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Biology

Une approche simple pour effectuer des mesures TEER à l'aide d'une Volt-Amperemètre auto-faite avec fréquence de sortie programmable

doi: 10.3791/60087 Published: October 5, 2019

Summary

Ici, nous démontrons comment mettre en place un volt-amperemètre bon marché avec la fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour les mesures de résistance électrique transépithéliale/endothéliale.

Abstract

La résistance électrique transépithéliale/endothéliale (TEER) est utilisée depuis les années 1980 pour déterminer la confluence et la perméabilité des systèmes de modèles de barrières in vitro. Dans la plupart des cas, des électrodes de baguette sont employées pour déterminer l'empedance électrique entre le compartiment supérieur et inférieur d'un système d'insertion de filtre de culture cellulaire contenant des monocouches cellulaires. La membrane du filtre permet aux cellules d'adhérer, de polariser et d'interagir en construisant des jonctions serrées. Cette technique a été décrite avec une variété de différentes lignées cellulaires (par exemple, les cellules de la barrière hémato-encéphalique, la barrière du liquide céphalo-rachidien, ou le tractus gastro-intestinal et pulmonaire). Les dispositifs de mesure TEER peuvent être facilement obtenus auprès de différents fournisseurs d'équipement de laboratoire. Cependant, il existe des solutions plus rentables et personnalisables imaginables si un voltammètre approprié est auto-assemblé. L'objectif global de cette publication est de mettre en place un dispositif fiable avec une fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour la mesure TEER.

Introduction

Les cellules épithéliales et endothéliales fonctionnent comme des limites cellulaires, séparant les côtés apaïques et basolatéraux du corps. S'ils sont reliés par des jonctions serrées, la diffusion passive de substance s'est étendue1,ce qui entraîne la formation d'une barrière sélectivement perméable. Plusieurs systèmes de barrière artificielle ont été développés2 utilisant des cellules endothéliales microvasculaires (HBMEC, barrière hémato-encéphalique3,4,5,6,7), plexus choroïde cellules épithéliales (HIBCPP/PCPEC, barrière de liquide céphalo-céphalo-céphalo-rachidien8,9,10,11,12,13,14), cellules d'adénocarcinome colorectal (Caco-2, modèles gastro-intestinaux15), ou lignes de cellules alvéolaires (modèles pulmonaires16,17). Ces systèmes sont généralement constitués de cellules cultivées en monocouches sur des membranes perméables (c.-à-d. des systèmes d'insertion de filtre) pour permettre l'accès aux côtés apical et basolatéral. Il est important que l'intégrité du système de modèle corresponde aux conditions in vivo. Par conséquent, plusieurs techniques ont été développées pour analyser la fonction de barrière en mesurant la diffusion paracellulaire des composés de traceur à travers la couche cellulaire. Ces substances comprennent le saccharose radio-étiqueté, l'albumine étiquetée par colorant, l'inuline étiquetée FITC ou le dextrans étiqueté colorant2. Cependant, les colorants chimiques peuvent rendre les cellules inutilisables pour d'autres expériences. Pour surveiller les systèmes de barrière de manière non invasive, la mesure de la résistance électrique transépithéliale/transendothéliale (TEER) à travers une monocouche cellulaire peut être utilisée2,18,19. Étant donné que les systèmes d'électrodes bipolaires sont influencés par l'impedance de polarisation par électrode à l'interface électrode-électrolyte, les mesures tétrapolaires sont généralement utilisées pour surmonter cette limitation20. La technique de sous-imposition est une détection à quatre terminaux (4T) qui a été décrite pour la première fois en 1861 par William Thomson (Lord Kelvin)21. En bref, le courant est injecté par une paire d'électrodes porteuses de courant tandis qu'une deuxième paire d'électrodes de détection de tension est utilisée pour mesurer la chute de tension20. Aujourd'hui, les électrodes dites baguettes se composent d'une paire de doubles électrodes, chacune contenant une pastille argentée/argent-chlorure pour mesurer la tension et une électrode argentée pour passer le courant2. L'impédance électrique est mesurée entre l'apical et le compartiment basolatéral avec la couche cellulaire entre les deux (Figure 1). Un signal d'onde carréà une fréquence généralement de 12,5 Hz est appliqué aux électrodes extérieures et le courant alternatif résultant (AC) mesuré. En outre, la chute potentielle à travers la couche cellulaire est mesurée par la deuxième paire d'électrodes (intérieures). L'impédance électrique est alors calculée selon la loi d'Ohm. Les valeurs TEER sont normalisées en multipliant l'impédance et la surface de la couche cellulaire et sont généralement exprimées en cm2.

Il existe des systèmes dans lesquels les cellules et les électrodes sont disposées d'une manière plus sophistiquée, mais sont également basées sur le principe de mesure 4T et peuvent être utilisées avec les mêmes dispositifs de mesure. Les systèmes EndOhm, par exemple, dans lesquels le filtre est inséré, contiennent une chambre et un bouchon avec une paire d'électrodes concentriques avec la même structure que l'électrode de baguette. La forme des électrodes permet un flux de densité de courant plus uniforme à travers la membrane, réduisant ainsi la variation entre les lectures. Encore plus complexe (mais aussi plus précis) est une chambre Ussing, où une couche cellulaire sépare deux chambres remplies de la solution de Ringer22. La chambre elle-même peut être gazée avec de l'oxygène, CO2, ou N2, et remué ou complété avec des substances expérimentales. Comme le transport d'ions à travers la couche cellulaire se produit, une différence potentielle peut être mesurée par deux électrodes de détection de tension près du tissu. Cette tension est annulée par deux électrodes transportant le courant placées à côté de la couche cellulaire. Le courant mesuré donnera alors le transport d'ion net et la résistance transépithéliale, qui reflète l'intégrité de barrière, peut être déterminée22. La mesure TEER peut également être appliquée sur les systèmes corps-sur-une puce qui représentent les modèles de tissu barrière23,24. Ces systèmes imitent les conditions in vivo des cellules et se composent souvent de plusieurs types de cellules, empilées les unes sur les autres en couches.

Le protocole suivant explique comment mettre en place un voltammètre rentable et fiable avec une fréquence de sortie programmable qui ne produit aucune différence statistiquement significative dans LE TEER par rapport aux systèmes de mesure disponibles dans le commerce.

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Protocol

1. Assemblage d'un volt-ampermètre de base pour la mesure TEER

  1. Préparer un chargeur USB standard comme l'alimentation de 5 V D.C., une rallonge USB, un microcontrôleur qui sera utilisé comme un générateur d'ondes carrées programmables, deux multimètres standard qui sont en mesure de mesurer le courant alternatif et la tension comme carré moyen racine ( True-RMS), quatre câbles avec des bouchons de banane, une rallonge téléphonique avec un connecteur femelle RJ14 dont six broches avec les quatre câbles intérieurs (6P4C), deux câbles courts, un terminal de lustre, un pré-résiliateur de 120 kô, ferrules d'extrémité de fil, et des pattes de soudure. Les outils nécessaires sont une décapante d'isolation, un outil de sertissage et un fer à souder.
  2. Tout d'abord, connectez l'extension USB au tableau de microcontrôleur.
  3. Dénuder l'isolation d'extrémité de deux câbles courts. Souder un côté par câble soit directement aux broches 0 et 2 du microcontrôleur ou à la soudure pattes, qui à leur tour sont coupés sur les broches respectives. Crimp les autres extrémités à l'extrémité du fil ferrules et les connecter à un terminal de lustre comme décrit dans la figure 1.
  4. Reliez les bouchons de banane aux multimètres. Dénuder et sertir l'autre extrémité de chacun des quatre câbles.
  5. Couper la rallonge téléphonique en deux morceaux et démonter et sertir les conducteurs du côté contenant le connecteur femelle. Vérifiez la continuité des conducteurs et des broches.
  6. Le premier multimètre sera utilisé pour mesurer le courant en A (à noter que le mode AC doit être réglé explicitement). Connectez-le dans une série avec un pré-résiliateur de 120 kô pour épingler cinq et six du connecteur RJ14, correspondant à la paire d'électrodes externes de l'électrode baguette.
  7. Enfin, reliez le deuxième multimètre, qui sera utilisé pour mesurer la baisse de tension transépithéliale en mV, via le terminal de lustre pour épingler trois et quatre du connecteur RJ14, correspondant à la paire d'électrodes intérieures de l'électrode baguette.
  8. Si vous le souhaitez, montez l'installation dans un châssis.

2. Programmation du microcontrôleur

  1. Modifier le code source fourni (fichier de codage supplémentaire 1) au besoin. Sous la forme donnée, les broches 0 et 2 alterneront entre le sol et le 5 V avec 40 ms à la mi-temps de l'oscillation. Ainsi, un signal d'onde carréavec une amplitude de 5 V et une fréquence d'environ 12,5 Hz sera généré. Les valeurs réelles peuvent différer en raison de l'inexactitude de l'émetteur de temps du microcontrôleur.
  2. Connectez le microcontrôleur à un ordinateur de bureau via un port USB et téléchargez le code source avec un logiciel correspondant25.

3. Enregistrement des oscillogrammes de tension (facultatif)

  1. Les broches de contournement cinq et six du connecteur RJ14 avec une résistance de test de 1 kô et se connectent à un oscilloscope.
  2. Vérifiez la fréquence, la tension de pointe et la forme d'onde. Numériser et exporter les données.
  3. Si vous le souhaitez, enregistrez les oscillogrammes d'un dispositif de référence (EVOM) et le voltammètre auto-assemblé à des fins de comparaison.
    REMARQUE : Dans ce cas, les données ont été enregistrées avec une portée de stockage numérique HM 208. Étant un oscilloscope numérique très basique, l'image pouvait être numérisée en interne (congelée) mais devait être tracée à l'aide d'un enregistreur analogique PM 8143 X-Y. L'image a ensuite été numérisée.

4. Culture cellulaire et mesure TEER

  1. Seed Human Choroid Plexus Papilloma (HIBCPP) cellules sur les inserts de filtre de culture cellulaire avec une taille de pores de 3 m dans DMEM/F12 (voir Tableau des matériaux) contenant 10% de sérum fœtal de veau9. Cultivez les cellules à 37 oC dans une atmosphère saturée d'eau contenant 5 % de CO2 tel que décrit par Dinner et al.9.
  2. Lorsque les filtres atteignent une impédance de 70 cm2,changez en DMEM/F12 sans sérum et définissez le point de temps comme le jour 0.
  3. Connectez l'électrode au port RJ14 du voltammètre auto-assemblé et branchez l'alimentation USB. Définir les multimètres en mode de tension AC (mV) et mode de courant AC (A), respectivement.
    1. Vous pouvez également connecter l'électrode à un dispositif de référence disponible dans le commerce et allumer selon les instructions du fabricant.
  4. Stériliser l'électrode dans 80 % d'éthanol pendant 10 min et réquilibrer dans le milieu approprié pendant 10 min.
  5. Placez l'électrode dans les deux compartiments d'un système d'insertion de filtre de culture cellulaire (la partie la plus longue de l'électrode dans le compartiment inférieur et la partie plus courte dans le compartiment supérieur) contenant une couche cellulaire HIBCPP jusqu'à ce que les valeurs de mesure restent constantes.
  6. Pour un dispositif de référence, notez l'impédance directement ou calculez l'impédance selon la loi d'Ohm (R et U/I) pour le voltammètre auto-assemblé. Soyez conscient que l'angle d'électrode affecte les mesures.
  7. Répétez la mesure TEER (étapes 3 à 6) du jour 0 jusqu'au jour 4.

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Representative Results

Pour comparer le fonctionnement d'un voltammètre auto-assemblé avec son homologue disponible dans le commerce, un oscillogramme de tension des deux appareils a été enregistré.

Comme le montre la figure 2A, l'instrument de référence a généré un signal d'onde carré avec une amplitude de 80 mV et un temps d'oscillation de 80 ms, ce qui correspond à une fréquence de 12,5 Hz, lorsqu'il fonctionne sur charge avec une résistance d'essai de 1 k.

En revanche, le microcontrôleur de l'appareil auto-assemblé a commuté la tension d'alimentation à un signal d'onde carré avec une amplitude de 5 V (figure 2B) si aucun pré-résistance n'a été mis en. Il est devenu évident que le courant qui en résulte détruit toute fonction de barrière et n'est pas applicable aux expériences de culture cellulaire (données non montrées). Un autre problème est que, dans cette configuration, une résistance de test de 1 k a causé une surcharge avec une baisse de tension résultante (Figure 2B). En outre, le temps d'oscillation effectif du microcontrôleur était de 60 ms (fréquence à 16,7 Hz) et différait ainsi du délai programmé en raison de l'inexactitude de l'émetteur de temps. Si un prérésistant de 120 kô a été installé, l'amplitude a diminué à une valeur de 40 mV, ce qui convenait à la culture cellulaire (figure 2C). Comme on l'a vu dans l'oscillogramme, le rapport signal-bruit a été considérablement altéré (figure 2C) mais n'a pas eu d'incidence notable sur les mesures.

Les deux dispositifs ont été utilisés pour déterminer l'impédance d'une barrière artificielle de liquide céphalo-céphalo-céphalo-céphalo-rachidien (diagramme de circuit simplifié illustré dans la figure 2D). Les cellules HIBCPP ont été cultivées sur des inserts de filtre de culture cellulaire et TEER a été mesurée sur 6 jours : commençant un jour avant que les cellules soient déplacées aux conditions sériques-libres (jour -1) et jusqu'à 4 jours après changement le milieu (jour 4). Toutes les mesures ont été effectuées dans des quadruplicates à l'aide de quatre filtres HIBCPP préparés de la même manière. Des valeurs similaires ont été obtenues pour l'instrument de référence et le voltammètre auto-assemblé (figure 3). Les mesures étaient reproductibles, et les écarts types se sitrouvaient dans la même fourchette. Les valeurs de TEER variaient de 20 à 550 euros cm2. À l'aide de filtres de 0,33 cm2, cela équivaut à une impédance absolue de 83 à 1 660 euros.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de mise en page d'un volt-amperemètre de base pour la mesure TEER. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Oscillogrammes et configuration de mesure. (A) EVOM disponible dans le commerce. (B) Voltammètre auto-assemblé sans pré-résistance. (C) Voltammètre auto-assemblé avec 120 k 'pré-résistance. (D) Diagramme de circuit de la configuration de mesure. Notez quel'électrode C n'apparaît dans les circuits électriques que lorsque des systèmes bipolaires sont utilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Mesures TEER des couches cellulaires HIBCPP sur les inserts de filtre de culture cellulaire avant de passer au milieu de culture sans sérum (Jour -1), le jour de la commutation (Jour 0), et jusqu'à 4 jours après (Jours 1 à 4). Les barres d'erreur indiquent l'écart standard des quatre filtres HIBCPP qui ont été préparés de la même manière. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fichier de codage supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

Fichier de codage supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

Fichier de codage supplémentaire 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

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Discussion

Avant qu'un voltammètre self-made puisse être employé dans une routine quotidienne, il est essentiel de vérifier l'appareil pour le fonctionnement approprié. Dans notre cas, un demi-temps d'oscillation de 40 ms (12,5 Hz) a été programmé, mais le temps d'oscillation effectif s'est avéré être de 60 ms (16,7 Hz). Cette inexactitude de l'émetteur de temps du microcontrôleur n'a eu aucun impact détectable sur les mesures TEER. Il pourrait être préférable de déterminer la fréquence réelle en utilisant le réglage de fréquence de l'un des multimètres. Si une déviation est constatée, le code source peut être ajusté en conséquence. En outre, il est fortement recommandé de vérifier si une résistance au test ou d'autres configurations définies donnent des résultats corrects et reproductibles. Si vous travaillez avec des systèmes de barrière cellulaire artificielle, il pourrait être préférable de toujours corréler le flux de molécules avec la mesure de l'impédance.

Dans ce cas, le courant appliqué était limité à l'aide d'un pré-résistance de 120 k. En supposant que les valeurs typiques de TEER varient de 100 à 2 000 euros, la chute de tension sur la couche cellulaire peut être calculée à 4 à 83 mV. Un TEER de 1 kô a été simulé par une résistance d'essai et la chute potentielle qui en a résulté a été confirmée à 40 mV (figure 2C).

Les appareils disponibles dans le commerce fournissent souvent un commutateur de portée de mesure pour basculer le pré-résisteur et limitent ainsi le courant de sortie à des valeurs différentes. Dans ce cas, il est possible d'installer différents pré-résistants ou même de remplacer la résistance par un potentiomètre.

La configuration montrée représente une alternative rentable aux instruments disponibles dans le commerce pour la mesure TEER. Les valeurs mesurées avec le voltammètre auto-assemblé étaient comparables à celles du dispositif de référence sur une large gamme. Il en va de même pour les écarts types. Le bruit dans le signal d'onde carrée n'a pas affecté les mesures notamment. Le protocole peut soutenir les scientifiques qui sont limités par des ressources financières limitées ou qui veulent effectuer des expériences préliminaires à faible coût.

En outre, le microcontrôleur peut être facilement programmé à différentes fréquences de sortie. Cela peut être bénéfique, car l'impédance apparente se compose deR medium, RTEER, ainsi que la capacitéc couche de cellules26 (Figure 2D). En outre,l'électrode C apparaît si des systèmes bipolaires sont utilisés, tandis que l'influence de l'impédance de polarisation d'électrode est réduite dans les systèmes tétrapolaires. Cela signifie que l'impédance mesurée sera dominée par RTEER aux basses fréquences et, dans les systèmes bipolaires, par la capacité des électrodes, alors qu'à haute fréquence l'impédance totale converge vers la résistance du milieu26, 27. Entre les deux, l'impédance est influencée par lacouche cellulaireC, qui est donc accessible à l'aide de spectroscopie électrique d'impédance28.

Nous fournissons deux codes d'exemple (non testés) pour donner une idée de la façon dont l'appareil pourrait être optimisé ou reprogrammé pour différentes applications. Tout d'abord, une spectroscopie d'impédance très basique pourrait être réalisée en alternant la fréquence de sortie dans des intervalles de 20 secondes entre 12,5, 500 et 5000 Hz (fichier de codage supplémentaire 2). Dans ce cas, une électrode tétrapolaire20,28 ou bipolaire27 pourrait être utilisée. La fréquence appliquée peut être indiquée par le multimètre intégré (ou tout affichage ou LED connecté au microcontrôleur). Deuxièmement, l'appareil pourrait être utilisé pour mesurer la conductivité des tampons et des médias. Ceci est généralement fait en utilisant des électrodes tétrapolaires avec des fréquences élevées dans une gamme de 1-110kHz. Le code dans le fichier de codage supplémentaire 3 ne contient pas de délai et (avec notre appareil) a généré une fréquence d'environ 70kHz.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier Herman Liggesmeyer et Marvin Bende pour leurs conseils d'experts en électrotechnique et en informatique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120 kOhm resistor General (generic) equipment
Banana plug cables General (generic) equipment
Cables General (generic) equipment
Chopstick electrode Merck Millicell MERSSTX01
Chopstick electrode (alternative) WPI World Precision Instruments STX2
Crimping tool General tool
Digispark / ATtiny85 AZ-Delivery Vertriebs GmbH Digispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12 Gibco (Thermo Fisher) 31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10270106
Filter inserts 3µm translucent Greiner Bioone 662631
HIBCPP Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripper General tool
Luster terminal General (generic) equipment
Oscilloscope HAMEG Digital Storage Scope HM 208
Plotter PHILIPS PM 8143 X-Y recorder
Software Arduino https://www.arduino.cc Arduino 1.8.9
Soldering iron General tool
Soldering lugs General (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector General (generic) equipment
Test resistor Merck Millicell MERSSTX04
True-RMS multimeters VOLTCRAFT VC185
USB charger General (generic) equipment
USB extension cord General (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurement WPI World Precision Instruments EVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) Merck Millicell ERS
Wire end ferrules General (generic) equipment

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References

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Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).More

Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).

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