Høyoppløselig Complexome profilering av Cryoslicing BN-MS analyse

Summary

En allsidig cryoslicing BN-MS-protokoll som bruker en mikrotomen, presenteres for complexome profilering med høy oppløsning.

Abstract

Proteiner generelt utøve biologiske funksjoner gjennom interaksjoner med andre proteiner, enten i dynamiske protein forsamlinger eller som en del av stabilt dannet komplekser. Sistnevnte kan elegant løses i henhold til molekylær størrelse ved hjelp av Native polyakrylamid gel elektroforese (BN-side). Sammenkobling av slike separasjoner til sensitive masse massespektrometri (BN-MS) har vært veletablert og teoretisk gir en grundig vurdering av utvinnbare complexome i biologiske prøver. Imidlertid er denne tilnærmingen ganske arbeidskrevende og gir begrenset kompleks størrelse oppløsning og følsomhet. Også har sin søknad forble begrenset til rikelig mitokondrie og plastid proteiner. Således, for et flertall av proteiner, er informasjon om integrering i stabile protein komplekser fortsatt mangler. Presentert her er en optimalisert tilnærming for complexome profilering bestående av preparativ-skala BN-side separasjon, sub-millimeter prøvetaking av brede gel baner ved cryomicrotome kutting, og masse spectrometric analyse med etikett-fri protein kvantifisering. Prosedyrene og verktøyene for kritiske trinn er beskrevet i detalj. Som et program, rapporten beskriver complexome analyse av en solubilized endosome-beriket membran brøkdel av mus nyrer, med 2 545 proteiner profilert totalt. Resultatene viser identifisering av uniform, lav overflod membran proteiner som intracellulære ion kanaler samt høy oppløsning, komplekse protein montering mønstre, inkludert glykosylering isoformene. Resultatene er enige med uavhengige biokjemiske analyser. Oppsummert gir denne metodikken for omfattende og objektiv identifisering av protein (super) komplekser og deres delenhet sammensetning, som gir grunnlag for å undersøke støkiometri, montering, og samhandling dynamikk av protein komplekser i noen biologisk system.

Introduction

BN-side separasjon ble først direkte koplet til LC-MS analyse (BN-MS) av Majeran¹ og Wessels² forskningsgrupper bruker manuell KUTTING av BN-side gel Lanes. Deres analyser identifiserte en rekke rikelig membran protein komplekser med kjent delenhet sammensetning fra plante plastids og HEK celle mitokondrier, henholdsvis. Men disse analysene var langt fra omfattende og tillot ikke for objektiv identifisering av romanen forsamlinger. Utførelsen av masse spektrometre og etikett frie kvantifisering metoder har blitt betydelig forbedret siden den gang, noe som har gjort det mulig med omfattende BN-MS-analyser. Dette har skapt begrepet "complexome profilering". For eksempel, Heide og kollegaer analysert rotte hjerte mitokondrier identifisere og klynger 464 mitokondrie proteiner, og dermed bekrefter mange kjente forsamlinger. I tillegg fant de TMEM126B å være en roman og avgjørende delenhet av en bestemt forsamling kompleks³. Sammenlignbare resultater (med 437 mitokondrie protein profiler) ble innhentet i en parallell studie av HEK celle mitokondrier⁴.

Til tross for disse forbedringene, har flere saker forblitt som begrense det fulle potensialet i BN-MS for complexome profilering. En stor begrensning er den effektive størrelses oppløsningen av komplekser som bestemmes av to faktorer: (i) kvaliteten på BN-side separasjon, som avhenger av ensartethet av gel matrise pore gradient samt stabilitet/løselighet av prøven komplekser, og (II) trinn størrelse av gel prøvetaking, som er i beste 1 mm ved bruk av konvensjonell manuell kutting^5,6. Dårlig størrelse oppløsning ikke bare bommer subtile komplekse isoformene og heterogeniteter, men også negativt påvirker den dynamiske rekkevidden og tilliten til upartiske, de Novo delenhet oppdrag og kvantifisering.

Andre utfordringer inkluderer presisjonen av protein kvantifisering og dekningen av det faktiske dynamiske spekteret av protein forekomster i prøven ved masse spectrometric analyse. Derfor har anvendelse av BN-MS complexome profilering vært i stor grad begrenset til biologiske prøver med lavere kompleksitet, høye uttrykk for mål komplekser, og gunstige oppløseliggjøringen egenskaper (dvs. plastids, mitokondrier, og mikroorganismer)^6,7,8,9,10.

Vi har nylig innført cryomicrotome kutting-assistert BN-MS (csBN-MS), som kombinerer presis sub-millimeter prøvetaking av BN-side gel Lanes med omfattende MS analyse og forseggjort MS databehandling for fastsettelse av protein profiler med høy tilliten¹¹. Påføring på en mitokondrie membran forberedelse fra rotte hjerner viste tidligere unmet effektiv kompleks størrelses oppløsning og maksimal dekning av oksidativt respirasjons kjede kompleks (OXPHOS) under enheter (dvs. 90 av 90 MS-Accessible). Dette eksempelet også identifisert en rekke romanen protein forsamlinger.

Beskrevet her er optimalisert prosedyrer for preparativ skala BN-side separasjon av protein komplekser (ikke begrenset til en bestemt biologisk kilde), støping av store preparativ BN-PAGE gels, cryomicrotome kutting av brede gel Lanes, og MS data Behandling. Ytelse med høy oppløsning profilering er demonstrert for en protein kompleks forberedelse fra mus nyre endosome-beriket membraner. Til slutt diskuteres fordelene fra økende oppløsning og presisjon av masse spectrometric kvantifisering.

Protocol

1. preparativ BN-side

1. Tilberedning av gel
   1. Bruk et middels til stort format vertikalt gel elektroforese system (> 10 cm avstands skille avstand; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm spacer) med effektiv kjøling satt til 10 ° c.
   2. Cast lineær eller hyperbolske pore gradient gel (1.5-3,0 mm avstandsstykker) ved hjelp av en gripende to-kammer gradient blandebatteri drevet av en pumpe (se tabell over materialer og reagenser). I presentert eksempel (lineær gradient gel 1%-13%):
      1. Forbered en 13 mL løsning for fremre (blandings) kammer bestående av: 13% akrylamid (fra 30% lagerløsning, 37.5:1,0 akrylamid: bisacrylamide), 0,75 M aminokapronsyre syre, 50 mM BIS-Tris (pH = 7,0), og 10% glyserol.
      2. Forbered en 10 mL løsning for reservoar kammeret bestående av: 1% akrylamid (fra 30% lagerløsning, 37.5:1,0 akrylamid: bisacrylamide), 0,75 M aminokapronsyre syre, 50 mM BIS-Tris (pH = 7,0) og 0,2% CL-47 vaskemiddel.
   3. Start stirrer og tilsett 30 mikroliter av APS (ammonium peroxodisulfate, 10% lagerløsning) og 2,5 μL av TEMED (N, N, N ', N'-tetramethyl etylendiamin) og 2,5 mikroliter av TEMED til løsningen i fronten kammer. Start pumpen og åpne front ventilen (Flow bør justeres for å fullføre støping i 10 min). Etter 1 min tilsett 90 μL av APS og 5 μL av TEMED til løsningen i reservoar kammeret og åpne kammer forbindelsen.
   4. La gelen polymeres langsomt, men grundig i minst 24 timer ved romtemperatur (RT) for å generere en homogen pore størrelse gradient. Når den holdes fuktig, kan den polymerisert gelen oppbevares oppreist ved 4 ° c i opptil 1 uke.
      Merk: forsettlig, vil toppen av gelen har en myk/slimete konsistens. Dette vil senere bli fjernet, men gir mulighet for jevn oppføring av proteiner i gelen, med minimal risiko for protein nedbør som ellers kan føre til migrasjon gjenstander (dvs. striper eller protein nedbør).
2. Prøveklargjøring og lasting
   1. Forbered lasting spor ved å sette inn passende avstandsstykker (f. eks, silisium rør) mellom glass platene for å skille 0,5-2,0 mg protein. Sporene bør gjøres minst 3 cm brede (eller bedre, 5-6 cm bred).
   2. Solubilize ~ 2,5 mg membran (mus nyre endosome-beriket forberedelse) i 2 mL oppløseliggjøringen buffer inneholdende 1% (w/v) ikke-denaturering vaskemiddel (ComplexioLyte CL-47) i 30 minutter på isen. Ultracentrifugate (sedimentering cut-off = 200 S eller mindre; 130 000 x g/11 min brukes her).
   3. Konsentrer solubilisate på en kort 50%/20% (w/v, 0,3 ml hver) sukrose trinn gradient ved ultracentrifugation for 1 time ved 400 000 x g. Den endelige protein utbyttet bør være minst 1 mg.
   4. Legg 0,05% (w/v) Coomassie G-250 til solubilisate og Last prøven på gelen. Begrens protein belastningen til et tverrsnitt på 10-15 μg/mm² gel kjørefelt for å oppnå høy oppløsning og unngå artefakter som skyldes protein nedbør.
3. BN-PAGE kjørende forhold
   1. For å kjøre buffere, klargjør du en standard bilde buffer som består av 50 mM tricine, 15 mM BIS-Tris og 0,01% Coomassie G-250. Forbered en standard anode buffer bestående av 50 mM BIS-Tris (pH = 7,0).
   2. Kjør en preparativ BN-side ved 10 ° c over natten ved hjelp av en tre-trinns spennings protokoll¹³ bestående av: en likevekts fase i 30 min ved 100 V, deretter en langsom (3 h) rampe til maksimal spenning (40-50 V/cm gel lengde) som er endelig opprettholdt i minst 6 timer for endepunkt med fokus på proteiner.
      Merk: det anbefales å pause elektroforese når migrasjon fronten har nådd midten av gel og utveksle bilderør buffer for frisk buffer uten Coomassie G250. Dette bidrar til å unngå nedbør gjenstander i gelen som følge av lokale sammenbruddet av matrisen pore struktur.

2. gel prøvetaking og fordøyelse

1. Fjerning av gel kjørefelt
   1. Etter kjøringen kan du skanne gels for dokumentasjonsformål mens du holder den mellom glass platene.
   2. Demonter platene og avgiftsdirektoratet i kjørefelt seksjonen (e) av interesse.
   3. Ta en prøve stripe av kjørefelt for analyse av 2D BN/SDS-side og protein farging eller vestlig blotting (som vist i figur 1B) for å bestemme regioner av interesse, effektiv kompleks størrelse oppløsning, og protein overflod.
   4. Fix valgte gel baner to ganger i minst 30 min med 30% (v/v) etanol og 15% (v/v) eddiksyre.
   5. Overfør prøven til embedding medium og la den suge og likevekt i minst 2 t ved 4 ° c, mens du holder gel skive i sakte film på en orbital shaker.
      Merk: gel separasjon bør nøye inspisert for generelle separasjon kvalitet og migrasjon gjenstander. Gel band som representerer dominerende proteiner bør være uten forvrengning og homogen i intensitet. Lokale gjenstander på gelen bør være excised eller utelatt av analysen.
2. Bygge inn og cryomicrotome kutting
   Merk: Dette er en forbedret versjon av embedding prosedyren beskrevet og foto-dokumentert tidligere som gjør det mulig for innebygging og kutting av bredere gel baner på opptil 8 cm¹¹.
   1. Først kuttet faste gel kjørefelt i seksjoner (her, 3 cm) nøyaktig parallell til protein migrasjon foran/bandet mønster. For enklere håndtering, plasser hver seksjon på en plastfilm støtte med like dimensjoner.
   2. Overfør kjørefelt til et åpent rør med propper (lukket på bunnen, sentralt perforert på toppen, både nøyaktig på linje med de øvre og nedre endene av gel-delen).
   3. Dypp sylinderen kort i flytende nitrogen for å raskt initiere herding. Den gjennomsiktige innebygging medium stivner i løpet av sekunder og blir hvit i fargen.
   4. Fyll hulrommet med innebygging medium, kort dyppe den i flytende nitrogen, og fryse sylinderen ved-20 ° c i flere timer.
      Merk: kjøling av sylinderen raskt ved å dyppe den i flytende nitrogen bidrar til å unngå forskyvning av gel skive i røret. Forvrengning bør unngås for å sikre høy oppløsning i følgende MS-analyse.
   5. Etter demontering, fjerne plastfilmen og overføre blokken med den innebygde gel delen til en avkjølt, større i diameter, metall sylinder plassert på en flat støtte (dvs., Petri parabol) og forseglet med embedding medium på utsiden av sylinderen. Fyll sylinderen med innebygging medium og fryse grundig.
   6. Gjenta denne prosedyren med den andre siden av sylinderen for å få en solid blokk med coplanar overflater.
   7. Fjern blokken fra sylinderen, lim den med innebygging medium på en forkjøles metall holder, og sett holderen inn i cryoslicing maskinen (cryotome). Overflaten av blokken må være nøye på linje med hensyn til kutting flyet. La den likevekt ved optimal temperatur for skjære prosessen (her,-15 ° c).
      Merk: Bruk en sakte framover manuell kutting syklus av 0,1 mm trinn størrelse til treffer overflaten av den innebygde gel delen for å sikre riktig posisjonering.
   8. Høste gel skiver etter hverandre, med en endelig ønsket tykkelse på 0,25 mm trinn størrelse, og overføre dem enkeltvis til reaksjons rør med lav protein bindende egenskaper.
      Merk: i dette oppsettet kan uniform gel skiver lett fås som tynne som 0,1 mm og så tykk som 0,5 mm.
3. Tryptic fordøyelse
   1. Utfør in-gel tryptic fordøyelse etter omfattende vask av gel skiver (minst tre ekstra runder med vasking anbefales å fjerne polymer komponenter av embedding medium) etter en standard prosedyre¹¹.
   2. Vakuum tørre eluert peptider og redissolve i 0,5% (v/v) trifluoroacetic syre ved risting ved 37 ° c (10 min) etterfulgt av bad sonikering (5 min) og kort sentrifugering.

3. masse massespektrometri

1. nanoHPLC og MS oppsett
   1. Last inn fordøyd prøver på en C18-precolumn (partikkelstørrelse = 5 μm; diameter = 300 μm) med 0,05% (v/v) trifluoroacetic yre ved hjelp av en (splitt fri) nano-HPLC koplet til en masse spektrometer med høy oppløsning.
   2. Eluere fanget peptider med en vandig-organisk gradient (eluent A): 5 min 3% B, 120 min fra 3% B til 30% B, 20 min fra 30% B til 99% B, 5 min 99% B, 5 min fra 99% B til 3% B, 15 min 3% B (flow rate = 300 nL/min).
      Merk: csBN-MS gel skiver vanligvis resultere i prøver med lav til middels peptid overflod og en begrenset grad av kompleksitet. nanoLC-MS/MS analyse bør derfor utføres med et oppsett som gir rimelig følsomhet og sekvensering hastighet, høy masse oppløsning (> 100000) og maksimal dynamisk område (effektivt 3-4 størrelsesordener). Men det krever ikke lange kolonnen dimensjoner eller eluering graderinger utvidet utover 3 t.
   3. Skill eluert peptider i en emitter (ID 75 μm; tip = 8 μm) manuelt pakket ca 20 cm med C18 materiale (partikkelstørrelse = 3 μm). Electrospray prøvene ved 2,3 kV (positiv ion-modus) inn i den oppvarmede overførings kapillær (250 ° c) av masse spektrometer.
   4. Utfør analyser med følgende instrument innstillinger¹¹: maksimal MS/MS injeksjons tid = 400 MS; utelukkelse varighet = 60 s; minimum signal terskel = 5 000 teller, topp 10 forløpere fragmentert; isolasjons bredde = 1,0 m/z).
      Merk: for å lette kalibrering av masse, oppbevaring tid, og tildeling av peptid signaler i et stort antall datasett eller målinger, anbefales det å utføre respektive MS måle serie uten avbrudd eller endringer i parametre og hardware ( det vil si, på samme C18 kolonne/emitter).
2. Protein identifikasjon (MS data evaluert som beskrevet tidligere¹¹)
   1. Pakk peak lister fra fragment ion Spectra bruke "msconvert. exe" verktøyet (del av ProteoWizard).
   2. Skift alle forløper m/z-verdier for hvert datasett ved median m/z-forskyvning av alle peptider som er tildelt proteiner i et foreløpig database søk med 50 ppm peptid masse toleranse.
   3. Søk i korrigert topp lister med en passende søkemotor (her, Mascot 2.6.2) mot alle muse oppføringer av UniProtKB/Swiss-beskytte databasen (Release 2018_11).
   4. Velg "acetyl (protein N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "Gln | Pyro-Glu (N-term Q), Glu | Pyro-Glu (N-term E) "," oksidasjon (M) ", og" Propionamide (C) "som variable modifikasjoner.
   5. Sett peptid og fragment masse toleranse til ± 5 ppm og ± 0,8 da, henholdsvis, og la en savnet tryptic kløft. Sett forventet verdi cut-off for peptid identifikasjon til 0,5 eller mindre. Bruk en lokkefugl database søk for å fastslå den falske positive oppdagelsen rate (FDR). Sett FDR til 1% eller bruke flere kvalitetskriterier for å sikre pålitelig identifisering.
      Merk: den presenterte eksperimentet identifiserte mer enn 3 500 proteiner, med en gjennomsnittlig peptid FDR på 4,4 ± 0,77% (n = 101 skive prøver), eller 3 000 proteiner når peptid FDR ble satt til 1%. Viktigere, strengere kriterier ble brukt for valg av profilerte proteiner (2 568). Den inkluderte alle proteiner som ble identifisert med minst to peptider, minst en av dem er protein-spesifikk, i minst ett av 101 skive prøvene.
3. Protein kvantifisering
   1. Bruk peptid signal intensitet (peak volumer [PVs]) for protein kvantifisering som er Hentet fra FT full skanner og korrekt for oppbevaring tid og masse Skift ved hjelp av riktig programvare (her, MaxQuant v 1.6.3).
   2. Juster MS-datasett én etter én til referanse (totalt gjennomsnitt) peptid-eluering ganger ved hjelp av LOESS-regresjon. Tildel PVs til peptider enten direkte (MS/MS-basert identifikasjon) eller indirekte (dvs. basert på deres matchende m/z og eluering tid innenfor svært smale toleranser).
      Merk: denne protokollen bruker in-House programvare for tildeling av "inn" betegnes peptider. Angi parametere resultere i effektiv m/z og eluering tid matchende toleranser på ± 2 ppm og ± 1 min, henholdsvis (se figur 2A, B).
   3. Riktig for systematisk kjøre-å-kjøre variasjoner i peptid belastning og ionisering effektivitet av peptid intensitet rescaling beregnet fra median forskjellene av relativ peptid intensitet mellom nærliggende skive prøver (figur 2C).
   4. Filtrer PV-data for outliers og gjenstående falske positive tildelinger identifisert av intern PV konsekvensanalyse.
   5. Normalisere PVs av hver peptid til deres maksimale verdier over alle Slice datasett gir relative peptid overflod profiler.
   6. Til slutt, beregne relative protein overflod profiler som gjennomsnitt av minst to (og opp til seks eller 50%, uansett hvilken verdi er større) av de beste samkjøre peptid profiler over et vindu på tre sammenhengende skiver. Dette gjør det mulig å bygge bro over manglende PV verdier og redusere støy.
      Merk: Dette resulterte til slutt i 2 545 (av 2 568 forhåndsvalgt) protein profiler (figur 2D).
4. Karakterisering av protein komplekser
   1. Analysere protein profiler ved først å utføre topp deteksjon ved hjelp av lokale Maxima metoden, og etterfølger passer normal distribusjoner til disse toppene, gir stillingen (dvs. Slice index eller tilsynelatende kompleks størrelse) av deres Maxima og FWHM (full bredde på verdier med halv maksimal intensitet) (innfelt bilde 4).
      Merk: i datasettet analyseres profilene automatisk ved hjelp av egendefinerte skript. De minste FWHM-verdiene er en indikasjon på den effektive størrelses oppløsningen for tilnærmingen (her, 6 x 0,25 = 1,5 mm).
   2. Bruk referanse protein komplekse topper med definert molekylær masse (som rapportert i UniProtKB/Swiss-beskytte database) for lineær regresjonsanalyse av log10 (spådd molekylær masse) verdier å konvertere skive nummer indekser til tilsynelatende molekylære størrelser (dvs. tilsynelatende kompleks størrelse i kDa).
      Merk: 23 markør komplekser i prøven ble valgt i denne studien (Figur 4) basert på (i) monodisperse former av profil topper, (II) eksperimentell støtte av molekylære vekter, og (III) distribusjoner langs de undersøkte BN-side gel seksjoner.

Representative Results

De aller fleste konvensjonelle BN-MS studier samt den nylig etablerte høyoppløselig csBN-MS tilnærming har blitt brukt til mitokondrie og plastid preparater som er (i) lett tilgjengelig, (II) har begrenset kompleksitet, og (III) uttrykke mål (membran) protein komplekser ved høy tetthet. Denne protokollen utvider anvendelsen av høyoppløselig complexome profilering til ikke-mitokondrie membraner uttrykker lav-rike proteiner, om hvilke lite informasjon om deres integrering i komplekser er tilgjengelig. For demonstrasjon formål, valgte vi en endosome-beriket membran forberedelse fra mus nyre oppnås ved tetthet gradient sentrifugering.

Optimalisering av dette preparatet har blitt styrt av markøren protein TPC1 som danner intracellulære ion kanaler overveiende lokalisert til tidlig og resirkulering endosomes¹². Det er også svært uttrykt i renal proksimale rørformede celler, som vist ved immunhistokjemiske analyse av nyre vev seksjoner (figur 1A). Disse membraner ble forsiktig solubilized (ComplexioLyte 47 på et lavt protein: vaskemiddel ratio på 1:8) og konsentrert på en sukrose pute ved ultracentrifugation. Sistnevnte viste seg å være et viktig skritt for å fjerne overflødig lavere molekylvekt komponenter (dvs. vaskemidler, lipider, salter, organiske polymerer og metabolitter) som har en tendens til å negativt påvirke oppløsningen av preparativ BN-side separasjoner.

Kompleks separasjon på en innfødt 1%-13% (w/v) polyakrylamid gradient gel (figur 1B, midtre panel) viste sterkt farget protein band med svært lite migrasjon gjenstander. SDS-side separasjon av en smal BN-side gel stripe (figur 1B, Frame eske i rødt) som en ny dimensjon etterfulgt av Western Blot analyse viste et godt løst mønster av distinkte TPC1-assosiert komplekse populasjoner (figur 1B , øvre panel, markert med røde piler), mest sannsynlig skyldes tilknytning til ytterligere protein under enheter og/eller posttranslational modifikasjoner (for eksempel glykosylering¹²). En 3 cm del av interesse var excised, fast, og behandlet for cryomicrotome kutting som beskrevet¹¹. De enkelte trinnene i denne prosedyren (spesielt den presise justeringen av den brede gel delen), som er av avgjørende betydning for å bevare oppløsningen under prøvetaking, er dokumentert i den med følgende videoen. Den innebygde gel delen ble til slutt skåret inn 101 gel skiver med en jevn tykkelse på 0,25 mm (figur 1B, nedre panel), som ble separat fordøyd og ANALYSERES av høy ytelse LC-kombinert masse massespektrometri.

I tillegg til størrelses oppløsning, er kvaliteten på protein kvantifisering nøkkelen for vellykket complexome profilering. Med MS oppsett og innstillinger som brukes, analyse av prøvene var ganske omfattende, noe som resulterer i en gjennomsnittlig identifisering av mer enn 1 000 proteiner og 10 000 peptider (8 200 som var protein-spesifikke) per skive, og rundt 3 000 proteiner og 43 000 peptider (38 500 av disse var protein-spesifikke) totalt. Likevel, på grunn av Stokastisk natur data-avhengige MS/MS sekvensering og dens begrensninger i dynamisk område, intensitet informasjon var fortsatt fragmentert for mindre rikelig proteiner. Derfor en utførlig MS databehandling prosedyre¹¹ble utført som er basert på presis tildeling av peptid signaler (peak volumer [PVS] = peptid-relatert signal intensitet integrert over m/z og tid) over hele serien av datasett.

Som vist i figur 2A, B, avvik av peptid signaler i masse og oppbevaring tid som forble etter kalibrering var identiske for MS-sekvensielt og for indirekte tildelt PVS (med svært smale toleranser av < 1 ppm og < 0,5 min for 95% av PV-er), som indikerer en svært lav sats for falsk-positiv nåverdi-tildeling. Resterende outliers ble filtrert basert på deres konsistens med andre relaterte PVs. Siden alle MS målingene ble utført fortløpende på samme LC-MS oppsett uten endringer i parametre eller maskinvarekomponenter, løpe-til-Run variasjoner (bestemmes som medianen av alle PV intensitet i et utvalg i forhold til de i nabokommunene skiver) var små og lett eliminert ved rescaling av PV datasett (figur 2C). Den resulterende peptid intensitet informasjonen ble deretter brukt til å rekonstruere 2 545 protein relative overflod profiler. Som vist i figur 2D, var mer enn 75% av disse protein profilene basert på minst tre uavhengige protein spesifikke peptider.

Neste, protokollen vurdert relevans av trinn størrelsen på BN-side gel prøvetaking for oppløsning av protein komplekser. For dette formålet, Slice datasett ble fulgt ved å summere PV-informasjon fra to, tre eller fire sammenhengende skiver, og dermed simulere utfallet for trinn størrelser på 0,5 mm, 0,75 mm, og 1 mm (sammenlignet med den opprinnelige prøvetaking av 0,25 mm). Figur 3 illustrerer de resulterende overflod profilene for protein TPC1 som et eksempel (A-D). Ved 0,25 mm, relative intensitet og størrelse separasjon av TPC1-assosiert komplekse populasjoner (Figur 3A) var pent i samråd med resultatene fra Western Blot analyse (figur 1B, øvre panel); Selv om profilen viste noe støy, hovedsakelig som følge av manglende verdier ("hull") i PV matrise brukes til kvantifisering.

Sammenføyning av to skiver tilsvarende 0,5 mm opprettholdt riktig intensitet og separasjon av TPC1-assosiert komplekser og fjernet kvantifisering støy (Figur 3B). I kontrast, større trinn størrelser på 0,75 mm og 1 mm (Figur 3C, D) førte til tap av størrelse oppløsning og avskaffet diskriminering av TPC1 komplekse subpopulasjoner. Det bør bemerkes at det store flertallet av publiserte konvensjonelle BN-MS analyser bruke manuelt Cut 2 mm skiver (rundt 60 for å dekke hele gel Lane)^7,8,9,10.

Konvertering av migrasjon avstand eller Slice index til molekylær størrelse er generelt basert på markører, enten kommersielt tilgjengelige innfødte standard proteiner eller godt preget endogene protein komplekser med kjente delenhet sammensetning (for det meste [super] komplekser av mitokondrie oksidativt åndedretts kjeden [OXPHOS])¹³. Men siden BN-side separasjon er basert på den effektive molekylære tverrsnitt som bestemmes ikke bare av molekyl massen, men også av 3D-strukturen og antall tilknyttede lipider, vaskemiddel, og Coomassie molekyler, kan enkelte proteiner viser større avvik. Derfor ble det valgt å bruke større sett med protein komplekser som markører¹¹. Plottet i Figur 4 viser 23 valgte markører med en representativ delenhet vist som en svart sirkel, indikerer log10 verdier av sin spådd molekylær masse (i henhold til UniProtKB/Swiss-beskytte databasen) vs. Slice-indeksen til den tilsvarende høyeste profil maksimal. Sistnevnte ble innhentet fra automatisert Gaussian passer til den relative overflod data, som vist i innfelt i Figur 4 viser eksempel med Anstandsdame BCS1. Lineær regresjon (rød linje) ga en funksjon for å konvertere Slice index verdier til tilsynelatende molekylære størrelser, som varierte fra 160-630 kDa, langs undersøkt gel delen.

Endelig analysen gitt informasjon om godt preget komplekser og demonstrerte eksistensen av romanen under enheter og komplekse forsamlinger. Eksempler på ulike aspekter ved complexome er vist i figur 5 (A-C: proteiner uttrykt eller fortrinnsvis plassert i endosomal rom; D-F: komplekser fra andre subcellulære lokaliseringer). Det jern-transport protein ferritin er kjent for å danne komplekser fra 24 lys (FRIL1) og/eller tunge (FRIH) under enheter, med en total molekylvekt på 440 kDa¹⁴ (figur 5a, fylt pil). Delenhet profilene (figur 5A) foreslå eksistensen av minst to mindre former av komplekset (med en tilsynelatende masse på 360 KDA og 340 KDA; åpne piler) med forskjellige tunge/lys kjede stoichiometries (bedre synlig etter rescaling av forekomster, innfelt figur 5A) det er rikelig til stede i endosomes.

I kontrast, nicalin-nomo1 komplekser¹⁵ (figur 5D), gamma-secretase Core Complex¹⁶ (figur 5B), og GPI-transamidase maskiner¹⁷ (figur 5E) Vis fast overflod prosenter av deres kjerne under enheter over hele størrelsesområdet og uavhengig fra tilknytning til flere proteiner. Dette indikerer at deres under enheter er eksklusivt for hverandre. Vacuolar H⁺-ATPases er multiprotein komplekser samlet fra en pool av mer enn 20 under enheter på en modulær måte med en total molekylvekt på rundt 900 KDA. Figur 5C avslører sub-komplekser med distinkte komposisjoner fra minst 17 under enheter, enten representerer biologisk (DIS) montering mellom produkter eller subcomplexes generert av eksperimentelle forhold, hvorav noen har også vært observert i en nylig BN-MS studie¹⁸. Et annet multi-protein kompleks eksempel er proteasomet¹⁹ (figur 5F). Nær inspeksjon av overflod profiler av Alpha og beta under enheter danner 20 proteasomet kjernen antyder to store komplekse populasjoner med subtile forskjeller i størrelse (590 kDa og 575 kDa, indikert med grå piler) og integrering av tre beta under enheter.

I sammendraget, csBN-MS complexome profilering av endosome-beriket nyre membraner gir omfattende og detaljerte resultater om (i) integrering av uniform, lavt rike mål proteiner i komplekser, (II) generell kompleks delenhet sammensetning og støkiometri, og (III) komplekse heterogeniteter, underlag og (DIS) montering mellom produkter.

Figur 1: PREPARATIV BN-Page separasjon av solubilized endosome-beriket membraner fra mus nyre bruker intracellulære kanal TPC1 som en markør. (A) immunhistokjemiske lokalisering av TPC1 protein i nyre proksimale tubuli av konfokalmikroskopi mikroskopi. Grønn: anti-TPC1 antistoff¹² farging visualisere med sekundær Cy3-biotinylated geit anti-kanin IgG; rød: biotinylated Lotus tetragonolobus Lektiner (LTL, 10 μg/mL, FITC-bøyd) markerer luminal overflaten av proksimale tubulus celler. Innfelt viser farging av en tilsvarende seksjon fra en TPC1-KO nyre som en negativ kontroll. Hvit skala barer er 20 μm. Også av notatet er sterk TPC1 uttrykk i intracellulære blemmer, kjent fra uavhengige eksperimenter for å representere tidlig og resirkulering endosomes¹². (B) preparativ BN-Page separasjon av 2,5 mg solubilized endosome-beriket membraner på en 1%-13% (w/v) polyakrylamid gradient gel. En smal kjørefelt (innrammet i rødt) ble kuttet for senere SDS-side/Western Blot analyse (øvre panel), løse ulike TPC1-tilknyttede komplekser og glykosylering mønstre (røde piler: anti-TPC1/anti-Rabbit HRP/ECL Prime; grønn: posisjoner og spådd massene [MDa] av markør protein komplekser identifisert av total protein farging [SYPRO Ruby blot stain]) av blot. Fra høyre til venstre: na⁺/K⁺-transport av ATPase, cytokrom b-C1 kompleks dimer, ATP syntase, NADH: ubiquinone oxidoreductase. En 3 cm del av interesse fra gel kjørefelt var excised, innebygd i vev embedding medium, montert, og skiver i 101 seksjoner (0,25 mm) langs protein migrasjon foran ved hjelp av en cryomicrotome (nedre panel; se video link). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: nøkkelparametre som bestemmer nøyaktigheten til MS-kvantifisering samt dybdeanalyse. (A) fordeling av relative masse feil (i ppm) etter m/z kalibrering av MS/MS sekvensert (røde linjer) og indirekte tildelt (dvs. basert på tett samsvarende masse og oppbevaring ganger, se protokoll; blå søyler) peptid signaler. Dette tyder på en endelig masse feil på < 1 ppm (for 95% av signalene/tildelt PVs) og svært lav sats på falske positive oppgaver. (B) distribusjon av nano-HPLC bevarings tid avvik fra total gjennomsnitt etter eluering tid justering av peptid-signaler, ved hjelp av Loess regresjon (se protokoll) og fargekoding som brukes i (A). Tid feil er mindre enn 30 s for > 95% av peptid signaler/tildelt PVs. (C) Run-to-Run variasjon av totalt MS-intensitet plottet i forhold til gjennomsnittet av de to nabokommunene prøvene. Disse Skaleringsfaktorer ble brukt på rå PV tabeller for å minimere systematiske tekniske feil. (D) peptid informasjon som brukes for beregning av relative overflod profiler av proteiner. Etter filtrering av protein-spesifikke peptider for outliers, dårlig scoret, eller enkelt identifikasjon (se protokoll), 2 545 protein overflod profiler ble fastslått, > 75% av disse var basert på minst tre peptider med rimelig tillit. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: kritisk effekt av trinn størrelse i gel prøvetaking på complexome oppløsning på TPC1. Datasett ble koblet sammen ved å summere signal intensiteten i grupper på 1, 2, 3 og 4 sammenhengende skiver (A-D, henholdsvis) og behandlet likt for å simulere forskjellige trinn størrelser i gel-kutting som angitt. Den TPC1 profilen viser noen (oversampling) støy på 0,25 mm, men god størrelse oppløsning på tre komplekse populasjoner (se også figur 1B), som er i stor grad bevart på en 0,5 mm trinn bredde. Diskriminering av disse bestandene blir tapt som 1 mm er nærmet seg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: bestemmelse av tilsynelatende molekylvekt. 23 markør komplekser med definert molekyl sammensetning (som indikert, i henhold til UniProtKB/Swiss-beskytte) ble brukt som størrelse markører. Logaritmisk verdier av deres forventede molekylære vekter (i kDa) ble plottet vs. profilen topp maksimal skive indeks av indikerte representative protein delenhet (fylt sirkler i svart). Lineær regresjon som passer til disse dataene (rød linje) gitt en funksjon konvertere Slice index verdier til tilsynelatende molekylære vekter. Peak Maxima ble bestemt av automatisert Gaussian passer til protein profil topper som vist i innfelt (høyre) for Anstandsdame protein BCS1 (primære data i blått, passer grenser indikert med oransje linjer, Fit funksjon i rødt). I tillegg, disse passer bestemt topp halv-maksimal bredder (grønn linje, 6,5 skiver, eller 1,6 mm for eksempelet vist) med de skarpeste fokuserings komplekser spenner rundt en 1,5 mm gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: eksempler på protein kompleks delenhet profiler. Relativ protein overflod vs. synlig molekylvekt plottet for tunge og lett kjede av ferritin (A) avslørende molekylær heterogenitet av ferritin delenhet støkiometri, mer tydelig synlig etter rescaling av forekomster (innfelt). Fylt pil og åpne piler betegne hele komplekset (440 kDa) og to subcomplexes, henholdsvis. Gamma-secretase (B) under enheter kvantitativt integrert i en enkelt kjerne kompleks populasjon. Subcomplexes av vacuolar H⁺-ATPases (C) utstilt flere forsamlinger med distinkte delenhet sammensetning, alle uttrykt i endosomes. Den nomo1 og nicalin proteiner (D) dannet et eksklusivt kompleks (den GPI-transamidase), som er en multi-delenhet enzymatisk maskiner som danner flere komplekser. (E) 20 proteasomet kjerne kompleks som viser (F) en subtil subcomplex mønster med to populasjoner indikert av piler i grått, alle stammer fra andre subcellulære lokaliseringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Det forevist studere bygget på csBN-MULTIPLE SCLEROSIS teknikk tidligere benchmarked med en mitokondrie forberedelse¹¹ og innlemmet forbedringer inne eksemplar forberedelse, gel bearbeiding, og MULTIPLE SCLEROSIS data bedømmelse. Fokusert analyse av en del av stor skala separasjon BN-side gel gitt et omfattende sett av data som viser kvalitetstiltak sammenlignbare med studien med mitokondrie membraner. Masse og oppbevaring tid feil samt kjøre-til-Run variasjoner ble holdt svært lav og gitt grunnlag for å bestemme pålitelig protein overflod profiler. Størrelses oppløsning så ut til å være god, med halv-maksimal topp bredde så lavt som seks skiver (tilsvarende 1,5 mm, Figur 4) og relative størrelse forskjeller på mindre enn 10% løst (Figur 3, figur 5A). Disse verdiene ikke fullt ut oppfyller størrelsen oppløsning kvaliteten på den forrige csBN-MS analyse av mitokondrier (til tross for mindre gel prøvetaking trinn størrelse valgt), men de er betydelig bedre enn ytelsen til konvensjonelle BN-MS eller størrelse-utelukkelse MS tilnærminger²⁰ som nylig har blitt populært.

Betydningen av en høy effektiv kompleks størrelse oppløsning er understreket av simuleringen eksperimentet i Figur 3 (ved hjelp av TPC1-assosiert komplekser) som kan neppe løses ved 2D BN/SDS-side Western Blot analyse (figur 1B). Disse resultatene tyder på at 0,25 mm kutting i dette tilfellet resulterte i noen oversampling, men det dette fortsatt viste seg å være nyttig for eliminering av "kvantifisering støy" uten å svekke effektiv størrelse oppløsning. Dermed, i tråd med tidligere resultater¹¹, er en samplings trinn størrelse på ~ 0,3 mm generelt anbefales.

Spesielt er diskriminering av TPC1-tilknyttede komplekser helt tapt med 1 mm gel prøvetaking, som er den minste trinn størrelse levert av manuell kutting i konvensjonell BN-MS^5,6. Denne kanskje forklare det fakta at til tross for kraftfull MULTIPLE SCLEROSIS teknologiene tilværelse anvendelig, svært få protein komplekser og under enheter ha blitt kjennemerke de Novo av complexome profilering. For resten dens fint løser makt, csBN-MULTIPLE SCLEROSIS tilbyder høy allsidighet. Membran bundne komplekser og løselige protein komplekser som spenner fra 50 kDa til flere MDa kan effektivt løses i et enkelt eksperiment med minimum bias¹¹. Dette kontraster med alternative separasjon teknikker som brukes for complexome profilering som størrelses ekskludering eller ion Exchange kromatografi, som opererer med delsett av løselige proteiner med visse størrelses områder eller lade egenskaper. På nedsiden, csBN-MS er mindre skalerbar (maksimal belastning på ~ 3 mg protein per gel), kan være teknisk utfordrende, og kan ikke automatisert.

Resultatene viser at csBN-MS-baserte complexome profilering kan med hell brukes på ikke-mitokondrie mål, men også indikere noen tilknyttede utfordringer. Dermed effektiv ekstraksjon og biokjemiske stabilitet av protein komplekser krever mer optimalisering, og rengjøring trinn og kan fortsatt være begrenset. Innenfor den undersøkte størrelsen vinduet, antall godt fokuserte, monodisperse protein komplekser var faktisk betydelig lavere (data ikke vist) sammenlignet med en mitokondrie prøve. Det anbefales også å senke BN-side sample laster å få akseptabel gel separasjon. Høyere belastninger kan kreve bredere gel baner som er vanskeligere å behandle riktig for kutting (se med følgende video). Videre var protein kompleksiteten i prøvene høyere (rundt to ganger) enn den mitokondrier skive fordøyer, noe som førte til mer manglende PV verdier og en redusert dynamisk område. Faktisk forventes noen små proteiner å være en del av komplekser vist i figur 5 manglet i analysene. Disse problemene kan løses i fremtiden ved hjelp av raskere og mer følsomme MS instrumenter eller data-uavhengige oppkjøpet moduser.

Prøveklargjøring er svært kritisk for protein kompleks gjenfinning, stabilitet, og gel separasjon kvalitet. Parametre og prosedyrer skal optimaliseres for hvert kilde vev, celle lysat, membran (brøk), og protein kompleks av interesse. Følgende generelle anbefalinger er gitt som kan bidra til å utvide anvendelser av csBN-MS:

(i) forberede prøver friskt og unngå oppvarming/frysing, sterk fortynninger, endringer i buffer forhold, og unødvendige forsinkelser;

(II) bruke buffere som er essensielt blottet for salter (Erstatt med 500-750 mM Betaine eller aminokapronsyre syre), om en nøytral pH, og som inneholder opptil 1% (w/v) av ikke-denaturering vaskemiddel (protein: vaskemiddel ratio mellom 1:4-1:10 for oppløseliggjøringen av membran protein komplekser, ingen vaskemiddel kreves for løselig protein komplekser);

(III) nøye testing og justering av rengjøringsmidler ved analytisk BN-side, siden disse kan sterkt påvirke effektiviteten av komplekse oppløseliggjøringen, representasjon av membran protein komplekser i prøven, stabiliteten, og homogenitet av protein-vaskemiddel miceller. Sistnevnte er forutsetninger for proteiner å fokusere som distinkte band/komplekse populasjoner på BN-side gels. Tidligere litteratur tilbyr et bredt spekter av nøytrale vaskemidler. Men DDM (n-natriumdodecylsulfat β-d-maltoside)^1,2,4,5,6 og digitonin^{3,5,7,8, 9,10,13,18} har vært de mest populære valgene for BN-MS analyser så langt. Det må understrekes at enhver vaskemiddel tilstand nødvendigvis utgjør et kompromiss mellom oppløseliggjøringen effektivitet og bevaring av protein interaksjoner og er kanskje ikke like egnet for alle typer mål protein og kildemateriale;

(IV) fjerning av ladet polymerer som fibrils, filamenter, polylysine, DNA, og rikelig med lavere molekylvekt komponenter (dvs. metabolitter, lipider, eller peptider). Dette kan oppnås ved ultracentrifugation, gel filtrering, eller dialyse. Dette er spesielt viktig for total celle eller vev lysater;

(v) legge til Coomassie G-250 (endelig konsentrasjon 0,05%-0,1%) og sukrose (for å øke tettheten for lasting, endelig konsentrasjon 10%-20% [w/v]) til prøven like før lasting, for å klare av korte ultracentrifugation, laste prøven uten forstyrrelsene, og starte kjøre umiddelbart etterpå.

Som et fremtidig perspektiv, csBN-MS-baserte complexome profilering tilbyr alternativer for multipleksing å studere protein kompleks dynamikk eller endringer knyttet til spesifikke biologiske forhold. Kombinert separasjon av metabolically merkede prøver som foreslått for størrelsesbasert profilering²¹ vises grei, men det kan være hemmet av spontan delenhet utveksling i komplekser forekommer uavhengig av brukt separasjon Metoden. Alternativt kan merket prøvene løses i nærliggende gel baner, som deretter kan co-skiver eller kombinert post-fordøye for differensial analyse med høy følsomhet og robusthet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio Rad	#1610158	Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio Rad	#1610154	Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain	Bio Rad	#1703127	Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium	Leica Biosystems	14020108926	Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm	Merck	IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE Healthcare	RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml	n.a.	n.a.	any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade	n.a.	n.a.	any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long	n.a.	n.a.	mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	Nr. 0030108116	highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm	Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm)	New Objective	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody	Gramsch Laboratories	custom production	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	CY-1300	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated	Vector Laboratories	#B1325	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit	Bio Rad	n.a.	for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System	PeqLab	n.a.	for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera	Zeiss / Photometrics	n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel)	Ismatec	ISM940	for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers)	selfmade, alternatively Bio Rad	1652000 or 1652001	for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ