com gravis mAb35-induced da miastenia, e resgatamos o receptor do acetilcholine inibindo as proteínas do componente do complemento.

A aplicação de nossa técnica é limitada por vários fatores: primeiro, o rendimento da molécula de DCAF sintetizado pela abordagem atual é baixo (geralmente menos de 10%) devido às etapas múltiplas da purificação; segundo, os anticorpos com determinantes conformacionais são difíceis de atingir pelo DCAF; em terceiro lugar, DCAF pode induzir a resposta imune extra nos organismos comparados à medicina composta pequena tradicional. Nós imaginamos que a aplicação deste protocolo a outras condições patológicas anticorpo-induzidas ajudará a sintetizar mais moléculas de DCAF ao alvo elimina anticorpos prejudiciais.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pela Universidade Tsinghua-Gates Foundation (não. OPP1021992), a Fundação Nacional da ciência natural de China (no. 21502103, 21877068 e 041301475), e o programa chave nacional da pesquisa e do desenvolvimento de China (no. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

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References

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Retração DCAF terapia direcionada anticorpo ligadura química nativa síntese de peptídeos de fase sólida expressão e purificação de proteínas ELISA
Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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