Un approccio semplice per eseguire misurazioni TEER utilizzando un Amperemetro Volt-Amperemeter self-made con frequenza di uscita programmabile
Summary
Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.
Abstract
La resistenza elettrica transeteliale/endoteliale (TEER) è stata utilizzata fin dagli anni ’80 per determinare la confluenza e la permeabilità dei sistemi modello di barriera in vitro. Nella maggior parte dei casi, gli elettrodi delle bacchette vengono utilizzati per determinare l’impedimento elettrico tra il compartimento superiore e inferiore di un sistema di inserimento del filtro di coltura cellulare contenente monostrati cellulari. La membrana del filtro consente alle cellule di aderire, polarizzare e interagire costruendo giunzioni strette. Questa tecnica è stata descritta con una varietà di diverse linee cellulari (ad esempio, cellule della barriera emato-encefalica, barriera del liquido emato-cerebrospinale, o tratto gastrointestinale e polmonare). I dispositivi di misura TEER possono essere facilmente ottenuti da diversi fornitori di apparecchiature di laboratorio. Tuttavia, ci sono soluzioni più convenienti e personalizzabili immaginabili se un voltametro appropriato è auto-assemblato. L’obiettivo generale di questa pubblicazione è quello di creare un dispositivo affidabile con una frequenza di uscita programmabile che possa essere utilizzato con elettrodi di bacchetta disponibili in commercio per la misurazione TEER.
Introduction
Le cellule epiteliali ed endoteliali funzionano come confini cellulari, separando i lati apicali e basolaterali del corpo. Se sono collegati attraverso giunzioni strette, la diffusione passiva della sostanza attraverso gli spazi paracellulari è limitata1, con conseguente formazione di una barriera selettivamente permeabile. Diversi sistemi di barriera artificiale sono stati sviluppati2 utilizzando cellule endoteliali microvascolari (HBMEC, barriera emato-encefalica3,4,5,6,7), plexus coroide cellule epiteliali (HIBCPP/PCPEC, barriera del liquido emato-cerebrospinale8,9,10,11,12,13,14), cellule adenocarcinoma colorettali (Caco-2, modelli gastrointestinali15) o linee cellulari delle vie aeree/alveolari (modellipolmonari 16,17). Questi sistemi sono in genere costituiti da cellule coltivate in un monostrato su membrane permeabili (cioè sistemi di inserimento filtranti) per consentire l’accesso ai lati apicali e basolaterali. È importante che l’integrità del sistema modello corrisponda alle condizioni in vivo. Di conseguenza, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la funzione della barriera misurando la diffusione paracellulare di composti tracciari in tutto lo strato cellulare. Queste sostanze includono saccarosio radioetichettato, albumina con etichettatura colorante, inulina etichettata FITC o dextrans2con etichettatura colorante. Tuttavia, i coloranti chimici possono rendere le cellule inutilizzabili per ulteriori esperimenti. Per monitorare in modo non invasivo i sistemi di barriera, è possibile utilizzare la misurazione della resistenza elettrica transepitelia/transendotiliale (TEER) su un mostrato cellulare2,18,19. Poiché i sistemi elettrodi bipolari sono influenzati dall’impedimento della polarizzazione degli elettrodi nell’interfaccia elettrodi-elettrolita, le misurazioni tetrapolari sono generalmente utilizzate per superare questa limitazione20. La tecnica di posa è un rilevamento a quattro terminali (4T) che è stato descritto per la prima volta nel 1861 da William Thomson (Lord Kelvin)21. In breve, la corrente viene iniettata da una coppia di elettrodi che trasportano corrente, mentre una seconda coppia di elettrodi di rilevamento della tensione viene utilizzata per misurare la caduta di tensione20. Al giorno d’oggi, i cosiddetti elettrodi di bacchetta consistono in un paio di doppi elettrodi, ciascuno contenente un pellet argento/argento-cloruro per misurare la tensione e un elettrodo d’argento per passare la corrente2. L’impementazione elettrica viene misurata tra il compartimento apicale e il compartimento basolaterale con lo strato di cella in mezzo (Figura 1). Un segnale d’onda quadra a una frequenza di typically 12,5 Hz viene applicato agli elettrodi esterni e la corrente alternata risultante (AC) misurata. Inoltre, la potenziale caduta nello strato cellulare viene misurata dalla seconda coppia di elettrodi (interni). L’impedimento elettrico viene quindi calcolato secondo la legge di Ohm. I valori di TEER sono normalizzati moltiplicando impedimento e superficie dello strato cellulare e sono in genere espressi come cm 2.
Ci sono sistemi in cui le cellule e gli elettrodi sono disposti in modo più sofisticato, ma sono anche basati sul principio di misurazione 4T e possono essere utilizzati con gli stessi dispositivi di misurazione. I sistemi EndOhm, ad esempio, in cui è inserito il filtro, contengono una camera e un cappuccio con un paio di elettrodi concentrici con la stessa struttura dell’elettrodo della bacchetta. La forma degli elettrodi consente un flusso di densità di corrente più uniforme attraverso la membrana, riducendo così la variazione tra le letture. Ancora più complessa (ma anche più precisa) è una camera Ussing, dove uno strato di cellule separa due camere piene di soluzione di Ringer22. La camera stessa può essere gassata con ossigeno, CO2o N2e mescolata o integrata con sostanze sperimentali. Quando si verifica il trasporto io-io attraverso lo strato cellulare, una differenza potenziale può essere misurata da due elettrodi di rilevamento della tensione vicino al tessuto. Questa tensione viene cancellata da due elettrodi che trasportano corrente posizionati accanto allo strato cellulare. La corrente misurata darà quindi il trasporto iollegrafico netto e la resistenza transeteliale, che riflette l’integrità della barriera, può essere determinata22. La misurazione TEER può essere applicata anche su sistemi body-on-a-chip che rappresentano modelli di tessuto di barriera23,24. Questi sistemi imitano le condizioni in vivo delle cellule e spesso consistono in diversi tipi di cellule, impilate l’una sull’altra in strati.
Il protocollo seguente spiega come impostare un misuratore di calcolo affidabile e conveniente con una frequenza di output programmabile che non produca differenze statisticamente significative nel TEER rispetto ai sistemi di misurazione disponibili in commercio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prima che un voltametro autoprodotto possa essere utilizzato in una routine quotidiana, è essenziale controllare il dispositivo per il corretto funzionamento. Nel nostro caso, un mezzo tempo di oscillazione di 40 ms (12,5 Hz) è stato programmato, ma il tempo di oscillazione effettivo si è rivelato essere 60 ms (16,7 Hz). Questa imprecisione dell’emettitore di tempo del microcontrollore non ha avuto alcun impatto rilevabile sulle misurazioni TEER. Potrebbe essere meglio determinare la frequenza effettiva utilizzando l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Herman Liggesmeyer e Marvin Bende per la loro consulenza di esperti in elettrotecnica e informatica.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
