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Biochemistry

Cryoslicing BN-MS विश्लेषण द्वारा उच्च संकल्प Complexome प्रोफ़ेशनल

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60096
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1,3,4
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 2Institute of Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 3Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, Freiburg, Germany, 4Logopharm GmbH, Germany

Summary

एक microtome का उपयोग कर एक बहुमुखी cryoslicing बीएन-एमएस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प complexome रूपरेखा के लिए प्रस्तुत किया है.

Abstract

प्रोटीन आम तौर पर अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत के माध्यम से जैविक कार्यों को लागू, या तो गतिशील प्रोटीन विधानसभाओं में या stably गठन परिसरों के एक भाग के रूप में. बाद सुंदर ढंग से देशी polyacrylamide जेल electrophoresis (बीएन-पेज) का उपयोग कर आणविक आकार के अनुसार हल किया जा सकता है। संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस तरह के जुदाई के युग्मन (BN-MS) अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और सैद्धांतिक रूप से जैविक नमूनों में निकालने योग्य complexome के संपूर्ण मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, इस दृष्टिकोण बल्कि कठिन है और सीमित जटिल आकार संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान करता है. इसके अलावा, इसके आवेदन प्रचुर मात्रा में mitochondrial और प्लास्टिड प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित बनी हुई है. इस प्रकार, प्रोटीन के बहुमत के लिए, स्थिर प्रोटीन परिसरों में एकीकरण के बारे में जानकारी अभी भी कमी है. यहाँ प्रस्तुत जटिल रूपरेखा के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण है जिसमें तैयारी-स्केल BN-PAGE जुदाई, क्रायोमाइक्रोटोम स्लिंग द्वारा व्यापक जेल लेन के उप-मिलीमीटर नमूना, और लेबल-मुक्त प्रोटीन परिमाणीकरण के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण शामिल है। कार्यविधियाँ और उपकरण महत्वपूर्ण चरणों के लिए विस्तार से वर्णित हैं। एक आवेदन के रूप में, रिपोर्ट माउस गुर्दे से एक solubilized endosome समृद्ध झिल्ली अंश के complexome विश्लेषण का वर्णन करता है, कुल में profiled 2,545 प्रोटीन के साथ. परिणाम वर्दी की पहचान प्रदर्शित करता है, कम बहुतायत झिल्ली प्रोटीन जैसे intracellular आयन चैनलों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च संकल्प, जटिल प्रोटीन विधानसभा पैटर्न, ग्लाइकोसियलेशन आइसोफॉर्म्स सहित. परिणाम स्वतंत्र जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ समझौते में हैं. संक्षेप में, इस पद्धति प्रोटीन की व्यापक और निष्पक्ष पहचान के लिए अनुमति देता है (सुपर) complexes और उनके subunit संरचना, किसी भी में प्रोटीन परिसरों की stoichimetry, विधानसभा, और बातचीत गतिशीलता की जांच के लिए एक आधार प्रदान जैविक प्रणाली.

Introduction

बीएन-पेज जुदाई पहले सीधे LC-MS विश्लेषण करने के लिए युग्मित किया गया था (BN-MS) Majeran1 और Wessels2 अनुसंधान समूहों द्वारा बीएन-पेज जेल लेन के मैनुअल टुकड़ा करने का उपयोग कर. उनके विश्लेषणों ने पादप प्लास्टिड और एचईके कोशिका माइटोकोंड्रिया से ज्ञात उपइकाई संरचना के साथ प्रचुर मात्रा में झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संख्या की पहचान की। हालांकि, ये विश्लेषण व्यापक से दूर थे और उपन्यास विधानसभाओं की निष्पक्ष पहचान के लिए अनुमति नहीं दी. मास स्पेक्ट्रोमीटर और लेबल मुक्त परिमाणीकरण विधियों के निष्पादन में तब से काफी सुधार हुआ है, जिससे व्यापक बीएन-एमएस विश्लेषण सक्षम हुए हैं। इसने "कॉम्प्लेक्सोम प्रोफाइलिंग" शब्द गढ़ा है। उदाहरण के लिए, Heide और सहकर्मियों चूहे दिल mitochondria की पहचान करने और क्लस्टरिंग 464 mitochondrial प्रोटीन का विश्लेषण किया, जिससे कई ज्ञात विधानसभाओं की पुष्टि. इसके अलावा, उन्होंने पाया TMEM126B एक विशिष्ट विधानसभा परिसर3के एक उपन्यास और महत्वपूर्ण उपइकाई हो. एचईके सेल माइटोकोंड्रिया4के समानांतर अध्ययन में तुलनात्मक परिणाम (437 माइटोकोंड्रियाल प्रोटीन प्रोफाइल के साथ) प्राप्त किए गए थे।

इन सुधारों के बावजूद, कई मुद्दे बने हुए हैं जो कॉम्पलेक्सोम प्रोफाइलिंग के लिए BN-MS की पूरी क्षमता को नियंत्रित करते हैं। एक प्रमुख सीमा परिसरों के प्रभावी आकार संकल्प है कि दो कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है: (i) बीएन-पेज जुदाई की गुणवत्ता, जो जेल मैट्रिक्स pores ढाल की एकरूपता के साथ ही नमूना परिसरों की स्थिरता / और (ii) जेल नमूना का चरण आकार, जो पारंपरिक मैनुअल टुकड़ा करने का उपयोग करते समय सबसे अच्छा 1 मिमी है5,6. गरीब आकार संकल्प न केवल सूक्ष्म जटिल isoforms और विषमताओं याद आती है, लेकिन यह भी नकारात्मक गतिशील रेंज और निष्पक्ष, डी नोवो subunit असाइनमेंट और परिमाणीकरण के विश्वास को प्रभावित करता है.

अन्य चुनौतियों प्रोटीन परिमाणीकरण और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा नमूने में प्रोटीन बहुतायत की वास्तविक गतिशील रेंज की कवरेज की परिशुद्धता शामिल हैं. इसलिए, बीएन-एमएस complexome रूपरेखा के आवेदन काफी हद तक कम जटिलता के साथ जैविक नमूनों के लिए प्रतिबंधित बनी हुई है, लक्ष्य परिसरों की उच्च अभिव्यक्ति, और अनुकूल solubilization गुण (यानी, प्लास्टिड, mitochondria, और सूक्ष्मजीव)6,7,8,9,10.

हमने हाल ही में क्रायोमाइक्रोटोम टुकड़ा करने की मदद से बीएन-एमएस (csBN-MS) पेश किया है, जो व्यापक एमएस विश्लेषण के साथ BN-PAGE जेल लेन के सटीक उप-मिलीमीटर नमूने को जोड़ती है और उच्च के साथ प्रोटीन प्रोफाइल के निर्धारण के लिए विस्तृत एमएस डेटा प्रसंस्करण विश्वास11| चूहे दिमाग से एक mitochondrial झिल्ली की तैयारी के लिए आवेदन पहले से अमेट प्रभावी जटिल आकार संकल्प और ऑक्सीडेटिव श्वसन श्रृंखला परिसर (OXPHOS) subunits की अधिकतम कवरेज का प्रदर्शन किया (यानी, 90 एमएस सुलभ के 90). इस उदाहरण में कई नए प्रोटीन असेंबली की भी पहचान की गई है।

यहाँ वर्णित प्रोटीन परिसरों की तैयारी पैमाने BN-पेज जुदाई के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं रहे हैं (एक विशेष जैविक स्रोत के लिए प्रतिबंधित नहीं), बड़े preparative BN-पेज जैल के कास्टिंग, व्यापक जेल गलियों के cryomicrotome टुकड़ा करना, और एमएस डेटा प्रसंस्करण. उच्च संकल्प रूपरेखा के प्रदर्शन माउस गुर्दे endosome समृद्ध झिल्ली से एक प्रोटीन जटिल तैयारी के लिए प्रदर्शन किया है. अंत में, संकल्प और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीट्रिक परिमाणीकरण की परिशुद्धता बढ़ाने से लाभ पर चर्चा कर रहे हैं.

Protocol

1. तैयारी बी एन-पेज

  1. जेल की तैयारी
    1. 10 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रभावी ठंडा सेट के साथ एक मध्यम से बड़े प्रारूप ऊर्ध्वाधर जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस सिस्टम (gt; 10 सेमी जेल जुदाई दूरी; 14 सेमी x 11 सेमी, 1.5 मिमी स्पेसर) का उपयोग करें।
    2. कास्ट रैखिक या अतिपरवलयिक pores ढाल जेल (1.5-3.0 मिमी spacers) एक पंप द्वारा संचालित एक सरगर्मी दो कक्ष ढाल मिक्सर का उपयोग कर (सामग्री और अभिकर्मकों की तालिकादेखें). प्रस्तुत उदाहरण में (रेखीय ग्रेडिएंट जेल 1%-13%):
      1. सामने (मिश्रण) कक्ष से मिलकर के लिए एक 13 एमएल समाधान तैयार करें: 13% acrylamide (30% स्टॉक समाधान से, 37.5:1.0 acrylamide:bisacrylamide), 0.75 एमिनोकैप्रोइक एसिड, 50 एमएम बिस्-ट्रिस (पीएच जेड 7.0), और 10% ग्लिसरोल।
      2. जलाशय कक्ष के लिए एक 10 एमएल समाधान तैयार करें जिसमें 1% ऐक्रिलमाइड (30% स्टॉक समाधान से, 37.5:1.0 acrylamide:bisacrylamide:bisacrylamide), 0.75 M एम एम एम-ट्रिस (पीएच $ 7.0), और 0.2% सीएल-47 डिटर्जेंट डिटर्जेंट।
    3. स्टरास्टर शुरू करें और एपीएस के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें (अमोनियम peroxodisulte, 10% स्टॉक समाधान) और TEMED के 2.5 $L (एन, एन', 'न',-टेट्रामेथिल एथिलीनडियामाइन) और सामने कक्ष में समाधान के लिए TEMED के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। पंप शुरू करें और सामने वाल्व खोलें (प्रवाह 10 मिनट में कास्टिंग को पूरा करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए)। 1 मिनट के बाद एपीएस के 90 डिग्री सेल्सियस और जलाशय कक्ष में समाधान के लिए TEMED के 5 डिग्री एल जोड़ें और कक्ष कनेक्शन खोलें।
    4. जेल धीरे धीरे लेकिन अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर कम से कम 24 एच के लिए बहुलक की अनुमति दें (आरटी) एक समरूप pores आकार ढाल उत्पन्न करने के लिए. जब नम रखा, बहुलक जेल अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सीधे संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: जानबूझकर, जेल के शीर्ष एक नरम / यह बाद में हटा दिया जाएगा, लेकिन जेल में प्रोटीन की चिकनी प्रवेश के लिए अनुमति देता है, प्रोटीन वर्षा के कम से कम जोखिम है कि अन्यथा प्रवास कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ (यानी, धारियों या प्रोटीन वर्षा).
  2. नमूना तैयारी और लोडिंग
    1. प्रोटीन की 0.5-2.0 मिलीग्राम को अलग करने के लिए कांच की प्लेटों के बीच उपयुक्त स्पेसर्स (उदाहरण के लिए, सिलिकॉन ट्यूब) डालने से लोडिंग स्लॉट तैयार करें। स्लॉट कम से कम 3 सेमी चौड़ा किया जाना चाहिए (या बेहतर, 5-6 सेमी चौड़ा).
    2. 2 एमएल सोलबिलाइजेशन बफर में झिल्ली की 2.5 मिलीग्राम (माउस गुर्दे एंडोसोम-समृद्ध तैयारी) जिसमें 1% (w/v) गैर-डेनेटिंग डिटर्जेंट (कॉम्प्लेक्सियोलाइट सीएल-47) बर्फ पर 30 मिनट के लिए है। Ultracentrifugate (अवसादन कट-ऑफ - 200 S या उससे कम; 130,000 x g/11 मिनट यहाँ प्रयोग किया जाता है)।
    3. एक छोटी 50%/20% (w/v, 0.3 मिलीलीटर प्रत्येक) पर solubilisate ध्यान केंद्रित 400,000 x ग्रामपर 1 एच के लिए ultracentrifugation द्वारा sucrose कदम ढाल . अंतिम प्रोटीन उपज कम से कम 1 मिलीग्राम होनी चाहिए।
    4. जोड़ें 0.05% (w/v) Coomasie जी-250 solubilisate करने के लिए और जेल पर नमूना लोड. उच्च संकल्प प्राप्त करने और प्रोटीन वर्षा से उत्पन्न कलाकृतियों से बचने के लिए प्रोटीन लोड को 10-15 ग्राम/मिमी2 जेल लेन क्रॉस-सेक्शन तक सीमित करें।
  3. BN-पेज चल शर्तें
    1. बफर चलाने के लिए, 50 एमएम ट्राइसिन, 15 एमएम बिस्-ट्रिस, और 0.01% कोमासी जी-250 से मिलकर एक मानक कैथोड बफर तैयार करें। एक मानक एनोड बफर तैयार करें जिसमें 50 एमएम बिस्-ट्रिस (पीएच जेड 7.0) शामिल हैं।
    2. एक तैयारी बीएन-पेज रात भर में एक तीन कदम वोल्टेज प्रोटोकॉल का उपयोग कर13 से मिलकर: 100 वी पर 30 मिनट के लिए एक तुल्यता चरण, फिर अधिकतम वोल्टेज के लिए एक धीमी (3 ज) रैंप (40-50 वी / प्रोटीन का ध्यान केंद्रित समापन बिंदु.
      नोट: यह इलेक्ट्रोफोरोसिस को थामने के लिए सिफारिश की है जब प्रवास सामने जेल के बीच तक पहुँच गया है और Coomasie G250 बिना ताजा बफर के लिए कैथोड बफर विनिमय. यह मैट्रिक्स छिद्र संरचना के स्थानीय पतन से उत्पन्न जेल में वर्षा कलाकृतियों से बचने में मदद करता है।

2. जेल नमूना और पाचन

  1. जेल गलियों का चीरा
    1. चलाने के बाद, यह कांच की प्लेटों के बीच रखने के दौरान प्रलेखन प्रयोजनों के लिए जैल स्कैन.
    2. प्लेटों को अलग करें और ब्याज की लेन अनुभाग (ओं) को उत्पादित करें।
    3. 2D BN/SDS-पेज और प्रोटीन धुंधला या पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए लेन की एक नमूना पट्टी लें (जैसा कि चित्र 1खमें दिखाया गया है ) ब्याज के क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए, प्रभावी जटिल आकार संकल्प, और प्रोटीन बहुतायत।
    4. 30% (v/v) इथेनॉल और 15% (v/v) एसिटिक एसिड के साथ कम से कम 30 मिनट के लिए चयनित जेल लेन को दो बार ठीक करें।
    5. नमूना को एम्बेड करने के लिए मध्यम को स्थानांतरित करें और इसे कम से कम 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भिगोने और बराबर करने की अनुमति दें, जबकि एक कक्षीय शेकर पर धीमी गति में जेल स्लैब रखते हुए।
      नोट: जेल जुदाई ध्यान से समग्र जुदाई गुणवत्ता और प्रवास कलाकृतियों के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए. प्रमुख प्रोटीन का प्रतिनिधित्व जेल बैंड विरूपण मुक्त और तीव्रता में सजातीय होना चाहिए. जेल पर स्थानीय कलाकृतियों excised या विश्लेषण से बाहर छोड़ दिया जाना चाहिए.
  2. एम्बेडिंग और क्रायोमाइक्रोटोम टुकड़ा करना
    नोट: यह embedding प्रक्रिया का एक उन्नत संस्करण है वर्णित है और फोटो प्रलेखित पहले कि embedding और 8 सेमी11तक की व्यापक जेल गलियों के टुकड़े करने के लिए अनुमति देता है.
    1. सबसे पहले, वर्गों में तय जेल गलियों में कटौती (यहाँ, 3 सेमी) प्रोटीन प्रवास सामने के लिए बिल्कुल समानांतर / आसान हैंडलिंग के लिए, समान आयामों के साथ एक प्लास्टिक फिल्म समर्थन पर प्रत्येक अनुभाग जगह है.
    2. stoppers के साथ एक खुली ट्यूब में गलियों स्थानांतरण (तल पर बंद, केंद्रीय शीर्ष पर छिद्रित, दोनों ठीक जेल अनुभाग के ऊपरी और निचले सिरों के साथ गठबंधन).
    3. ठोसीकरण को तेजी से आरंभ करने के लिए सिलेंडर को तरल नाइट्रोजन में संक्षेप में डुबोएं। पारदर्शी एम्बेडिंग माध्यम सेकंड के भीतर जम जाता है और रंग में सफेद हो जाता है।
    4. embedding मध्यम के साथ गुहा भरें, संक्षेप में यह तरल नाइट्रोजन में डुबकी, और कई घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सिलेंडर फ्रीज.
      नोट: तरल नाइट्रोजन में डुबकी द्वारा तेजी से सिलेंडर शीतलक ट्यूब के भीतर जेल स्लैब के विस्थापन से बचने में मदद करता है. विरूपण निम्नलिखित एमएस विश्लेषण में उच्च संकल्प सुनिश्चित करने के लिए बचा जाना चाहिए।
    5. disassembly के बाद, प्लास्टिक की फिल्म को हटाने और एक ठंडा करने के लिए एम्बेडेड जेल अनुभाग के साथ ब्लॉक हस्तांतरण, व्यास में बड़ा, धातु सिलेंडर एक फ्लैट समर्थन पर रखा (यानी, पेट्री डिश) और सिलेंडर के बाहर पर embedding माध्यम के साथ सील. मध्यम embedding के साथ सिलेंडर भरें और अच्छी तरह से फ्रीज.
    6. इस प्रक्रिया को कोपलर सतहों के साथ एक ठोस ब्लॉक प्राप्त करने के लिए सिलेंडर के दूसरे पक्ष के साथ दोहराएँ।
    7. सिलेंडर से ब्लॉक निकालें, यह एक precooled धातु धारक पर मध्यम embedding के साथ गोंद, और cryoslicing मशीन (cryotome) में धारक डालने. ब्लॉक की सतह को टुकड़ा करने वाले विमान के संबंध में सावधानी से संरेखित किया जाना चाहिए। यह टुकड़ा करने की प्रक्रिया के लिए इष्टतम तापमान पर समानता के लिए अनुमति दें (यहाँ, -15 डिग्री सेल्सियस).
      नोट: सही स्थिति सुनिश्चित करने के लिए एम्बेडेड जेल अनुभाग की सतह से टकराने तक 0.1 मिमी कदम आकार की एक धीरे धीरे प्रगति मैनुअल टुकड़ा करने चक्र का प्रयोग करें.
    8. जेल स्लाइस एक के बाद एक फसल, 0.25 मिमी कदम आकार के एक अंतिम वांछित मोटाई के साथ, और उन्हें व्यक्तिगत रूप से कम प्रोटीन बाध्यकारी गुणों के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
      नोट: इस सेट अप में, वर्दी जेल स्लाइस आसानी से 0.1 मिमी के रूप में पतली के रूप में प्राप्त किया जा सकता है और के रूप में मोटी के रूप में 0.5 मिमी.
  3. ट्रिपेटिक पाचन
    1. जेल स्लाइस की व्यापक धोने के बाद इन-जेल ट्रिप्टिक पाचन प्रदर्शन (एक मानक प्रक्रिया11के बाद embedding माध्यम के बहुलक घटकों को दूर करने के लिए धोने के कम से कम तीन अतिरिक्त दौर की सिफारिश कर रहे हैं) ।
    2. वैक्यूम-सूखी एलिट्ड पेप्टाइड्स और 0.5% (v/v) trifluoracetic एसिड में 37 डिग्री सेल्सियस (10 मिनट) स्नान sonication (5 मिनट) और संक्षिप्त centrifugation के बाद मिलाते हुए redissolve।

3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. नैनोएचपीएलसी और एमएस सेट-अप
    1. लोड पचा नमूने पर एक C18 precolumn (कण आकार ] 5 डिग्री मीटर; व्यास ] 300 डिग्री मी) के साथ 0.05% (v/v) trifluoracetic एसिड का उपयोग कर एक (विभाजन मुक्त) नैनो-HPLC उच्च संकल्प के साथ एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित.
    2. Elute एक जलीय-जैविक ढाल के साथ पेप्टाइड्स पर कब्जा कर लिया (एल्यूएंट ए): 5 मिनट 3% बी, 120 मिनट 3% बी से 30% बी, 20 मिनट से 30% बी, 5 मिनट 99% बी, 5 मिनट 99% बी से 3% बी, 15 मिनट 3% बी (प्रवाह दर 300 nL/
      नोट: csBN-एमएस जेल स्लाइस आम तौर पर मध्यवर्ती पेप्टाइड बहुतायत और जटिलता की एक सीमित डिग्री के लिए कम के साथ नमूने में परिणाम. नैनोएलसी-MS/MS विश्लेषण इसलिए उचित संवेदनशीलता और अनुक्रमण गति प्रदान करने के लिए एक सेट-अप के साथ किया जाना चाहिए, उच्च बड़े पैमाने पर संकल्प (gt; 100,000) और अधिकतम गतिशील रेंज (प्रभावी रूप से 3-4 परिमाण के आदेश). हालांकि, यह लंबा स्तंभ आयाम या elution ग्रेडिएंट 3 h से परे विस्तारित की आवश्यकता नहीं है।
    3. एक उत्सर्जक में अलग-अलग एलकथित पेप्टाइड्स (i.d. 75 डिग्री मी; टिप ] 8 $m) मैन्युअल रूप से लगभग 20 सेमी C18 सामग्री के साथ पैक किया गया (कण आकार ] 3 $m)। द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के गर्म स्थानांतरण केशिका (250 डिग्री सेल्सियस) में 2ण्3 केवी (धनात्मक आयन मोड) पर नमूनों को विद्युतस्प्रे करें।
    4. निम्नलिखित साधन सेटिंग्स11के साथ विश्लेषण प्रदर्शन: अधिकतम MS/MS इंजेक्शन समय $ 400 एमएस; बहिष्करण अवधि [ 60 s; न्यूनतम संकेत सीमा $ 5,000 मायने रखता है, शीर्ष 10 अग्रदूतों खंडित; विलगन चौड़ाई ] 1.0 m/z).
      नोट: बड़े पैमाने पर अंशांकन की सुविधा के लिए, प्रतिधारण समय, और डेटासेट या माप की एक बड़ी संख्या में पेप्टाइड संकेतों के असाइनमेंट, यह रुकावट या मापदंडों और हार्डवेयर में परिवर्तन के बिना संबंधित एमएस माप श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है ( अर्थात, एक ही C18 स्तंभ/emitter पर).
  2. प्रोटीन पहचान (एमएस डेटा के रूप में पहले वर्णित11)
    1. "msconvert.exe" उपकरण (ProteoWizard का हिस्सा) का उपयोग कर टुकड़ा आयन स्पेक्ट्रम से शिखर सूचियों निकालें।
    2. 50 पीपीएम पेप्टाइड जन सहिष्णुता के साथ एक प्रारंभिक डेटाबेस खोज में प्रोटीन के लिए असाइन किए गए सभी पेप्टाइड्स के औसत m/z ऑफसेट द्वारा प्रत्येक डेटासेट के लिए सभी अग्रदूत m/z मान शिफ्ट करें।
    3. UniProtKB/Swiss-Prot डेटाबेस (रिलीज 2018]11) के सभी माउस प्रविष्टियों के विरुद्ध एक उपयुक्त खोज इंजन (यहाँ, Mascot 2.6.2) के साथ सही पीक सूचियों खोजें.
    4. का चयन करें "एसिटिल (प्रोटिन एन अवधि)", "कार्बामिडिल (सी)", "Gln ] पायरो-ग्लू (एन-टर्म क्यू), ग्लू | पायरो-ग्लू (एन-टर्म ई)", "ऑक्सिडेशन (एम)", और "प्रोपिओनामाइड (सी)" चर संशोधनों के रूप में।
    5. पेप्टाइड और टुकड़ा सामूहिक सहिष्णुता सेट करने के लिए $ 5 पीपीएम और $ 0.8 दा, क्रमशः, और एक चूक tryptic दरार की अनुमति देते हैं. पेप्टाइड पहचान के लिए अपेक्षा मूल्य कट-ऑफ 0.5 या उससे कम करने के लिए सेट करें। ग़लत धनात्मक खोज दर (FDR) निर्धारित करने के लिए एक decoy डेटाबेस खोज का उपयोग करें। विश्वसनीय पहचान सुनिश्चित करने के लिए एफडीआर को 1% पर सेट करें या अतिरिक्त गुणवत्ता मानदंड लागू करें।
      नोट: प्रस्तुत प्रयोग से अधिक की पहचान की 3,500 प्रोटीन, की एक औसत पेप्टाइड एफडीआर के साथ 4.4 - 0.77% (एन ] 101 टुकड़ा नमूने), या 3,000 प्रोटीन जब पेप्टाइड एफडीआर के लिए सेट किया गया था 1%. महत्वपूर्ण बात, और अधिक कड़े मानदंडों profiled प्रोटीन (2,568) के चयन के लिए इस्तेमाल किया गया. यह सभी प्रोटीन है कि कम से कम दो पेप्टाइड्स के साथ की पहचान की गई शामिल, उनमें से कम से कम एक प्रोटीन विशेष किया जा रहा है, में कम से कम एक 101 टुकड़ा नमूने.
  3. प्रोटीन परिमाणीकरण
    1. एफटी पूर्ण स्कैन से प्राप्त कर रहे हैं कि प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए पेप्टाइड संकेत तीव्रता (पीक मात्रा [PVs]) का उपयोग करें और उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिधारण समय और बड़े पैमाने पर बदलाव के लिए सही (यहाँ, MaxQuant v1.6.3).
    2. एमएस डेटासेट को संदर्भ (कुल औसत) पेप्टाइड elution समय LOESS प्रतिगमन का उपयोग करने के लिए एक-एक करके संरेखित करें। पेप्टाइड्स के लिए PVs असाइन करें या तो सीधे (MS/MS-आधारित पहचान) या परोक्ष रूप से (यानी, उनके मिलान m/z और बहुत संकीर्ण tolerances के भीतर elution समय के आधार पर).
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है इन-हाउस सॉफ्टवेयर के असाइनमेंट के लिए "सम्मिलित" पेप्टाइड्स कहा जाता है. निर्धारित पैरामीटरों के परिणामस्वरूप प्रभावी m/z और elution समय मिलान सहिष्णुता में $ 2 पीपीएम और $ 1 मिनट, क्रमशः (चित्र 2ए, बीदेखें)।
    3. पेप्टाइड भार और आयनन दक्षता में व्यवस्थित रन-टू-रन विविधताओं के लिए पेप्टाइड तीव्रता द्वारा सुधार, पड़ोसी स्लाइस नमूनों के बीच सापेक्ष पेप्टाइड तीव्रता के औसत अंतर से परिकलित किया जाताहै (चित्र 2ब्)।
    4. आंतरिक PV संगतता विश्लेषण द्वारा पहचाने गए बाहरी और शेष गलत-सकारात्मक असाइनमेंट के लिए PV डेटा फ़िल्टर करें.
    5. रिश्तेदार पेप्टाइड बहुतायत प्रोफाइल उपज सभी टुकड़ा डेटासेट पर अपने अधिकतम मूल्यों के लिए प्रत्येक पेप्टाइड के PVs सामान्य.
    6. अंत में, कम से कम दो के औसत के रूप में रिश्तेदार प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल की गणना (और छह या 50% तक, जो भी मूल्य अधिक है) सबसे अच्छा correlating पेप्टाइड प्रोफाइल के तीन लगातार स्लाइस की एक खिड़की पर. यह लापता पीवी मूल्यों के ब्रिजिंग और शोर को कम करने की अनुमति देता है.
      नोट: यह अंत में 2,545 (की 2,568 preselected) प्रोटीन प्रोफाइल (चित्र 2डी) के परिणामस्वरूप.
  4. प्रोटीन परिसरों की विशेषता
    1. पहले प्रदर्शन पीक का पता लगाने के द्वारा प्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण स्थानीय maxima विधि का उपयोग कर, और लगातार इन चोटियों के लिए सामान्य वितरण फिट, स्थिति उपज (यानी, टुकड़ा सूचकांक या स्पष्ट जटिल आकार) उनके अधिकतम और FWHM (पूर्ण चौड़ाई पर) अर्ध-अधिकतम तीव्रता) मान (चित्र 4का इनसेट)।
      नोट: डेटासेट में, प्रोफाइल स्वचालित रूप से कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं। सबसे छोटी FWHM मूल्यों दृष्टिकोण के प्रभावी आकार संकल्प का संकेत कर रहे हैं (यहाँ, 6 x 0.25 $ 1.5 मिमी).
    2. परिभाषित आणविक द्रव्यमान के साथ संदर्भ प्रोटीन जटिल चोटियों का उपयोग करें (के रूप में UniProtKB/स्विस-प्रोट डेटाबेस में रिपोर्ट) log10 के रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण के लिए (पूर्व आणविक द्रव्यमान) स्पष्ट आणविक आकार के लिए टुकड़ा संख्या सूचकांक परिवर्तित करने के लिए मान (यानी, kDa में स्पष्ट जटिल आकार).
      नोट: नमूने में 23 मार्कर परिसरों का चयन इस अध्ययन में किया गया था (चित्र 4) प्रोफाइल चोटियों के मोनोडिफिकेशन आकृतियों के आधार पर, (पप) आणविक भार का प्रयोगात्मक समर्थन, और (iii) जांच बी एन-पेज जेल वर्गों के साथ वितरण।

Representative Results

पारंपरिक बीएन-एमएस अध्ययन के विशाल बहुमत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हाल ही में स्थापित उच्च संकल्प CSBN-MS दृष्टिकोण mitochondrial और प्लास्टिड तैयारी है कि कर रहे हैं (i) आसानी से उपलब्ध हैं के लिए लागू किया गया है, (ii) सीमित जटिलता है, और (iii) एक्सप्रेस उच्च घनत्व पर लक्ष्य (मेम्ब्रेन) प्रोटीन कॉम्प्लेक्स। इस प्रोटोकॉल के बारे में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन व्यक्त गैर-mitochondrial झिल्ली के लिए उच्च संकल्प complexome रूपरेखा के आवेदन प्रदान करता है, जिसके बारे में परिसरों में उनके एकीकरण पर कम जानकारी उपलब्ध है. प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, हम घनत्व ढाल centrifugation द्वारा प्राप्त माउस गुर्दे से एक endosome समृद्ध झिल्ली तैयारी चुना है.

इस तैयारी के अनुकूलन मार्कर प्रोटीन TPC1 द्वारा निर्देशित किया गया है कि intracellular आयन चैनलों मुख्य रूप से जल्दी और रीसाइक्लिंग endosomes12के लिए स्थानीय रूपों . यह भी अत्यधिक गुर्दे के समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, के रूप में गुर्दे के ऊतकों वर्गों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है (चित्र 1ए)। इन झिल्ली धीरे solubilized थे (ComplexioLyte 47 एक कम प्रोटीन पर: 1:8 के डिटर्जेंट अनुपात) और ultracentrifugation द्वारा एक sucrose तकिया पर ध्यान केंद्रित. बाद अतिरिक्त कम आणविक वजन घटकों को हटाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम निकला (यानी, डिटर्जेंट, लिपिड, लवण, कार्बनिक पॉलिमर, और चयापचयों) कि preparative BN-PAGE जुदाई के संकल्प पर नकारात्मक प्रभाव करते हैं.

एक देशी पर जटिल जुदाई 1%-13% (w/v) polyacrylamide ग्रेडिएंट जेल (चित्र 1बी, मध्य पैनल) बहुत कम प्रवास कलाकृतियों के साथ दृढ़ता से दाग प्रोटीन बैंड दिखाया. एक संकीर्ण BN-PAGE जेल पट्टी के एसडीएस-पेज जुदाई (चित्र 1बी, फ्रेम लाल रंग में बॉक्स्ड) एक दूसरे आयाम के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद अलग TPC1 संबद्ध जटिल आबादी का एक अच्छी तरह से हल पैटर्न दिखाया (चित्र 1बी , ऊपरी पैनल, लाल तीर द्वारा चिह्नित), सबसे अधिक संभावना अतिरिक्त प्रोटीन subunits और / या posttranslational संशोधनों के साथ सहयोग से उत्पन्न (जैसे ग्लाइकोसिलेशन12के रूप में). ब्याज की एक 3 सेमी अनुभाग excised किया गया था, तय, और cryomicrotome टुकड़ा करने के लिए संसाधित के रूप में वर्णित11. इस प्रक्रिया के अलग-अलग कदम (विशेष रूप से, व्यापक जेल अनुभाग के सटीक संरेखण), जो नमूना के दौरान संकल्प के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है, साथ वीडियो में प्रलेखित रहे हैं. एम्बेडेड जेल अनुभाग अंत में 0.25 मिमी की एक समान मोटाई के साथ 101 जेल स्लाइस में काट दिया गया था (चित्र 1बी, कम पैनल), जो अलग से पचा रहे थे और उच्च प्रदर्शन एलसी-युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया.

आकार संकल्प के अलावा, प्रोटीन परिमाणीकरण की गुणवत्ता सफल complexome रूपरेखा के लिए महत्वपूर्ण है. एमएस सेट अप और सेटिंग्स का इस्तेमाल के साथ, नमूनों का विश्लेषण काफी व्यापक था, 1,000 से अधिक प्रोटीन और 10,000 पेप्टाइड्स (8,200 जिनमें से प्रोटीन-विशिष्ट थे) प्रति स्लाइस की औसत पहचान में जिसके परिणामस्वरूप, और लगभग 3,000 प्रोटीन और 43,000 पेप्टाइड्स (38,500 जिनमें से प्रोटीन-विशिष्ट थे) कुल में. फिर भी, डेटा पर निर्भर एमएस/एमएस अनुक्रमण और गतिशील रेंज में इसकी सीमाओं की स्टोकेस्टिक प्रकृति के कारण, तीव्रता जानकारी अभी भी कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के लिए खंडित थी। इसलिए, एक विस्तृत एमएस डेटा संसाधन प्रक्रिया11पेप्टाइड संकेतों का सटीक असाइनमेंट पर आधारित है कि किया गया था (पीक मात्रा [PVs] ] पेप्टाइड से संबंधित संकेत तीव्रता m/z और समय पर एकीकृत) डेटासेट की पूरी श्रृंखला पर।

जैसा कि चित्र 2ए, बीमें दिखाया गया है, अंशांकन के बाद बने रहने वाले द्रव्यमान और प्रतिधारण समय में पेप्टाइड संकेतों के विचलन एमएस-अनुक्रमके के लिए समान थे और अप्रत्यक्ष रूप से असाइन किए गए PVs के लिए (lt की बहुत संकीर्ण सहिष्णुता के साथ;1 पीपीएम और lt;0.5 मिनट 95% के लिए PVs), झूठी सकारात्मक पीवी काम के लिए एक बहुत कम दर का संकेत. शेष बाहरी अन्य संबंधित PVs के साथ उनकी निरंतरता के आधार पर फ़िल्टर किए गए थे। के बाद से सभी एमएस माप लगातार एक ही LC-MS सेट-अप पैरामीटर या हार्डवेयर घटकों में परिवर्तन के बिना प्रदर्शन किया गया, चलाने के लिए चलाने के लिए विविधताओं (एक नमूना में सभी पीवी तीव्रता के औसत के रूप में निर्धारित पड़ोसी स्लाइस में उन लोगों के सापेक्ष) पीवी डेटासेट के पुन: स्केलिंग द्वारा छोटे और आसानी से समाप्त कर दिए गए थे (चित्र 2ब्) जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड तीव्रता जानकारी तो 2,545 प्रोटीन रिश्तेदार बहुतायत प्रोफाइल के पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था. जैसा कि चित्र 2डीमें दिखाया गया है, इन प्रोटीन प्रोफाइल के 75% से अधिक कम से कम तीन स्वतंत्र प्रोटीन-विशिष्ट पेप्टाइड्स पर आधारित थे.

इसके बाद, प्रोटोकॉल प्रोटीन परिसरों के समाधान के लिए BN-PAGE जेल नमूने के कदम आकार की प्रासंगिकता का मूल्यांकन किया. इस उद्देश्य के लिए, स्लाइस डेटासेट दो, तीन, या चार लगातार स्लाइस से पीवी जानकारी संक्षेप द्वारा जुड़े हुए थे, इस प्रकार 0.5 मिमी, 0.75 मिमी, और 1 मिमी के कदम आकार के लिए परिणाम अनुकरण (0.25 मिमी के मूल नमूने की तुलना में). चित्र 3 प्रोटीन TPC1 के लिए परिणामी बहुतायत प्रोफाइल को एक उदाहरण (ए-डी) के रूप में दिखाता है। 0ण्25 मि.मी. पर, टीपीसी1 संबद्ध जटिल जनसंख्या के सापेक्ष तीव्रता और आकार पृथक्करण (चित्र 3क) पश्चिमी दाग विश्लेषण केपरिणामोंके साथ अच्छी तरह से सहमत थे ( चित्र 1बी, ऊपरी पैनल); हालांकि, प्रोफ़ाइल कुछ शोर दिखाया, ज्यादातर लापता मूल्यों से जिसके परिणामस्वरूप ("गैप") परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया पीवी मैट्रिक्स में.

0ण्5 उउ के संगत दो स्लाइसों में शामिल होने से टीपीसी1 संबद्ध परिसरों की सही तीव्रता और पृथक्करण बनी रहती है तथा परिमाणीकरण शोर(चित्र 3ठ)को हटा दिया गया है। इसके विपरीत, 0ण्75 मिमी और 1 मिमी के बड़े चरण आकार (चित्र 3ब्, डी) के कारण आकार रिज़ॉल्यूशन का नुकसान हुआ और टीपीसी1 जटिल उप-जनसंख्या के भेदभाव को समाप्त कर दिया गया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रकाशित पारंपरिक बी एन-एमएस विश्लेषण के विशाल बहुमत मैन्युअल रूप से कटौती 2 मिमी स्लाइस (लगभग 60 पूरे जेल लेन को कवर करने के लिए)7,8,9,10का उपयोग करें ।

प्रवास दूरी या टुकड़ा सूचकांक का आणविक आकार में रूपांतरण आम तौर पर मार्करों पर आधारित है, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध देशी मानक प्रोटीन या ज्ञात उपइकाई संरचना के साथ अच्छी तरह से विशेषता अंतर्जात प्रोटीन परिसरों (ज्यादातर [सुपर] माइटोकोंड्रियाल ऑक्सीडेटिव श्वसन श्रृंखला [OXPHOS])13के परिसरों | हालांकि, के बाद से बीएन-पेज जुदाई प्रभावी आणविक पार अनुभाग है कि न केवल आणविक द्रव्यमान द्वारा निर्धारित किया जाता है पर आधारित है, लेकिन यह भी 3 डी संरचना और जुड़े लिपिड की संख्या, डिटर्जेंट, और Coomassi अणुओं, व्यक्तिगत प्रोटीन दिखा सकते हैं बड़ा विचलन. इसलिए, यह मार्कर11के रूप में प्रोटीन परिसरों के बड़े सेट का उपयोग करने के लिए चुना गया था। चित्रा 4 में प्लॉट में काले वृत्त के रूप में दिखाए गए प्रतिनिधि उपइकाई के साथ 23 चयनित मार्कर दिखाई देते हैं, जो इसकी अनुमानित आणविक द्रव्यमान के लॉग10 मानों को दर्शाता है (यूनिप्रोटKB/स्विस-प्रोट डेटाबेस के अनुसार) बनाम। इसी प्रोफ़ाइल पीक अधिकतम का टुकड़ा सूचकांक. बाद स्वचालित गाऊसी से प्राप्त किए गए सापेक्ष बहुतायत डेटा के लिए फिट बैठता है, के रूप में चित्र 4 के इनसेट में दिखाया गया है chaperone BCS1 के साथ उदाहरण दिखा. रैखिक प्रतिगमन (लाल रेखा) स्पष्ट आणविक आकार है, जो 160-630 kDa से लेकर, जांच जेल अनुभाग के साथ करने के लिए टुकड़ा सूचकांक मूल्यों को परिवर्तित करने के लिए एक समारोह प्रदान की.

अंत में, विश्लेषण अच्छी तरह से विशेषता परिसरों के बारे में जानकारी प्रदान की और उपन्यास subunits और जटिल विधानसभाओं के अस्तित्व का प्रदर्शन किया. complexome के विभिन्न पहलुओं पर प्रकाश डाला उदाहरण चित्र 5 में दिखाए गए हैं (ए-सी: प्रोटीन व्यक्त या अधिमानतः endosomal डिब्बों में स्थित; डी-एफ: अन्य subcellular स्थानीयकरण से परिसरों). लौह-परिवहन प्रोटीन फेरिटिन को 24 प्रकाश (FRIL1) और/या भारी (FRIH) उपइकाइयों से परिसरों का निर्माण करने के लिए जाना जाता है, जिसमें कुल आण्विक भार 440 केडीए14 (चित्र 5ए,भरा तीर) होता है। उपइकाई प्रोफाइल (चित्र 5क) जटिल के कम से कम दो छोटे रूपों के अस्तित्व का सुझाव देते हैं (360 केडीए और 340 केडीए; खुले तीरों के एक स्पष्ट द्रव्यमान के साथ) अलग भारी/प्रकाश श्रृंखला stoichiometries के साथ (बेहतर दिखाई rescaling के बाद चित्र 5कका इनसेट बहुतायत है जो अंत:कोसों में प्रचुर मात्रा में विद्यित होती है।

इसके विपरीत, nicalin-nomo1परिसरों 15 (चित्र 5डी), गामा-secretase कोर परिसर16 (चित्र 5बी), और जीपीआई-ट्रांसमीडस मशीनरी17 (चित्र 5ई) शो तय पूरे आकार रेंज पर उनके कोर subunits के बहुतायत अनुपात और अतिरिक्त प्रोटीन के साथ सहयोग से स्वतंत्र. यह इंगित करता है कि उनकी उपइकाइयें एक-दूसरे के लिए अनन्य हैं। Vacuolar एच+-ATPass multiप्रोटीन परिसरों के आसपास 900 kDa की कुल आणविक वजन के साथ एक मॉड्यूलर तरीके से 20 से अधिक subunits के एक पूल से इकट्ठे हुए हैं. चित्र 5सी कम से कम 17 उपइकाइयों से अलग रचनाओं के साथ उप-परिसरों का पता चलता है, या तो प्रयोगात्मक शर्तों द्वारा उत्पन्न जैविक (डिस) विधानसभा मध्यवर्ती या उपपरिसरों का प्रतिनिधित्व करता है, जिनमें से कुछ भी किया गया है हाल ही में बीएन-एमएस अध्ययन18में मनाया | एक अन्य बहु-प्रोटीन जटिल उदाहरण है प्रोटीसोम19 (चित्र 5च)। अल्फा और बीटा subunits के बहुतायत प्रोफाइल के बंद निरीक्षण 20S proteasome कोर बनाने के आकार में सूक्ष्म अंतर के साथ दो प्रमुख जटिल आबादी पता चलता है (590 kDa और 575 kDa, ग्रे तीर द्वारा संकेत दिया) और तीन बीटा subunits के एकीकरण.

सारांश में, सी एस बी एन-एमएस संकुलोम एन्डोसोम समृद्ध गुर्दे झिल्ली की रूपरेखा (i) परिसरों में वर्दी, कम प्रचुर लक्ष्य प्रोटीन के एकीकरण के बारे में व्यापक और विस्तृत परिणाम प्रदान करती है, (ii) सामान्य जटिल उपइकाई संरचना और स्टोइकियोमेट्री, और (iii) जटिल विषमताएं, संरचना, और (डिस) विधानसभा मध्यवर्ती।

Figure 1
चित्रा 1: एक मार्कर के रूप में intracellular चैनल TPC1 का उपयोग कर माउस गुर्दे से solubilized endosome समृद्ध झिल्ली की तैयारी बीएन-पेज जुदाई। (क)कोनफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा गुर्दे के समीपस्थ नलिकाओं में टीपीसी1 प्रोटीन का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण। ग्रीन: विरोधी TPC1 एंटीबॉडी12 माध्यमिक Cy3-biotinylated बकरी विरोधी रैबिट आईजीजी के साथ कल्पना की धुंधला; लाल: biotinylated लोटस टेट्रागोनोलोबस लैक्टिन (एलटीएल, 10 डिग्री सेल्सियस, FITC-संयुग्मी) समीपस्थ ट्यूबुलस कोशिकाओं की चमकदार सतह अंकन। इनसेट एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक TPC1-KO गुर्दे से एक इसी अनुभाग के धुंधला से पता चलता है. सफेद पैमाने पर सलाखों के 20 डिग्री मीटर हैं. नोट के भी इंट्रासेल्यूलर vesicles में मजबूत TPC1 अभिव्यक्ति है, स्वतंत्र प्रयोगों से जाना जाता है जल्दी और रीसाइक्लिंग endosomes12का प्रतिनिधित्व करने के लिए. (B)1%-13% (w/v) polyacrylamide ग्रेडिएंट जेल पर 2.5 मिलीग्राम सोलुबिलाइज़्ड एंडोसोम-समृद्ध झिल्ली का प्रारंभिक बीएन-पेज पृथक्करण। एक संकीर्ण लेन (लाल रंग में फंसाया) बाद में एसडीएस-पेज/पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (ऊपरी पैनल) के लिए काटा गया था, विभिन्न TPC1 संबद्ध परिसरों और ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न (लाल तीर: विरोधी TPC1/विरोधी-राबिट HRP/ECL प्रधानमंत्री; हरे: पदों और भविष्यवाणी की कुल प्रोटीन दाग द्वारा पहचाने गए मार्कर प्रोटीन परिसरों की जनता [एमडीए][SYPRO रूबी दाग]) का धब्बा। दाएँ से बाएँ: Na+/K+-transporting ATPase, Cytochrome b-c1 जटिल dimer, एटीपी synthase, NADH: ubicuinone oxidoreductase. जेल लेन से ब्याज की एक 3 सेमी अनुभाग excised था, ऊतक embedding मध्यम में एम्बेडेड, घुड़सवार, और 101 वर्गों में कटा हुआ (0.25 मिमी) प्रोटीन प्रवास सामने एक cryomicrotome का उपयोग कर के साथ (कम पैनल; वीडियो लिंक देखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमएस संकेत असाइनमेंट और परिमाणीकरण की सटीकता का निर्धारण करने वाले मुख्य पैरामीटर के साथ-साथ विश्लेषण की गहराई। (क)MS/z अनुक्रम (लाल बार) के बाद सापेक्ष द्रव्यमान त्रुटियों (पीपीएम में) का वितरण और अप्रत्यक्ष रूप से असाइन किया गया (अर्थात, निकट मिलान द्रव्यमान और प्रतिधारण समय के आधार पर, प्रोटोकॉल; ब्लू बार्स) पेप्टाइड संकेतों को देखें। यह एक अंतिम जन त्रुटि का पता चलता है ;1 पीपीएम (संकेतों के 95% के लिए / (बी)पेप्टाइड संकेतों के उत्सर्जन समय संरेखण के बाद कुल औसत से नैनो-HPLC प्रतिधारण समय विचलन का वितरण, Loess प्रतिगमन का उपयोग कर ( प्रोटोकॉल देखें) और रंग कोडिंग में इस्तेमाल के रूप में (ए) में इस्तेमाल किया. समय त्रुटि कम से कम 30 s के लिए है gt; 95% पेप्टाइड संकेतों / असाइन किए गए PVs. (C)रन-टू-रन भिन्नता के कुल एमएस तीव्रता दो पड़ोसी नमूनों के औसत के सापेक्ष प्लॉट किया गया. इन पैमाने कारकों व्यवस्थित तकनीकी त्रुटियों को कम करने के लिए कच्चे PV तालिकाओं के लिए लागू किए गए थे। (घ)प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत प्रोफाइल की गणना के लिए उपयोग की जाने वाली पेप्टाइड सूचना। outliers के लिए प्रोटीन-विशिष्ट पेप्टाइड्स छानने के बाद, खराब रन बनाए, या एकल पहचान (प्रोटोकॉल देखें), 2,545 प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल निर्धारित किए गए थे, जिनमें से 75% उचित विश्वास के साथ कम से कम तीन पेप्टाइड्स पर आधारित थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: TPC1 के complexome संकल्प पर जेल नमूना में कदम आकार के महत्वपूर्ण प्रभाव. Datasets 1, 2, 3, और 4 लगातार स्लाइस (ए-डी, क्रमशः) के समूहों में संकेत तीव्रता संक्षेप द्वारा शामिल हो गए थे और समान रूप से कार्रवाई के रूप में संकेत जेल टुकड़ा करने में विभिन्न कदम आकार अनुकरण करने के लिए. TPC1 प्रोफ़ाइल 0.25 मिमी पर कुछ (ओवरसेम्पलिंग) शोर से पता चलता है, लेकिन तीन जटिल आबादी का अच्छा आकार संकल्प (यह भी चित्र 1बीदेखें), जो मोटे तौर पर एक 0.5 मिमी कदम चौड़ाई पर संरक्षित है. इन आबादी के भेदभाव के रूप में खो जाता है 1 मिमी संपर्क किया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: स्पष्ट आणविक वजन का निर्धारण| परिभाषित आणविक संरचना के साथ 23 मार्कर परिसरों (के रूप में संकेत दिया, UniProtKB/स्विस-प्रोट के अनुसार) आकार मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया गया. उनके अपेक्षित आण्विक भार (केडीए में) के लघुगणक मूल्यों को बनामप्लॉट किया गया था। संकेत प्रतिनिधि प्रोटीन subunit के प्रोफ़ाइल शिखर अधिकतम टुकड़ा सूचकांक (काले रंग में भरा हलकों). रैखिक प्रतिगमन इस डेटा के लिए फिटिंग (लाल रेखा) स्पष्ट आणविक वजन के लिए टुकड़ा सूचकांक मूल्यों को परिवर्तित करने के लिए एक समारोह प्रदान की है. पीक मैक्सिमा स्वचालित गौसियन द्वारा निर्धारित किए गए थे प्रोटीन प्रोफ़ाइल चोटियों के लिए फिट बैठता है के रूप में इनसेट में दिखाया गया है (दाएं) chaperone प्रोटीन BCS1 के लिए (नीले रंग में प्राथमिक डेटा, फिट सीमाओं नारंगी लाइनों द्वारा संकेत दिया, लाल रंग में फिट समारोह). इसके अलावा, इन एक 1.5 मिमी जेल के आसपास फैले सबसे तेज ध्यान केंद्रित परिसरों के साथ, इन निर्धारित चोटी आधा अधिकतम चौड़ाई फिट बैठता है (हरी रेखा, 6.5 स्लाइस, या उदाहरण के लिए 1.6 मिमी) दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रोटीन जटिल सबयूनिट प्रोफाइल के उदाहरण| सापेक्ष प्रोटीन बहुतायत बनाम. आभासी आण्विक भार फेरिटिन की भारी और हल्की श्रृंखला के लिए प्लॉट किया गया (ए) फेरिटिन सबयूनिट स्टोइकियोमिति की आण्विक विषमता का खुलासा करता है, जो बहुतायत (इनसेट) के पुन: स्केलिंग के बाद अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। भरा हुआ तीर और खुले तीर क्रमशः पूर्ण जटिल (440 केडीए) और दो उप-परिसरों को निरूपित करते हैं। गामा-सेक्रेटस (बी) उपइकाइयों को मात्रात्मक रूप से एकल-कोर जटिल जनसंख्या में एकीकृत किया जाता है। धानी एच+-ATPases (सी) के उपपरिसरों अलग उपइकाई संरचना के साथ कई विधानसभाओं का प्रदर्शन किया, सभी endosomes में व्यक्त की. नोमो1 और निकेलिन प्रोटीन (डी) एक अनन्य जटिल (जीपीआई-ट्रांसमीडेस) का गठन करता है, जो कई परिसरों का निर्माण करने वाली एक बहु-सबयूनिट एंजाइमी मशीनरी है। (ई) 20S प्रोटीसोम कोर संकुल दिखा (च) दो आबादी के साथ एक सूक्ष्म उपजटिल पैटर्न ग्रे में तीर द्वारा संकेत दिया, सभी अन्य subcellular स्थानीयकरण से उत्पन्न. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रस्तुत अध्ययन csBN-एमएस तकनीक पर बनाया पहले एक mitochondrial तैयारी11 के साथ बेंचमार्क और नमूना तैयारी में सुधार शामिल, जेल प्रसंस्करण, और एमएस डेटा मूल्यांकन. बड़े पैमाने पर जुदाई बीएन-पेज जेल के एक वर्ग के केंद्रित विश्लेषण mitochondrial झिल्ली के साथ अध्ययन करने के लिए तुलनीय गुणवत्ता उपायों दिखा डेटा का एक व्यापक सेट प्रदान की. बड़े पैमाने पर और प्रतिधारण समय त्रुटियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चलाने के लिए रन विविधताओं बहुत कम रखा गया था और विश्वसनीय प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए आधार प्रदान की. आकार रिज़ॉल्यूशन अच्छा दिखाई दिया, जिसमें छः स्लाइसों के रूप में अर्ध-अधिकतम शिखर चौड़ाई (1.5 मिमी, चित्र 4) और 10% से कम के सापेक्ष आकार के अंतर (चित्र 3, चित्र 5ए) के साथ। इन मूल्यों को पूरी तरह से mitochondria के पिछले CSBN-MS विश्लेषण के आकार संकल्प गुणवत्ता को पूरा नहीं किया (छोटे जेल नमूना कदम आकार चुना के बावजूद), लेकिन वे काफी पारंपरिक बीएन-एमएस या आकार बहिष्कार एमएस के प्रदर्शन से बेहतर कर रहे हैं दृष्टिकोण20 कि हाल ही में लोकप्रिय हो गए हैं.

एक उच्च प्रभावी जटिल आकार संकल्प के महत्व चित्र 3 में सिमुलेशन प्रयोग द्वारा रेखांकित किया है (TPC1 संबद्ध परिसरों का उपयोग करके) कि शायद ही 2D BN/SDS-पेज पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा हल किया जा सकता है (चित्र 1बी). इन परिणामों का सुझाव है कि इस मामले में 0.25 मिमी टुकड़ा कुछ oversampling में हुई, लेकिन यह अभी भी प्रभावी आकार संकल्प समझौता किए बिना "परिमाणीकरण शोर" के उन्मूलन के लिए उपयोगी साबित हुआ. इस प्रकार, पिछले परिणाम11के साथ लाइन में, एक नमूना कदम आकार $0.3 मिमी आम तौर पर सिफारिश की है.

विशेष रूप से, TPC1 संबद्ध परिसरों के भेदभाव पूरी तरह से 1 मिमी जेल नमूना है, जो पारंपरिक बीएन एमएस5,6में मैनुअल टुकड़ा करने के द्वारा प्रदान की सबसे छोटी कदम आकार है के साथ खो दिया है. यह इस तथ्य की व्याख्या कर सकता है कि शक्तिशाली एमएस प्रौद्योगिकियों के उपलब्ध होने के बावजूद, बहुत कम प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और उपइकाइयों की पहचान की गई है, जो कॉम्पलेक्स प्रोफाइलिंग द्वारा डी नोवो की पहचान की गई है। इसके अच्छे समाधान की शक्ति के अलावा, csBN-एमएस उच्च बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है. झिल्ली से बंधे परिसरों और घुलनशील प्रोटीन परिसरों 50 केडीए से कई एमडीए तक प्रभावी ढंग से न्यूनतम पूर्वाग्रह11के साथ एक ही प्रयोग में हल किया जा सकता है। वैकल्पिक जुदाई आकार बहिष्करण या आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी की तरह complexome रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया तकनीक के साथ यह विरोधाभास है, जो कुछ आकार पर्वतमाला या प्रभारी गुणों के साथ घुलनशील प्रोटीन के सबसेट के साथ काम करते हैं. नकारात्मक पक्ष पर, CSBN-MS कम स्केलेबल है (अधिकतम लोड $ 3 प्रति जेल मिलीग्राम प्रोटीन), तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और automatized नहीं किया जा सकता है.

कुल मिलाकर, परिणाम प्रदर्शित करता है कि csBN-MS-आधारित complexome रूपरेखा सफलतापूर्वक गैर-mitochondrial लक्ष्यों के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी कुछ संबद्ध चुनौतियों का संकेत. इस प्रकार, कुशल निष्कर्षण और प्रोटीन परिसरों के जैव रासायनिक स्थिरता अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है, और सफाई कदम और अभी भी सीमित हो सकता है. जांच आकार खिड़की के भीतर, अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित की संख्या, monodisperse प्रोटीन परिसरों वास्तव में काफी कम था (डेटा नहीं दिखाया गया) एक mitochondrial नमूना की तुलना में. यह भी स्वीकार्य जेल जुदाई प्राप्त करने के लिए बीएन-पेज नमूना भार को कम करने के लिए सिफारिश की है। उच्च भार व्यापक जेल लेन है कि और अधिक टुकड़ा करने के लिए ठीक से प्रक्रिया करने के लिए कठिन हैं की आवश्यकता हो सकती है (वीडियो के साथ देखें). इसके अलावा, नमूनों की प्रोटीन जटिलता अधिक था (लगभग दो गुना) mitochondria व्युत्पन्न टुकड़ा डाइजेस्ट की तुलना में, अधिक लापता पीवी मूल्यों और एक कम गतिशील रेंज के लिए अग्रणी. वास्तव में, चित्र 5 में दिखाए गए परिसरों का हिस्सा होने की अपेक्षा कुछ छोटे प्रोटीन विश्लेषणों में गायब थे। इन समस्याओं को भविष्य में तेजी से और अधिक संवेदनशील एमएस उपकरणों या डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण मोड का उपयोग करके हल किया जा सकता है.

नमूना तैयारी प्रोटीन जटिल पुनर्प्राप्ति, स्थिरता, और जेल जुदाई गुणवत्ता के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है. पैरामीटर और प्रक्रियाओं प्रत्येक स्रोत ऊतक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, सेल lysate, झिल्ली (fraction), और ब्याज की प्रोटीन जटिल. CSBN-MS के अनुप्रयोगों का विस्तार करने में मदद कर सकते हैं कि निम्न सामान्य अनुशंसाएँ प्रदान की जाती हैं:

(i) ताजा नमूने तैयार करना और वार्मिंग/फ्रीजिंग, मजबूत कमजोर पड़ने, बफर स्थितियों में परिवर्तन और अनावश्यक विलंब से बचना;

(ii) उन बफरों का उपयोग करना जो अनिवार्य रूप से लवणों से रहित हैं (500-750 एम बीटाइन या एमिनोकैप्रोइक एसिड के साथ बदलें), एक तटस्थ पीएच के बारे में, और गैर-डेनेट्यूरिंग डिटर्जेंट (प्रोटीन: डिटरजेंट अनुपात के बीच 1:4-1:10 झिल्ली के solubilization के लिए) के 1% तक युक्त प्रोटीन परिसरों, घुलनशील प्रोटीन परिसरों के लिए आवश्यक कोई डिटर्जेंट;

(iii) विश्लेषणात्मक बीएन-पेज द्वारा डिटर्जेंट स्थितियों का सावधानीपूर्वक परीक्षण और समायोजन, क्योंकि ये जटिल विलेबिलाइजेशन की दक्षता, नमूना, स्थिरता और एकरूपता में झिल्ली प्रोटीन परिसरों के प्रतिनिधित्व को दृढ़ता से प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटीन-डिटर्जेंट मिसेल। बाद प्रोटीन के लिए आवश्यकताएँ बीएन-पेज जैल पर अलग बैंड / जटिल आबादी के रूप में ध्यान केंद्रित करने के लिए कर रहे हैं। पिछले साहित्य तटस्थ डिटर्जेंट की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है. तथापि, डीडीएम (एन-डोडेसिल जेड-डी-माल्टोसाइड)1,2,4,5,6 और अंकोनिन3,5,7,8, 9,10,13,18 अब तक बी एन-एमएस विश्लेषण के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्प रहे हैं। इस बात पर बल दिया जाना चाहिए कि किसी भी डिटर्जेंट की स्थिति अनिवार्य रूप से solubilization दक्षता और प्रोटीन बातचीत के संरक्षण के बीच एक समझौते का प्रतिनिधित्व करता है और समान रूप से लक्ष्य प्रोटीन और स्रोत सामग्री के सभी प्रकार के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है;

(पअ) फाइब्रिल, फिलामेंट, पॉलीलिसिन, डीएनए, और प्रचुर मात्रा में कम आणविक भार घटकों (अर्थात, चयापचयों, लिपिड, या पेप्टाइड्स) जैसे आवेशित पॉलिमर निकालना। यह ultracentrifugation द्वारा पूरा किया जा सकता है, जेल निस्पंदन, या डायलिसिस. यह कुल सेल या ऊतक lysates के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है;

(v) Coomassie जी-250 जोड़ना (अंतिम एकाग्रता 0.05%-0.1%) और sucrose (लोडकरने के लिए घनत्व में वृद्धि करने के लिए, अंतिम एकाग्रता 10%-20% [w/v]) बस लोड करने से पहले नमूना करने के लिए, कम ultracentrifugation द्वारा स्पष्ट करने के लिए, क्षोभ के बिना नमूना लोड, और उसके तुरंत बाद चलाने शुरू करते हैं.

भविष्य के परिप्रेक्ष्य के रूप में, CSBN-MS-आधारित complexome रूपरेखा प्रोटीन जटिल गतिशीलता या विशिष्ट जैविक स्थितियों से संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए मल्टीप्लेक्सिंग के लिए विकल्प प्रदान करता है। आकार-अपवर्जन आधारित21 के लिए प्रस्तावित के रूप में चयापचय लेबल नमूनों की संयुक्त जुदाई सीधा दिखाई देता है, लेकिन यह इस्तेमाल जुदाई से स्वतंत्र रूप से होने वाली परिसरों में सहज subunit विनिमय द्वारा बाधित किया जा सकता है विधि. वैकल्पिक रूप से, लेबल नमूने पड़ोसी जेल गलियों में हल किया जा सकता है, जो तब सह टुकड़ा या उच्च संवेदनशीलता और मजबूती के साथ अंतर विश्लेषण के लिए संयुक्त बाद पचा जा सकता है.

Disclosures

लेखक Uwe Schulte एक कर्मचारी और Logopharm GmbH के शेयरधारक है कि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया ComplexioLyte 47 का उत्पादन है. कंपनी एक गैर लाभ के आधार पर शैक्षणिक संस्थानों के लिए ComplexioLyte अभिकर्मकों प्रदान करता है.

Acknowledgments

इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन) द्वारा समर्थित किया गया था - परियोजना आईडी 403222702 - SFB 1381 और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति CIBSS के तहत - EXC-2189 - परियोजना आईडी 390939984. हम तकनीकी सहायता के लिए काटजा जैप को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio Rad #1610158 Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio Rad #1610154 Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain Bio Rad #1703127 Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250 Serva no. 35050 Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47 Logopharm CL-47-01 Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium Leica Biosystems 14020108926 Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm Merck IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml n.a. n.a. any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade n.a. n.a. any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long n.a. n.a. mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml Eppendorf Nr. 0030108116 highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin Promega V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm Dionex / Thermo Scientific P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) New Objective FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) Dr. Maisch GmbH r13.93. columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody Gramsch Laboratories custom production described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories CY-1300 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated Vector Laboratories #B1325 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950 Leica Biosystems 14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit Bio Rad n.a. for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System PeqLab n.a. for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera Zeiss / Photometrics n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel) Ismatec ISM940 for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers) selfmade, alternatively Bio Rad 1652000 or 1652001 for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor Sorvall / Thermo Scientific n.a. for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC Dionex / Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMAZQ

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References

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Cryoslicing BN-MS विश्लेषण द्वारा उच्च संकल्प Complexome प्रोफ़ेशनल
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Müller, C. S., Bildl, W., Klugbauer, N., Haupt, A., Fakler, B., Schulte, U. High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis. J. Vis. Exp. (152), e60096, doi:10.3791/60096 (2019).

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