En enkel tilgang til at udføre TEER målinger ved hjælp af en selv lavet volt-amperemeter med programmerbar Udgangsfrekvens
Summary
Her demonstrerer vi, hvordan man opsætter en billig volt-amperemeter med programmerbar udgangsfrekvens, der kan bruges med kommercielt tilgængelige Chopstick-elektroer til transepithelial/Endothelial elektriske modstands målinger.
Abstract
Transepithelial/Endothelial elektrisk modstand (TEER) har været anvendt siden 1980 ‘ erne til at bestemme konfluency og permeabilitet af in vitro-barriere modelsystemer. I de fleste tilfælde bruges Chopstick elektroder til at bestemme den elektriske impedans mellem det øvre og nedre rum i et cellekultur filter-indsætnings system, der indeholder cellulære monolayers. Filter membranen gør det muligt for cellerne at klæbe, polarisere og interagere ved at bygge stramme kryds. Denne teknik er blevet beskrevet med en række forskellige cellelinjer (f. eks. celler i blod-hjerne barrieren, blod-cerebrospinalvæske barriere, eller gastrointestinale og pulmonale tarmkanalen). TEER-måleanordninger kan let fås fra forskellige leverandører af laboratorieudstyr. Men der er mere omkostningseffektive og tilpasselig løsninger tænkelige, hvis en passende voltammeter er selv samlet. Det overordnede formål med denne publikation er at oprette en pålidelig enhed med programmerbar udgangsfrekvens, der kan anvendes med kommercielt tilgængelige Chopstick elektroderne til måling af TEER.
Introduction
Epitelial og endotelceller fungerer som cellulære grænser, adskille de apiske og basolaterale sider af kroppen. Hvis de er forbundet gennem stramme kryds, er passiv stof diffusion gennem de paracellulære rum begrænset1, hvilket resulterer i dannelsen af en selektivt gennemtrængelig barriere. Flere kunstige barrieresystemer er blevet udviklet2 ved hjælp af microvaskulære endotelceller (hbmec, blod-hjernebarrieren 3,4,5,6,7), chorioideus plexus epiteliale celler (hibcpp/pcpec, blod-cerebrospinalvæske barriere8,9,10,11,12,13,14), kolorektal adenokarcinom celler (CaCO-2, gastrointestinale modeller15), eller luftveje/alveolære cellelinjer (pulmonale modeller16,17). Disse systemer består typisk af celler, der dyrkes i et enkeltlags på gennemtrængelig membraner (dvs. filter indsætnings systemer) for at give adgang til de apiske og basolaterale sider. Det er vigtigt, at model systemets integritet svarer til in vivo-betingelserne. Derfor er flere teknikker blevet udviklet til at analysere barriere funktion ved at måle paracellulær diffusion af Tracer forbindelser på tværs af cellelag. Disse stoffer omfatter radioaktivt mærket saccharose, farvemærket albumin, FITC-mærket inulin eller farvemærket dextrans2. Kemiske farvestoffer kan dog gøre cellerne ubrugelige til yderligere eksperimenter. For at overvåge barrieresystemer ikke-invasivt, måling af transepithelial/transendothelial elektrisk modstand (teer) på tværs af en cellulær enkeltlags kan anvendes2,18,19. Da bipolar elektrode systemer påvirkes af elektrode polariserings impedansen ved elektrode elektrolyt-grænsefladen, anvendes tetrapolære målinger generelt til at overvinde denne begrænsning20. Underlægnings teknikken er en fire-Terminal sensing (4T), der først blev beskrevet i 1861 af William Thomson (Lord Kelvin)21. Kort fortalt indsprøjtes strømmen af et par strømbærende elektroder, mens et andet par spændings målings elektroer bruges til at måle spændingsfaldet20. I dag består de såkaldte Chopstick-elektroder af et par dobbelte elektroder, som hver indeholder en sølv/sølv-chloridpellet til måling af spænding og en sølv elektrode til at passere strøm2. Den elektriske impedans måles mellem det apiske og det basolaterale rum med cellelag i mellem (figur 1). Et kvadrat bølge signal med en frekvens på typisk 12,5 Hz påføres ved de ydre elektroder og den resulterende vekselstrøm (AC) målt. Desuden måles det potentielle fald på tværs af cellelaget af det andet (indre) elektrode par. Elektrisk impedans beregnes derefter i henhold til Ohm’s lov. TEER-værdier normaliseres ved at multiplicere impedans og cellelag overfladeareal og udtrykkes typisk som Ω ∙ cm2.
Der er systemer, hvor cellerne og elektroderne er arrangeret på en mere sofistikeret måde, men er også baseret på 4T-Måleprincippet og kan bruges med de samme måleanordninger. EndOhm systemer, for eksempel, hvor filteret er indsat, indeholder et kammer og hætte med et par koncentriske elektroder med samme struktur som Chopstick elektroden. Formen af elektroderne giver mulighed for en mere ensartet strømtæthed flow over membranen og derved reducere variation mellem aflæsninger. Endnu mere kompleks (men også mere præcis) er et Ussing kammer, hvor et celle lag adskiller to kamre fyldt med Ringer’s Solution22. Selve kammeret kan gasses med oxygen, CO2eller N2og omrøres eller suppleres med eksperimentelle stoffer. Som iontransporten på tværs af cellelaget opstår, kan en potentiel forskel måles ved to spændings følende elektroder i nærheden af vævet. Denne spænding er annulleret af to strømbærende elektroder placeret ved siden af cellelag. Den målte strøm vil derefter give netto iontransporten og den transepitheliale modstand, som afspejler barriere integriteten, kan bestemmes22. Teer måling kan også anvendes på Body-on-a-chip systemer, der repræsenterer barriere-vævs modeller23,24. Disse systemer efterligner in vivo betingelser af cellerne og består ofte af flere typer celler, stablet oven på hinanden i lag.
Følgende protokol forklarer, hvordan man konfigurerer en omkostningseffektiv og pålidelig voltammeter med programmerbar udgangsfrekvens, der ikke producerer statistisk signifikante forskelle i TEER sammenlignet med kommercielt tilgængelige målesystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Før en selvstændig lavet voltammeter kan bruges i en daglig rutine, er det vigtigt at kontrollere enheden for korrekt funktion. I vores tilfælde, en halv-tid af svingning af 40 MS (12,5 Hz) var programmeret, men den effektive svingning tid viste sig at være 60 MS (16,7 Hz). Denne unøjagtighed af mikrocontrollerens tids emitter havde ingen påviselige virkninger på TEER målingerne. Det kan være bedst at bestemme den faktiske frekvens ved hjælp af frekvens indstillingen for en af multimetre. Hvis der findes en afv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Herman Liggesmeyer og Marvin bende for deres ekspertrådgivning inden for Elektroteknik og informatik.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
