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Biology

프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 암페어미터를 사용하여 TEER 측정을 수행하는 간단한 접근 방식

doi: 10.3791/60087 Published: October 5, 2019

Summary

여기서, 우리는 경피 / 내피 전기 저항 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수와 저렴한 볼트 암페어 미터를 설정하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

체상피/내피 전기 저항(TEER)은 1980년대부터 생체외 장벽 모델 시스템의 합류성과 투과성을 결정하는 데 사용되어 왔습니다. 대부분의 경우 젓가락 전극은 셀룰러 단층을 포함하는 세포 배양 필터 삽입 시스템의 상부 및 하부 구획 사이의 전기 임피던스를 결정하는 데 사용됩니다. 필터 멤브레인은 단단한 접합을 구축하여 세포가 부착, 편광 및 상호 작용할 수 있게 합니다. 이 기술은 다양한 상이한 세포주(예를 들어, 혈액-뇌 장벽, 혈액 뇌척수액 장벽, 또는 위장관 및 폐관)로 기술되었다. TEER 측정 장치는 다양한 실험실 장비 공급업체로부터 쉽게 얻을 수 있습니다. 그러나 적절한 볼탐미터가 자체 조립될 경우 더 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 솔루션이 있습니다. 이 출판물의 전반적인 목적은 TEER 측정을 위해 시판되는 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수로 신뢰할 수있는 장치를 설정하는 것입니다.

Introduction

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상피 및 내피 세포는 세포의 경계로 기능, 신체의 상피와 basoal 측면을 분리. 그들은 꽉 접합을 통해 연결되는 경우, 파라 셀 룰러 공간을 통해 수동 물질 확산이 제한1,선택적으로 투과 장벽의 형성의 결과. 여러 인공 장벽 시스템은 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC, 혈액 뇌장벽3,4,5,6,7),경막염 신경총2를 사용하여 개발되었습니다. 상피 세포 (HIBCPP / PCPEC, 혈액 뇌척수액 장벽8,9,10, 11,12,13,14), 대장선암세포(Caco-2, 위장모델15),또는 기도/폐포 세포주(폐모델16,17). 이러한 시스템은 전형적으로 투과성 멤브레인(즉, 필터 삽입 시스템)에서 단층으로 성장하여 정점 및 바소측 측에 접근할 수 있도록 하는 세포로 구성됩니다. 모델 시스템의 무결성이 생체 내 조건과 일치하는 것이 중요합니다. 따라서, 세포 층을 통해 추적자 화합물의 paracellular 확산을 측정 하 여 장벽 기능을 분석 하기 위해 몇 가지 기술이 개발 되었습니다. 이러한 물질에는 방사성 표지자당, 염료 표지 알부민, FITC 라벨이 붙은 이눌린 또는 염료 표지 덱스 트랜스2가포함됩니다. 그러나 화학 염료는 추가 실험을 위해 세포를 사용할 수 없게 만들 수 있습니다. 비침습적으로 장벽 시스템을 모니터링하기 위해, 세포 단층 전반에 걸쳐 경피 / 경피 전기 저항 (TEER)의측정은 2,18,19를사용할 수 있습니다. 양극성 전극 시스템은 전극-전해질 인터페이스에서 전극 편광 임피던스의 영향을 받기 때문에 일반적으로 테트라폴라 측정은 이러한 한계20을극복하기 위해 사용됩니다. 언더레이 기술은 윌리엄 톰슨(Lord Kelvin)21에의해 1861년에 처음 기술된 4단자 감지(4T)이다. 간단히 말해서, 전류는 한 쌍의 전류 운반 전극에 의해 주입되고 두 번째 전압 감지 전극은 전압강하(20)를측정하는 데 사용된다. 요즘, 소위 젓가락 전극은 이중 전극의 쌍으로 구성, 각각 전압을 측정하기위한 은 / 염화물 펠릿과 전류2를전달하기위한 은 전극을 포함하는. 전기 임피던스는 세포층과 함께 정점과 바삭한 구획 사이에서 측정된다(도1). 일반적으로 12.5Hz의 주파수에서 정사각형 파신호가 외부 전극과 그에 따른 교류 전류(AC)에 적용됩니다. 추가적으로, 세포 층을 가로지르는 전위 하락은 제2(내부) 전극 쌍에 의해 측정된다. 그런 다음 전기 임피던스는 옴의 법칙에 따라 계산됩니다. TEER 값은 임피던스 및 셀 레이어 표면적을 곱하여 정규화되며 일반적으로 Ω cm2로표현됩니다.

셀과 전극이 보다 정교한 방식으로 배열되는 시스템이 있지만 4T 측정 원리를 기반으로 하며 동일한 측정 장치와 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 필터가 삽입되는 EndOhm 시스템은 젓가락 전극과 동일한 구조를 가진 한 쌍의 동심 전극이 있는 챔버와 캡을 포함합니다. 전극의 모양은 멤브레인을 가로지르는 보다 균일한 전류 밀도 흐름을 허용하여 판독값 간의 변동을 줄입니다. 더욱 복잡한 (그러나 또한 더 정확한) 세포 층링거의 용액(22)로채워진 두 개의 챔버를 분리하는 Ussing 챔버입니다. 챔버 자체는 산소,CO2또는N2로가스를 공급하고 실험 물질로 교반하거나 보충할 수 있다. 세포 층을 가로 질러 이온 수송이 발생하면, 전위 차이는 조직 근처의 두 전압 감지 전극에 의해 측정 될 수있다. 이 전압은 셀 층 옆에 배치된 두 개의 전류 운반 전극에 의해 취소됩니다. 측정된 전류는 그물 이온 수송 및 장벽 무결성을 반영하는 경피 저항을 주며,22를결정할 수 있다. TEER 측정은 장벽 조직 모델23,24를나타내는 바디 온 어 칩 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 이 시스템은 세포의 생체 내 조건을 모방하고 종종 층에서 서로의 상단에 적층 세포의 여러 유형으로 구성되어 있습니다.

다음 프로토콜은 상용 측정 시스템에 비해 TEER에서 통계적으로 유의한 차이를 생성하지 않는 프로그래밍 가능한 출력 주파수로 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 볼탐계를 설정하는 방법을 설명합니다.

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Protocol

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1. TEER 측정을 위한 기본 볼트 암페어미터 조립

  1. 5V D.C. 전원 공급 장치, USB 확장 코드, 프로그래밍 가능한 제네파 발생기로 사용되는 마이크로 컨트롤러, 교류 전류 및 전압을 근평균 정사각형으로 측정할 수 있는 두 개의 표준 멀티미터로 표준 USB 충전기를 준비하십시오. True-RMS), 바나나 플러그가 있는 4개의 케이블, 내부 4개의 유선(6P4C)이 있는 6개의 핀을 포함한 RJ14 암 커넥터가 있는 전화 연장 코드, 2개의 짧은 케이블, 광택 단자, 120kΩ 프리 저항기, 와이어 엔드 ferrules 및 납땜 러그. 필요한 도구는 절연 스트리퍼, 압착 공구 및 납땜 인두입니다.
  2. 먼저 USB 확장을 마이크로 컨트롤러 보드에 연결합니다.
  3. 두 개의 짧은 케이블의 끝 단열재를 제거합니다. 케이블당 한쪽면을 마이크로 컨트롤러의 핀 0과 2또는 납땜 러그에 직접 납땜하여 각 핀에서 잘라낸다. 그림 1에묘사된 바와 같이 다른 쪽 끝을 와이어 끝 페룰에 압착하고 광택 단말에 연결합니다.
  4. 바나나 플러그를 멀티미터에 연결합니다. 4개의 케이블 각각의 다른 쪽 끝을 스트립하고 압착합니다.
  5. 전화 연장 코드를 두 조각으로 자르고 분해하고 암 커넥터가 들어있는 측면의 도체를 압착합니다. 도체 및 핀의 연속성을 확인합니다.
  6. 첫 번째 멀티미터는 μA에서 전류를 측정하는 데 사용됩니다(AC 모드를 명시적으로 설정해야 합니다). 젓가락 전극의 외부 전극 쌍에 해당하는 RJ14 커넥터의 5개 및 6개를 핀에 120kΩ 프리 저항기로 계열로 연결합니다.
  7. 마지막으로, 윤기 단자를 통해 mV의 상피 전압 강하를 측정하는 데 사용되는 두 번째 멀티미터를 연결하여 젓가락 전극의 내부 전극 쌍에 해당하는 RJ14 커넥터의 3 및 4개를 핀으로 고정합니다.
  8. 원하는 경우 섀시에 설치를 장착하십시오.

2. 마이크로 컨트롤러 프로그래밍

  1. 필요에 따라 제공된 소스 코드(추가 코딩 파일 1)를 수정합니다. 주어진 형태에서 핀 0과 2는 지면과 +5 V 를 번갈아 가며 40 ms의 진동 반시간동안 번갈아 가며 합니다. 따라서 진폭이 5V이고 주파수가 약 12.5Hz인 정사각형 파신호가 생성됩니다. 실제 값은 마이크로 컨트롤러의 시간 방출기의 부정확성으로 인해 다를 수 있습니다.
  2. USB 포트를 통해 마이크로 컨트롤러를 데스크톱 컴퓨터에 연결하고 일치하는 소프트웨어25와소스 코드를 업로드합니다.

3. 전압 오실로 그램의 기록 (선택 사항)

  1. 1kΩ 테스트 저항기와 RJ14 커넥터의 5개 및 6개 를 우회하여 오실로스코프에 연결합니다.
  2. 주파수, 피크 전압 및 파형을 확인합니다. 데이터를 디지털화하고 내보냅니다.
  3. 원하는 경우 비교를 위해 기준 장치(EVOM)와 자체 조립 된 볼탐미터에서 오실로그램을 기록하십시오.
    참고: 이 경우 데이터는 디지털 스토리지 범위 HM 208로 기록되었습니다. 매우 기본적인 디지털 오실로스코프이기 때문에 이미지는 내부적으로 디지털화(동결)될 수 있지만 아날로그 PM 8143 X-Y 레코더를 사용하여 플롯해야 했습니다. 이후에 이미지가 스캔되었습니다.

4. 세포 재배 및 TEER 측정

  1. 종자 인간 코로이드 플렉서스 유두종 (HIBCPP) 세포 배양 필터에 DMEM/F12에서 3 μm 크기의 기공 크기를 가진 삽입체(재료표참조)는 10% 태아 송아지 세포 혈청9를함유한다. Dinner et al.9에의해 설명된 바와 같이 5%CO2를 함유하는 물 포화 분위기에서 37°C에서 세포를 성장시다.
  2. 필터가 70Ω ∙cm2의임피던스에 도달하면 무혈청 DMEM/F12로 변경하고 타임포인트를 0일로 정의합니다.
  3. 자체 조립 된 볼탐미터의 RJ14 포트에 전극을 연결하고 USB 전원 공급 장치를 연결하십시오. 멀티미터를 AC 전압 모드(mV) 및 AC 전류 모드(μA)로 각각 설정합니다.
    1. 또는 시판되는 참조 장치에 전극을 연결하고 제조업체의 지침에 따라 켜십시오.
  4. 전극을 80% 에탄올로 10분 동안 살균하고 10분 동안 적절한 배지에서 평형을 조정합니다.
  5. 측정 값이 일정하게 유지될 때까지 HIBCPP 셀 층을 포함하는 셀 배양 필터 삽입 시스템의 두 구획 (하부 구획의 전극의 긴 부분과 상부 구획의 짧은 부분)에 전극을 넣습니다.
  6. 참조 장치의 경우 임피던스를 직접 기록하거나 자체 조립 된 볼탐미터에 대한 Ohm의 법칙 (R = U / I)에 따라 임피던스를 계산하십시오. 전극 각도는 측정에 영향을 미칩니다.
  7. TEER 측정(3단계 3-6단계)을 0일째부터 4일째까지 반복합니다.

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Representative Results

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자체 조립 된 볼탐미터의 작동을 상업적으로 사용할 수있는 것과 비교하기 위해 두 장치의 전압 오실로그램이 기록되었습니다.

그림 2A에표시된 바와 같이, 기준 계측기는 1kΩ 테스트 저항기로 온로드를 작동할 때 진폭 80mV및 진동 시간이 80ms인 사각파 신호를 생성했는데, 이는 12.5Hz의 주파수에 해당합니다.

대조적으로, 자체 조립된 장치의 마이크로컨트롤러는 프리 저항기가 설정되지 않은 경우 5V(도2B)의진폭을 가진 사각파 신호로 공급 전압을 전환하였다. 생성된 전류가 장벽 기능을 파괴하고 세포 배양 실험에 적용되지 않는다는 것이 명백해졌습니다(데이터는 표시되지 않음). 또 다른 문제는 이 설정에서 1kΩ 테스트 저항이 전압의 감소로 과부하를 일으켰다는것입니다(그림 2B). 부가적으로, 마이크로컨트롤러의 유효 진동 시간은 60 ms(주파수 = 16.7 Hz)였고, 이에 의하면 시간 방출기의 부정확성으로 인해 프로그래밍된 지연 시간과 달랐다. 120 kΩ 프리레지터가 설치된 경우, 진폭은 40 mV의 값으로 감소하였고, 이는 세포 배양에 적합하였다(도2C). 오실로그램에서 볼 수 있듯이 신호 대 잡음 비는 상당히 손상되었지만(그림2C)측정에 눈에 띄게 영향을 미치지 않았습니다.

두 장치 모두 인공 혈액-뇌척수액 장벽의 임피던스를 결정하는 데 사용되었다(도 2D에나타난 단순화 회로 도면). HIBCPP 세포는 세포 배양 필터 삽입물 및 TEER에서 6일 이상 배양하였다: 세포가 무혈청 상태로 이동되기 1일 전부터 (일 -1) 및 배지를 변경한 후 최대 4일(일째 4일째). 모든 측정은 동일한 방식으로 제조된 4개의 HIBCPP 필터를 사용하여 4중으로 수행되었습니다. 기준 계측기 및 자체 조립된 볼탐계에 대해 유사한 값을얻었다(도 3). 측정은 재현 가능했으며 표준 편차는 동일한 범위 내에 있었습니다. TEER 값은 20-550 Ω cm2에서범위. 0.33cm2 필터를 사용하는 이 필터는 83−1,660 Ω의 절대 임피던스와 동일합니다.

Figure 1
그림 1: TEER 측정을 위한 기본 볼트 암페어미터의 레이아웃 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 오실로그램 및 측정 설정. (A)상용 EVOM. (B)프리 저항없이 자체 조립 볼탐계. (C)120 kΩ 프리 저항기와 자체 조립 볼탐계. (D)측정 설정 회로도. C전극은 양극성 시스템을 사용할 때만 전기 회로에 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 세포 배양 필터상에서 HIBCPP 세포 층의 TEER 측정은 혈청이 없는 배양 배지(Day-1)로 전환하기 전에, 전환당일(0일째) 및 최대 4일 후(1일-4일)로 전환한다. 오류 막대는 동일한 방식으로 제조된 4개의 HIBCPP 필터의 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 코딩 파일 1. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

추가 코딩 파일 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

추가 코딩 파일 3. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

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Discussion

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자가 제작 볼탐계를 일상에서 사용하려면 장치가 적절한 기능을 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 우리의 경우, 40 ms (12.5 Hz)의 진동의 반 시간이 프로그래밍되었지만, 효과적인 진동 시간은 60 ms (16.7 Hz)로 밝혀졌다. 마이크로 컨트롤러의 시간 방출기의 이러한 부정확성은 TEER 측정에 감지 가능한 영향을 미치지 않았습니다. 다중 미터 중 하나의 주파수 설정을 사용하여 실제 주파수를 결정하는 것이 가장 좋습니다. 편차가 발견되면 소스 코드를 그에 따라 조정할 수 있습니다. 또한 테스트 저항기 또는 기타 정의된 설정이 정확하고 재현 가능한 결과를 제공하는지 확인하는 것이 좋습니다. 인공 세포 장벽 시스템으로 작업하는 경우, 항상 임피던스 측정과 분자 플럭스의 상관 관계를 지정하는 것이 가장 좋습니다.

이 경우, 적용된 전류는 120 kΩ 프리 레지젝터를 사용하여 제한되었다. 일반적인 TEER 값이 100Ω−2,000 Ω범위라고 가정하면 셀 레이어의 전압 강하를 4−83 mV로 계산할 수 있습니다. 1 kΩ의 TEER는 테스트 저항에 의해 시뮬레이션되었고, 그 결과 전위 낙하가 40 mV(도2C)인것을 확인하였다.

상용 장치는 종종 프리 저항기를 전환하여 출력 전류를 다른 값으로 제한하는 측정 범위 스위치를 제공합니다. 이 경우 다른 프리 저항기를 설치하거나 저항기를 전위계로 교체하는 것이 가능합니다.

표시된 설정은 TEER 측정을 위해 시판되는 기기에 대한 비용 효율적인 대안을 나타냅니다. 자체 조립 된 볼탐미터로 측정 된 값은 넓은 범위에 걸쳐 기준 장치와 비교되었다. 표준 편차도 마찬가지입니다. 사각 파 신호의 노이즈는 측정에 특히 영향을 미치지 않았습니다. 이 프로토콜은 제한된 재정 자원에 의해 제한되거나 저렴한 비용으로 예비 실험을 수행하려는 과학자를 지원할 수 있습니다.

또한 마이크로 컨트롤러는 다양한 출력 주파수로 쉽게 프로그래밍할 수 있습니다. 이는 명백한 임피던스가 R배지,RTEER,뿐만 아니라 용량 C세포층(26)으로 구성되기 때문에 유익할 수 있다(도2D). 또한 양극성 시스템을 사용하는 경우 C전극이 나타나는 반면, 전극 편광 임피던스의 영향은 테트라폴라 시스템에서 감소됩니다. 즉, 측정된 임피던스는 낮은 주파수에서 RTEER에 의해 지배되고, 양극성 시스템에서는 전극의 용량에 의해, 고주파수에서 총 임피던스는매체(26)의저항에 수렴된다는 것을의미한다. 27. 그 사이에, 임피던스는 C세포 층에의해 영향을 받아, 따라서 전기 임피던스 분광법28을사용하여 접근할 수 있다.

우리는 장치를 다른 응용 프로그램에 맞게 최적화하거나 다시 프로그래밍 할 수있는 방법을 아이디어를 제공하기 위해 두 가지 (테스트되지 않은) 예제 코드를 제공합니다. 첫째, 매우 기본적인 임피던스 분광법은 12.5, 500 및 5000 Hz(보조 코딩 파일 2) 사이의 20초 간격으로 출력 주파수를 번갈아 가며 실현할 수 있습니다. 이 경우, 테트라폴라20,28 또는 바이폴라27 전극을 사용할 수 있다. 적용 된 주파수는 빌드 - 인 멀티 미터 (또는 마이크로 컨트롤러에 연결된 모든 디스플레이 또는 LED)에 의해 표시 될 수있다. 둘째, 장치는 버퍼 및 미디어의 전도도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 이는 일반적으로 1-110kHz 범위의 높은 주파수를 가진 테트라폴라 전극을 사용하여 수행됩니다. 추가 코딩 파일 3의 코드에는 지연 시간이 없으며 (당사 의 장치사용) 약 70kHz의 주파수가 생성되었습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 전기 기술 및 정보학에 대한 전문가의 조언에 대한 허먼 Liggesmeyer와 마빈 벤드에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120 kOhm resistor General (generic) equipment
Banana plug cables General (generic) equipment
Cables General (generic) equipment
Chopstick electrode Merck Millicell MERSSTX01
Chopstick electrode (alternative) WPI World Precision Instruments STX2
Crimping tool General tool
Digispark / ATtiny85 AZ-Delivery Vertriebs GmbH Digispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12 Gibco (Thermo Fisher) 31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10270106
Filter inserts 3µm translucent Greiner Bioone 662631
HIBCPP Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripper General tool
Luster terminal General (generic) equipment
Oscilloscope HAMEG Digital Storage Scope HM 208
Plotter PHILIPS PM 8143 X-Y recorder
Software Arduino https://www.arduino.cc Arduino 1.8.9
Soldering iron General tool
Soldering lugs General (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector General (generic) equipment
Test resistor Merck Millicell MERSSTX04
True-RMS multimeters VOLTCRAFT VC185
USB charger General (generic) equipment
USB extension cord General (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurement WPI World Precision Instruments EVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) Merck Millicell ERS
Wire end ferrules General (generic) equipment

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References

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Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).More

Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).

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