Burada, transepitelyal/endotel elektriksel direnç ölçümleri için piyasada bulunan çubuk elektrotlarla kullanılabilen programlanabilir çıkış frekansına sahip ucuz bir volt-ampermetrenin nasıl kurulabileceğini gösteriyoruz.
Transepitelyal/endotel elektriksel direnç (TEER) 1980’lerden beri in vitro bariyer model sistemlerinin birbirliğini ve geçirgenliğini belirlemek için kullanılmaktadır. Çoğu durumda, çubuk elektrotlar hücresel monolayers içeren bir hücre kültürü filtre eklemek sisteminin üst ve alt bölme arasındaki elektrik empedansını belirlemek için kullanılır. Filtre membranı, hücrelerin sıkı kavşaklar oluşturarak yapışmasını, polarize olmasını ve etkileşimde olmasını sağlar. Bu teknik farklı hücre hatları çeşitli ile tarif edilmiştir (örneğin, kan-beyin bariyerhücreleri, kan-beyin-omurilik sıvı bariyeri, veya gastrointestinal ve akciğer yolu). TEER ölçüm cihazları farklı laboratuvar ekipmanları tedarikçilerinden kolayca temin edilebilir. Ancak, uygun bir voltammetre kendi kendine monte edilirse hayal daha uygun maliyetli ve özelleştirilebilir çözümler vardır. Bu yayının genel amacı, TEER ölçümü için ticari olarak kullanılabilen çubuk elektrotlarla kullanılabilecek programlanabilir çıkış frekansına sahip güvenilir bir cihaz kurmaktır.
Epitel ve endotel hücreleri hücresel sınırlar olarak işlev, vücudun apikal ve bazolateral taraf ayıran. Eğer sıkı kavşaklar aracılığıyla bağlanırsa, parasellüler alanlardapasif madde difüzyonu sınırlıdır1, seçici geçirgen bir bariyer oluşumu ile sonuçlanan. Çeşitli yapay bariyer sistemleri 2 mikrovasküler endotel hücreleri kullanılarakgeliştirilmiştir (HBMEC, kan-beyin bariyeri3,4,5,6,7), koroid pleksus epitel hücreleri (HIBCPP/PCPEC, kan-beyin-omurilik sıvısıbariyeri 8,9,10,11,12,13,14), kolorektal adenokarsinom hücreleri (Caco-2, gastrointestinal modeller15), veya hava yolu/alveoler hücre hatları (pulmoner modeller16,17). Bu sistemler genellikle geçirgen membranlar üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerden oluşur (yani, filtre ekleme sistemleri) apikal ve bazolateral kenarlara erişim sağlamak için. Model sisteminin bütünlüğünün in vivo koşullarla eşleşmesi önemlidir. Bu nedenle, hücre tabakası boyunca izleyici bileşiklerinin parasellüler difüzyon ölçerek bariyer fonksiyonunu analiz etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu maddeler radyoetiketli sakaroz, boya etiketli albumin, FITC etiketli inulin veya boya etiketli dekstrans2içerir. Ancak, kimyasal boyalar hücreleri daha fazla deney için kullanılamaz hale getirebilir. Bariyer sistemlerini noninvaziv olarak izlemek için hücresel monotabaka boyunca transepitelyal/transendolyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü2,18,19kullanılabilir. Bipolar elektrot sistemleri elektrot-elektrolit arabirimindeki elektrot polarizasyon empedanstan etkilendiği için, tetrapolar ölçümler genellikle bu sınırlamayı aşmak için kullanılır20. Altatma tekniği ilk William Thomson (Lord Kelvin)21tarafından 1861 yılında açıklanan dört terminalli algılama (4T) olduğunu. Kısacası, akım akım taşıyan elektrotlar bir çift tarafından enjekte edilirken, gerilim ingvesini ölçmek için ikinci bir çift voltaj algılama elektrotları kullanılır20. Günümüzde, sözde çubuk elektrotlar çift elektrotlar bir çift oluşur, her gerilim ölçmek için bir gümüş / gümüş-klorür pelet içeren veakım2 geçmek için gümüş elektrot. Elektriksel empedans, apikal ve bazolateral bölme arasında ölçülür ve hücre tabakası arasındadır (Şekil 1). Dış elektrotlara tipik olarak 12,5 Hz frekansta kare dalga sinyali uygulanır ve ortaya çıkan alternatif akım (AC) ölçülür. Ayrıca, hücre tabakası boyunca potansiyel düşüş ikinci (iç) elektrot çifti ile ölçülür. Elektrikempdansı Daha sonra Ohm yasasına göre hesaplanır. TEER değerleri empedans ve hücre tabakası yüzey alanının çarpılmasıyla normalleşir ve genellikle Ω olarak ifade edilir .
Hücrelerin ve elektrotların daha sofistike bir şekilde düzenlendiği, ancak aynı zamanda 4T ölçüm prensibine dayandığı ve aynı ölçüm cihazlarıyla kullanılabildiği sistemler vardır. Örneğin, filtrenin yerleştirildiği EndOhm sistemleri, çubuk elektrotla aynı yapıya sahip bir çift konsantrik elektrotiçeren bir hazne ve kapak içerir. Elektrotların şekli membran boyunca daha düzgün bir akım yoğunluğu akışı sağlar, böylece okumalar arasındaki değişimi azaltır. Daha da karmaşık (ama aynı zamanda daha doğru) bir Hücre tabakası Ringer çözeltisi22ile dolu iki oda ayırır bir Ussing odası vardır. Oda kendisi oksijen ile gazlı olabilir, CO2, veya N2, ve karıştırılır veya deneysel maddeler ile takviye. Hücre tabakası boyunca iyon taşıması meydana geldiğinde, potansiyel bir fark doku ya da yakın iki voltaj algılama elektrotları ile ölçülebilir. Bu voltaj, hücre tabakasının yanına yerleştirilen iki akım taşıyan elektrot tarafından iptal edilir. Ölçülen akım daha sonra net iyon taşıma ve bariyer bütünlüğünü yansıtan transepitelyal direnç verecek,22belirlenebilir. TEER ölçümü, bariyer doku modellerini temsil eden çip üzerine vücut sistemlerinde de uygulanabilir23,24. Bu sistemler hücrelerin in vivo koşullarını taklit eder ve genellikle katmanlar halinde üst üste yığılmış çeşitli hücre türlerinden oluşur.
Aşağıdaki protokol, teer’de ticari olarak kullanılabilen ölçüm sistemlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı fark lar üreten programlanabilir çıkış frekansına sahip uygun maliyetli ve güvenilir bir voltammetrenin nasıl kurulabildiğini açıklamaktadır.
Kendi kendine yapılmış bir voltammetre günlük rutin kullanılabilir önce, uygun işlev için cihaz kontrol etmek esastır. Bizim olgumuzda, 40 ms (12.5 Hz) salınım ın yarı zamanlı olarak programlanmasına karşın, etkili salınım süresi 60 ms (16.7 Hz) olarak ortaya çıktı. Mikrodenetleyicinin zaman yayıcısının bu yanlışlığı TEER ölçümleri üzerinde tespit edilebilir bir etki yaratmaz. Çoklu metrelerden birinin frekans ayarını kullanarak gerçek frekansı belirlemek en iyisi olabilir. Herha…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Elektroteknik ve bilişim konusunda uzman tavsiyeleri için Herman Liggesmeyer ve Marvin Bende teşekkür etmek istiyorum.
120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
Cables | General (generic) equipment | ||
Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
Crimping tool | General tool | ||
Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
Insulation stripper | General tool | ||
Luster terminal | General (generic) equipment | ||
Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
Soldering iron | General tool | ||
Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
USB charger | General (generic) equipment | ||
USB extension cord | General (generic) equipment | ||
Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
Wire end ferrules | General (generic) equipment |