Her demonstrerer vi hvordan man setter opp en billig volt-amperemeter med programmerbare utgangsfrekvens som kan brukes med kommersielt tilgjengelige chopstick elektroder for transepitelial/endothelial elektriske motstandsmålinger.
Transepitelial/endothelial elektrisk motstand (frivillig) har vært brukt siden 1980-tallet for å fastslå confluency og permeabilitet av in vitro barriere modellsystemer. I de fleste tilfeller er chopstick elektroder brukes til å bestemme den elektriske impedans mellom øvre og nedre rom i en cellekultur filter sett system som inneholder cellulære monolagere. Filter membranen gjør det mulig for cellene å følge, polariserer og samhandle ved å bygge tette veikryss. Denne teknikken har blitt beskrevet med en rekke forskjellige cellelinjer (f. eks, celler av blod-hjerne-barriere, blod-spinalvæske barriere, eller Gastrointestinal og lunge skrift). FRIVILLIG måle enheter kan lett fås fra ulike laboratorie utstyrsleverandører. Men det er mer kostnadseffektive og tilpassbare løsninger tenkelige hvis en passende voltammeter er selv-montert. Det overordnede målet med denne publikasjonen er å sette opp en pålitelig enhet med programmerbar utgangsfrekvens som kan brukes med kommersielt tilgjengelige chopstick elektroder for frivillig-måling.
Epitel og endothelial celler fungerer som cellulære grenser, skille apikale og basolateral sider av kroppen. Hvis de er koblet sammen gjennom tette kryss, passiv substans diffusjon gjennom paracellular mellomrom er begrenset1, noe som resulterer i dannelsen av en selektivt gjennomtrengelig barriere. Flere kunstige barriere systemer har blitt utviklet2 bruker mikrovaskulær endothelial celler (HBMEC, Blood-Brain barriere3,4,5,6,7), akkord plexus epitelceller (HIBCPP/PCPEC, blod-spinalvæske barriere8,9,10,11,12,13,14), tykk adenokarsinom celler (caco-2, gastrointestinale modeller15), eller luftveis/alveolære cellelinjer (lunge modeller16,17). Disse systemene består vanligvis av celler dyrket i en monolag på gjennomtrengelig membraner (dvs. filter sette systemer) for å gi tilgang til apikale og basolateral sider. Det er viktig at integriteten til modell systemet matcher in vivo-forholdene. Derfor har flere teknikker er utviklet for å analysere barrierefunksjon ved å måle paracellular diffusjon av Tracer forbindelser på tvers av celle laget. Disse stoffene inkluderer radiolabeled sukrose, Dye-merket albumin, FITC-merket inulin, eller Dye-merket dextrans2. Kjemiske fargestoffer kan imidlertid gjøre celler ubrukelige for videre eksperimenter. For å overvåke barriere systemer invasivt, måling av transepitelial/transendothelial elektrisk motstand (frivillig) over en mobil monolag kan brukes2,18,19. Fordi bipolar elektrode systemer er påvirket av elektroden polarisering impedans på elektroden-elektrolytt grensesnitt, tetrapolar målinger er vanligvis brukt til å overvinne denne begrensningen20. Den underliggende teknikken er en fire-Terminal sensing (4T) som først ble beskrevet i 1861 av William Thomson (Lord Kelvin)21. I korte trekk er strømmen injisert med et par strømførende elektroder, mens et ekstra par spenningssensor elektroder brukes til å måle spenningsfall20. I dag, såkalte chopstick elektroder består av et par doble elektroder, som hver inneholder en sølv/sølv-klorid pellet for måling av spenning og en sølv elektrode for bestått strøm2. Den elektriske impedans måles mellom apikale og basolateral rommet med celle laget i mellom (figur 1). En firkantbølge signal med en frekvens på typisk 12,5 Hz påføres på de ytre elektrodene og den resulterende vekselstrøm (AC) målt. I tillegg måles den potensielle dråpe over celle laget av det andre (indre) elektrode paret. Elektrisk impedans beregnes deretter i henhold til ohm ‘ s lov. FRIVILLIG verdier er normalisert ved å multiplisere impedans og celle lag overflateareal og er vanligvis uttrykt som Ω ∙ cm2.
Det finnes systemer der celler og elektroder er ordnet på en mer sofistikert måte, men er også basert på 4T måle prinsippet og kan brukes med samme måle enheter. EndOhm-systemer, for eksempel, der filteret er satt inn, inneholder et kammer og lokk med et par konsentriske elektroder med samme struktur som chopstick elektroden. Formen på elektrodene gjør det mulig for en mer ensartet nåværende tetthet flyt over membranen, og dermed redusere variasjon mellom målingene. Enda mer kompleks (men også mer nøyaktig) er en ussing kammer, der et celle lag skiller to kamre fylt med ringer løsning22. Kammeret i seg selv kan være gasset med oksygen, CO2, eller N2, og rørt eller supplert med eksperimentelle stoffer. Som ion transport over celle laget oppstår, en potensiell forskjell kan måles ved to spennings-sensing elektroder nær vevet. Denne spenningen avbrytes av to strømførende elektroder plassert ved siden av celle laget. Den målte strøm vil da gi netto ion transport og transepitelial motstand, noe som reflekterer barriere integritet, kan bestemmes22. Frivillig måling kan også påføres på Body-on-a-chip systemer som representerer barriere-vev modeller23,24. Disse systemene etterligner i vivo forhold i cellene og ofte består av flere typer celler, stablet oppå hverandre i lag.
Følgende protokoll forklarer hvordan du setter opp en kostnadseffektiv og pålitelig voltammeter med programmerbar utgangsfrekvens som produserer ingen statistisk signifikante forskjeller i frivillig sammenlignet med kommersielt tilgjengelige målesystemer.
Før en selv laget voltammeter kan brukes i en daglig rutine, er det viktig å sjekke enheten for riktig funksjon. I vårt tilfelle var en halv tid for pendling av 40 MS (12,5 Hz) programmert, men den effektive pendling tiden viste seg å være 60 MS (16,7 Hz). Dette unøyaktigheter i microcontroller tid emitter hadde ingen merkbar innvirkning på frivillig målinger. Det kan være best å finne den faktiske frekvensen ved hjelp av frekvensinnstillingen for en av multimetre. Hvis det blir funnet avvik, kan kildekoden jus…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Herman Liggesmeyer og Marvin bende for deres faglige råd i electrotechnics og informatikk.
120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
Cables | General (generic) equipment | ||
Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
Crimping tool | General tool | ||
Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
Insulation stripper | General tool | ||
Luster terminal | General (generic) equipment | ||
Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
Soldering iron | General tool | ||
Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
USB charger | General (generic) equipment | ||
USB extension cord | General (generic) equipment | ||
Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
Wire end ferrules | General (generic) equipment |