Summary
En detaljert metode er gitt her beskriver rensing, refolding, og karakterisering av selv-montering protein nanopartikler (SAPNs) for bruk i vaksine utvikling.
Abstract
Selv montering av protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som repeterende antigen-skjermer og kan brukes til å utvikle et bredt spekter av vaksiner for ulike infeksjonssykdommer. I denne artikkelen viser vi en metode for å produsere en SAPN kjerne inneholder en seks-Helix Bundle (SHB) forsamling som er i stand til å presentere antigener i en trimeric konformasjon. Vi beskriver uttrykket av SHB-SAPN i et E. coli -system, i tillegg til de nødvendige trinnene for protein rensing. Vi inkluderte en isopropanol vasketrinn for å redusere den gjenværende bakterielle lipopolysakkarid. Som en indikasjon på protein identitet og renhet, reagerte proteinet med kjente monoklonale antistoffer i Western Blot-analyser. Etter refolding falt størrelsen på partiklene i det forventede området (20 til 100 NM), som ble bekreftet av dynamisk lysspredning, nanopartikkel sporings analyse og overføring av elektron mikroskopi. Metodikken som beskrives her, er optimalisert for SHB-SAPN, men med bare små endringer kan den brukes på andre SAPN-konstruksjoner. Denne metoden er også lett overførbar til Storskalaproduksjon for GMP produksjon for menneskelige vaksiner.
Introduction
Mens tradisjonell vaksine utvikling har fokusert på inaktive eller svekkede patogener, har fokus for moderne vaksiner forskjøvet mot delenhet vaksiner1. Denne tilnærmingen kan føre til en mer målrettet respons, og potensielt mer effektiv vaksine kandidater. Men en av de viktigste ulempene er at delenhet vaksiner er ikke partikler som hele organismer som kan resultere i redusert immunogenisitet2. En nanopartikkel som et repeterende antigen display system kan ha fordelene av både målrettede delenhet vaksine tilnærming samt partikler natur hele organismen1,3.
Blant de eksisterende typer Nanovaccines, rasjonelt utformet protein forsamlinger tillate design og utvikling av vaksine kandidater som kan presentere flere eksemplarer av antigen potensielt i en innfødt-lignende konformasjon1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein forsamlinger er selv-sammenstillingen protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er basert på spiral-coil domener og er tradisjonelt uttrykt i Escherichia coli8. SAPN vaksine kandidater har blitt utviklet for en rekke sykdommer som malaria, Sars, influensa, toxoplasmosis og HIV-19,10,11,12,13 , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19. utformingen av hver SAPN kandidat er spesifikk for patogen av interesse, men produksjonen, rensing, og refolding teknikker er generelt bredt aktuelt.
En av våre nåværende interesser er en effektiv HIV-1-vaksine. I RV144 — den eneste fase III kliniske studien av en HIV-1-vaksine som viste beskjeden effekt – den reduserte risikoen for infeksjon var korrelert med IgG antistoffer mot V1V2-løkken i konvolutt proteinet20,21. Den innfødte-lignende trimeric presentasjon av denne regionen antas å være viktig for beskyttende immunogenisitet22. Å presentere V1V2 sløyfe i så nær native-like konformasjon som mulig, vi utviklet et bevis på prinsippet SAPN vaksine kandidat som inneholdt HIV-1 konvolutt etter fusjon seks-Helix Bundle (SHB) å presentere V1V2 sløyfe i riktig konformasjon9 . Denne kandidaten ble anerkjent av kjente monoklonale antistoffer mot HIV-1 konvolutt protein. Mus vaksineres med V1V2-SHB-SAPN hevet V1V2 spesifikke antistoffer, som, viktigst, bundet til gp70 V1V2, riktig conformational epitopes9. Den SHB-SAPN kjernen kunne ha andre funksjoner utover rollen som en operatør for HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljert metodikk for uttrykk, rensing, refolding og validering av SHB-SAPN kjerne. Sekvensen utvalg, nanopartikkel design, den molekylære kloning, og transformasjon av E. coli har tidligere blitt beskrevet9.
Protocol
1. uttrykk for SHB-SAPN protein i E. coli BL21 (DE3)
- Bland 95 mL komponent A og 5 mL komponent B i mediet i en 2 L steril glass Erlenmeyer kolbe i henhold til produsentens anvisninger (se tabell over materialer). Legg Ampicillin til en endelig konsentrasjon på 100 μg/mL.
- Vaksinere mediene med E. coli fra en tidligere etablert glyserol aksje kultur. Ruge kultur ved 30 ° c med risting ved 200 rotasjoner per minutt (rpm) for 48 h.
Merk: den brukte E. coli BL21 (DE3) lager inneholdt Ampicillin motstandsdyktig uttrykket vektor23 med SHB-SAPN genet. Selv om den generelle protokollen av media anbefaler 24 h av inkubasjons ved 37 ° c, 48 h av inkubasjons ved 30 ° c ga høyere avkastning for SHB-SAPN. - Overfør kulturen til 2 50 mL koniske rør. Sentrifuger rørene ved 4 000 x g i 10 minutter med en fast vinkel rotor ved 4 ° c. Fjern supernatanten og lagre pellet å høste celler.
Merk: celle pellet kan enten behandles umiddelbart eller frosset ved-80 ° c til bruk.
2. lyse av E. coli BL21 (DE3) ved sonikering
Merk: Bruk pyrogenisk plasticware og glass bakt på 250 ° c i minst 30 min. Tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) som en reduksjons agent bryter disulfide obligasjoner i og mellom proteiner. TCEP er nødvendig i buffere under denne protokollen hvis det viste antigen inneholder S-S obligasjoner. For SHB-SAPN kjerne bare, er tilstedeværelsen av TCEP i buffere ikke avgjørende.
- Forbered imidazole-fri buffer (8 M urea, 50 mM natrium fosfat enbasisk, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP) pH 8,0 (justert med 5 N NaOH) og Filtrer den ved hjelp av en vakuum flaske filtrerings enhet på 0,22 μm.
- Resuspend de pelleted cellene (fra trinn 1,3) med 40 mL imidazole buffer i 1 50 mL konisk rør. Sonikere de resuspendert cellene med en sonde på isen i 5 min (4 s av sonikering, 6 s hvile) med en sonikering utgang på 150 W.
- Sentrifuger mobil lysat (40 mL) ved 29 000 x g ved 4 ° c i 25 min i en fast vinkel rotor for å generere avklart supernatanten. Overfør supernatanten til en 150 mL steril kolbe og kast pellet. Fortynne supernatanten til 100 mL ved hjelp av imidazole-fri buffer (senere i protokollen referert til som "sample").
Merk: Dette fortynnings trinnet er nødvendig for å hindre at FPLC system trykk blir for høyt under lysat lasting på søylen.
3. protein rensing ved hjelp av en hans-kolonne
Merk: denne protokollen ble utført ved hjelp av en FPLC instrument, men det kan tilpasses tyngdekraften flyt.
- Forbered følgende buffere og Filtrer dem ved hjelp av en 0,22 μm vakuum flaske filtrerings enhet: (i) imidazole buffer "buffer A" (8 M urea, 50 mM natrium fosfat enbasisk, 20 mM Tris sokkel, 5 mM TCEP) pH 8,0; (II) 500 mM imidazole buffer "buffer B" (8 M urea, 50 mM natrium fosfat enbasisk, 20 mM Tris sokkel, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole) pH 8,0; og (III) isopropanol vask (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8,0.
Merk: pH for hver buffer ble justert med 5 N NaOH. - Likevekt hans-kolonnen.
Merk: for Lab skala produksjon, denne protokollen bruker en 5 mL ferdigpakkede hans-kolonnen, men alle større størrelse kolonne kan brukes.- Åpne FPLC programvare og klikk på den nye metoden alternativet. Den vil umiddelbart åpne menyen for metode innstillinger . Velg C1 port 3under rullegardinmenyen for Kol onne plassering.
- På den viste etter teknikk rullegardinmenyen velger affinitet. I rullegardinmenyen for kolonnetypen velger du andre, Histrap HP, 5 ml. Kol onne volumet og trykk boksene blir automatisk satt til de riktige verdiene.
- Falle i staver på metoden omriss knapp. Dra følgende knapper fra hurtigmenyen for fase bibliotek : likevekts, eksempel program, Kol onne vaskog eluering ved siden av pilen i den nøyaktige rekkefølgen. Lukk menyen for fase bibliotek .
- Klikk på likevekts -knappen. Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" (4%), "endelig buffer B" (4%) og "volum (CV)" 5.
- Klikk på eksempel program boksen. Klikk på alternativknappen for å injisere prøve på kolonne med sample pumpei prøven lasting boksen. Kontroller at boksen ved siden av Bruk flow rate fra metode innstillingene er sjekket i prøven injeksjon med systemet pumpe boksen. Ved siden av volum boksen på høyre side av skjermen endrer du verdien til 20 ml.
- Klikk på knappen for Kol onne vask . Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" (4%), "endelig buffer B" (4%) og "volum (CV)" 5. Ved siden av samlings oppsettet for brøkdeler unclick enable-boksen.
- Klikk på eluering -knappen. Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" 0%, "endelig buffer B" 100% og "volum (CV)" 5. Klikk på Aktiver -boksen ved siden av samlings skjemaet for brøk. Unclick Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger og Juster brøk størrelse til 4 ml i Utfyllings boksen nedenfor.
- Klikk på Lagre som -knappen øverst på programvaren. Navngi filen "likevekts".
- Koble en 5 mL ferdigpakkede hans-kolonne til tilsvarende kolonne port 3 på FPLC. Både pumpen A og pumpen B slange samt prøven pumpen slangen skal plasseres i 0,22 μm filtrert deionisert vann. Kjør likevekts programmet.
- Plasser både pumpe A og pumpe B i tillegg til prøve pumpeslangen i den imidazole bufferen (buffer A), og Kjør likevekts-protokollen på nytt.
- Bind prøven til kolonnen og rens proteinet.
- Åpne FPLC programvare og klikk på den nye metoden alternativet. Den vil umiddelbart åpne menyen for metode innstillinger . Velg C1 port 3under rullegardinmenyen for Kol onne plassering . På den viste etter teknikk rullegardinmenyen velger affinitet. På rullegardinmenyen for kolonnetypen velger du andre, HISTRAP HP, 5 ml. Kol onne volumet og trykk boksene vil automatisk bli satt til de riktige verdiene.
- Falle i staver på metoden omriss knapp. Dra knappene fra hurtigmenyen for fase biblioteket : likevekts, eksempel program, spalte vask (vask 1), spalte vask (vask 2), spalte vask (vask 3) og eluering ved siden av pilen i det nøyaktig rekkefølge. Lukk menyen for fase bibliotek .
- Klikk på likevekts -knappen. Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" 4%, "endelig buffer B" 4% og "volum (CV)" 5.
- Klikk på eksempel program boksen. I prøven lasting boksen klikker du på alternativknappen for jegnject prøve på kolonne med sample pumpe. Kontroller at boksen ved siden av Bruk flow rate fra metode innstillingene er sjekket i prøven injeksjon med systemet pumpe boksen.
- Ved siden av volum boksen på høyre side av skjermen endrer du verdien til 100 mL. Klikk på Aktiver -knappen ved siden av samlings oppsettet for brøk. Unclick Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger boksen, og endre deretter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klikk på den første kolonnen vaske knappen (vask 1). Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" 4%, "endelig buffer B" 4% og "volum (CV)" 10. Klikk Aktiver -boksen ved siden av samlings oppsettet for brøk. Unclick Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger og endre deretter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klikk på den andre kolonnen vaske knappen (vask 2). Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" 0%, "endelig buffer B" 0% og "volum (CV)" 5. Klikk Aktiver -boksen ved siden av samlings oppsettet for brøk. Unclick Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger og endre deretter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klikk på vaske knappen i den tredje kolonnen (vask 3). Verdiene som er oppført i tabellen, bør være "innledende buffer B" 0%, "endelig buffer B" 0% og "volum (CV)" 5. Klikk på enable (Aktiver) ved siden av samlings oppsettet for brøk. Unclick Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger boksen, og endre deretter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klikk på eluering -knappen. I tabellen høyreklikker du informasjonen som er oppført, og på menyen som kommer opp, klikker du Slett trinn. Dra den isocratic graderings knappen til tabellen to ganger, slik at det er to oppføringer.
- Verdien for den første oppføringen bør lese "innledende buffer B" 30%, "endelig buffer B" 30% og "volum (CV)" 10. Verdien for den andre oppføringen bør lese "innledende buffer B" 100%, "endelig buffer B" 100% og "volum (CV)" 10. Klikk på Aktiver -knappen ved siden av samlings oppsettet for brøk. Klikk i boksen ved siden av Bruk brøk størrelse fra metode innstillinger.
- Klikk på Lagre som -knappen øverst på programvaren. Navngi filen "rensing". Pump en slange av FPLC skal plasseres i den imidazole vaskebuffer mens pumpen B slangen skal plasseres i 500 mM imidazole buffer. Prøve pumpeslangen skal plasseres i 100 mL prøven.
- Kjør "rensing" programmet og vente på den tiden da 60% isopropanol er nødvendig (vask 2). Pause programmet, flytte pumpe en slange fra imidazole vask i 60% isopropanol vask. Start programmet på nytt.
- Når isopropanol trinnet er fullført, stanser du programmet på nytt og flytter pumpen en slange tilbake i den imidazole vaske bufferen. Start rensing programmet (resten av kjøringen er automatisert).
4. renhet vurdering og protein identifisering av SDS-side
- Kombiner alle fraksjoner tilsvarende (i) Flow-through (cellen lysat som ikke binder seg til hans kolonne), (II) vask 1, (III) vask 3 (60% isopropanol vask), og (IV) vask 3 i separate 50 mL koniske rør. Ikke Kombiner 2 mL fraksjoner fra de eluering trinnene.
- Bland 15 μL fra hver av de grupperte fraksjoner og alle fraksjoner fra eluering trinn med 2x Laemmli prøve buffer i et 0,5 mL mikrosentrifugen rør og denaturere dem ved 95 ° c i 10 minutter.
- Mens proteinet denatures, sette opp gel kjører apparater med 3 flekk-fri 4-20% prefabrikerte polyakrylamid gels i 1x Tris-Glycine SDS-PAGE kjører buffer.
- Last 8 μL av molekylvekt markør til den første brønnen og 30 μL av denaturert prøve til de andre brønnene i gelen. Kjør gels på 200 V til fargestoff fronten treffer bunnen av gel (ca 30 min). Fjern gels fra apparatet og kort skyll med deionisert vann. Image gelen umiddelbart ved hjelp av flekk-Free Imaging system.
- Identifiser fraksjoner som inneholder protein bånd med riktig størrelse (18,07 kDa). Pool alle disse fraksjoner.
5. protein identifisering av Western Blot
- Kjør en vestlig blott ved hjelp av et His-spesifikt antistoff (anti-6 HisTag) og et SHB-spesifikt antistoff (167-D-IV) for å identifisere renset full lengde protein. Anti-6 x HisTag-antistoff gjenkjenner N-Terminus til proteinet, og 167-D-IV-antistoff gjenkjenner C-Terminus som demonstrerer tilstedeværelsen av protein i full lengde.
- Bestem protein konsentrasjonen av (i) gjennomstrømning, (II) vask 1, (III) vask 2 (60% isopropanol vask), (IV) vask 3 og alle fraksjoner fra de eluering trinnene med det spektrometer instrumentet på en absorbansen på 280 NM. Generer fortynninger som inneholder 100 av protein i 15 μL av imidazole-fri buffer for hver av disse gruppene.
- Tilsett 15 μL av 2x Laemmli prøve buffer til hver 15 μL av prøvene og denaturere dem som i trinn 4,1. Når denaturering er ferdig, spinner du ned rørene for å sikre at alt proteinet kan overføres.
- Last prøver og pre-farget markør inn i en flekk-fri 4-20% prefabrikerte polyakrylamid gel. Kjør elektroforese på 200 V til Dye fronten når bunnen av gelen.
- Mens gelen går, gjør 1 L av TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, og 0,1% mellom 20) og 200 mL 5% ikke-fett melk i TBS-T.
- Bruk et vestlig blot overføringssystem for å overføre protein til en nitrocellulose membran. Bruk en ferdig montert overførings stabel og plasser gelen på den. Sett opp systemet til å kjøre på 25 V i 7 min. Sjekk for tilstedeværelsen av den pre-farget markør på nitrocellulose membranen som indikerer en fullstendig overføring.
Merk: alle de påfølgende trinnene utføres på en orbital shaker satt til 100 RPM ved romtemperatur (RT). - Når overføringen er fullført, vask blots to ganger med TBS-T for 10 min hver.
- Blokker nitrocellulose membraner (blot) med 5% ikke-fett melk i TBS-T i minst 1 h. vask blots to ganger med TBS-T for 10 min hver.
- Fortynne den primære 167-D-IV og anti-6 HisTag antistoffer mot 1 mg/mL i TBS-T (Stock AB). Fortynne aksjen ABS av 167-D-IV 10 000-fold og anti-6 HisTag 5 000-fold ved å legge til 2 μL av aksjen 167-D-IV og 4 μL av aksjen anti-6 HisTag antistoffer mot to forskjellige rør som inneholder 20 mL av TBS-T. Tilsett totalt 20 mL volum av primære antistoffer, en til hver blot, og ruge blots for 1 h. vask blots to ganger med TBS-T i 10 min.
- Fortynne 4 μL av 1 mg/mL av musen anti-menneskelig sekundært antistoff som bøyes med alkalisk fosfatase i 20 mL av TBS-T (1:5000 fortynning). Fortynne 4 μL av 1 mg/mL av geit anti-mus sekundære antistoff bøyd med alkalisk fosfatase i 20 mL av TBS-T (1:5000 fortynning). Legg til sekundære antistoffer i tilsvarende blots.
Merk: den anti-menneskelige sekundære antistoff binder seg til 167-D og anti-mus binder seg til anti-6 HisTag. Vask blots to ganger med TBS-T i 10 min. - Legg nok BCIP/NBT alkalisk fosfatase substrat for å dekke blots. Utvikle blots i ca 10 min til band vises. Skyll blots med kaldt vann fra springen og la dem tørke før skanning med en planskanner.
6. Refolding av SHB-SAPN
- Tilsett samlet protein (10 \ u201220 mL totalt) til en 10 kDa molekylvekt avskåret dialyse kassett og dialyze den i 8 M urea, 20 mM Tris, 5% glyserol, 5 mM TCEP pH 8,5 ved RT (18 \ u201226 ° c) over natten.
- Langsomt dialyze den urea av prøven ved å redusere urea konsentrasjonen i dialyse buffer trinnvis med 2 M hver 2 h. Ved en urea-konsentrasjon på 2 M, Flytt dialyse apparatet til 4 ° c (bruk ikke TCEP i bufferen for dialyse fra dette trinnet). Avslutt refolding ved å dialyzing prøven inn i 120 mM urea, 20 mM Tris, 5% glyserol, pH 8,5 ved 4 ° c over natten.
- Fjern den ombrettes protein (SHB-SAPN) fra dialyse kassetten. Filtrer SHB-SAPN ved hjelp av en 0,22 μm Polyvinylidene fluor (PVDF) sprøyte filer. Alikvot SHB-SAPN i sterile rør og Frys dem ved-80 ° c, og etterlater minst 100 μL ved RT for senere analyser.
7. validering av partikler etter størrelse og utseende
- Dynamisk lysspredning (DLS)
- Mål gjennomsnittlig partikkelstørrelsen på SHB-SAPN med følgende parametre: Velg protein som materiale, Opprett en kompleks buffer for 120 mM urea, 20 mM Tris, 5% glyserol 25 ° c for temperatur, Velg en gangs kyvetter for analysen, Velg automatisk måling, satt til 5 runs.
- Tilsett 45 μL av SHB-SAPN til en en gangs Cuvette og Kjør programvaren ved å klikke på den grønne pilen. Velg prosent volumet for avlesning.
- Nanopartikkel sporing analyse (NTA)
- Fortynne prøven av 1:20 inne det refolding buffer. Lag 10 mL fortynnet prøve.
- Bruk 3 mL sprøyter, skyll NTA instrumentet med refolding buffer og Last ca 1,5 mL prøve for å likevekt instrumentet. Bruk resten av eksemplet for analysen.
- Opprett en ny SOP i NTA programvare ved å klikke på SOP tab. Under fanen endre antall fanger til 3 og endre fangst tid til 30 s. Trykk på autofokus -knappen på venstre side av skjermen for å få prøven i fokus. Bruk den manuelle fokus knotten på siden av maskinen til å finjustere fokuset.
- Kjør den opprettede SOP, når systemet ber laste et lite volum av prøven med sprøyten. Etter at systemet har tatt alle fanger vil det automatisk få opp analysen skjermen. Skyv deteksjonsgrense linjen slik at alle de virkelige partiklene er merket med røde kors. Trykk på Run analyse knappen og analysen vil automatisk begynne.
- Mikroskopi for overførings elektron (TEM)
- Glow utslipp formbar/Carbon 400 mesh kobber TEM støtte filmer.
- Tilsett 3 μL prøve på en 0,075 mg/mL konsentrasjon til risten i 30 s. Wick av væsken ved hjelp av et filter papir.
- Vask rutenettet med 3 μL av deionisert vann tre ganger, hver gang fukttransport av vannet med filter papir.
- Tilsett 3 μL av 0,5% uranylnitratet acetate til støtte filmen og la den sitte i 30 s. Wick av de fleste av uranylnitratet acetate men la en tynn film på overflaten. La prøvene tørke før du Imaging dem på overføring elektronmikroskop.
- Bilde prøver ved 80 kV på en TEM.
8. fastsettelse av endotoksin nivåer i prøvene ved hjelp av en kinetisk limulus amoebocyte lysat (LAL)
- Fjern settet og prøvene fra kjøleskapet og la det likevekt til RT.
- For å utføre denne analysen, en plate leser med en varme blokk og evnen til å lese prøvene for 40 leser i en bølgelengde på 405 NM ved 37 ° c er nødvendig. Skriv en programmal slik at brønnene leses hver 150 s for å identifisere utbruddet tid punkt (OD økte med 0,2 i sammenligning med den første lese).
- Fortynne prøven til immunisering dose konsentrasjon i PBS.
Merk: pH i refolding buffer er utenfor rekkevidden til LAL analysen. Den fortynning av prøven i PBS vil sette pH til akseptabelt område. - Resuspend kontrollen endotoksin i den aktuelle mengden av endotoksin-fri LAL vann som bestemmes av sertifikatet for analyse for å generere 50 EU/mL. Ha en kraftig Vortex på hetteglasset i 15 minutter for å sikre fullstendig blanding av endotoksin.
- Generere endotoksin standard kurve ved preforming en 10-fold seriell fortynning i glass ampuller i området 50 EU til 0,005 EU/mL. Tilsett 0,1 mL av den forrige fortynning til 0,9 mL LAL vann for hver fortynning. Vortex kraftig etter kombinasjon i 1 min.
- Legg standard kurve fortynninger og SHB-SAPN prøver i duplikat til en 96-brønn plate. Bruk LAL vann som en negativ kontroll i duplikat også. Preincubate platen ved 37 ° c i 15 min.
- Mot slutten av inkubasjons resuspend reagensflasken i analysen med 2,6 mL av LAL vann. Bland innholdet forsiktig med en serologisk pipette.
- Tilsett 100 μL av analysen reagens til hver brønn av 96-brønn plate. Flytt raskt platen til plate leseren og Kjør program malen som er skrevet i trinn 8,2.
- Når programmet er fullført, kan du generere en standard kurve ved hjelp av Logg verdien for kontrollene kontra Logg verdien for tidspunktet for utbruddet. Bruk formelen som genereres fra denne kurven, til å beregne endotoksin konsentrasjon i prøvene.
Representative Results
Den ferdig monterte SHB-SAPN som vises her, er bygget på protein sekvenser (figur 1a) som antas å brettes inn i en partikkel som inneholder 60 eksemplarer av monomer (figur 1B). Figur 2 gir en oversikt over metoden for produksjon, rensing og identifisering av SHB-SAPN kjerne. E. coli fra en glyserol lager som inneholdt en PPep-T uttrykk vektor med Gen SEKVENS av SHB-SAPN kjernen ble indusert i BL21 (DE3) E. coli. Bakterielle celler ble vellykket dyrket og lysert under denaturering og redusere forholdene.
Totalt celle lysat ble brukt til å rense SHB-SAPN monomerer av FPLC ved hjelp av en ni2 + kolonne (figur 3a). FPLC-kromatografisk demonstrerer at protein eluert både på 150 mM og 500 mM imidazole (figur 3a). Kromatogram viser også to andre topper på 185 mL og 210 mL totalt volum tilsvarende isopropanol vask og imidazole-fri vask, henholdsvis. Fraksjoner og renheten av rekombinant protein ble identifisert ved gradient SDS-PAGE gels (figur 3b). Proteinet av interesse var hovedsakelig plassert i fraksjoner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL totalt volum). Disse fraksjonene ble kombinert for videre analyser. Western Blot med anti-His antistoff (N-Terminal) og 167-D-IV antistoff (C-Terminus) indikerte at de samlede fraksjoner var faktisk proteinet av interesse (figur 4a, B). Disse blots viste også tilstedeværelsen av SHB-SAPN multimers. Tidligere vasker og eluering fraksjoner tendens til å inneholde en høyere konsentrasjon av multimerized protein og ble derfor ekskludert.
Prøvene som inneholdt protein monomerer av interesse ble foldet inn i ferdig montert SHB-SAPN av dialyse. Partikkelstørrelsesfordelingen ble bestemt av DLS og nanopartikkel sporings analyse (figur 5a, B). DLS identifiserte partikler med en Z-gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter på 67 NM mens NTA systemet målte en gjennomsnittlig størrelse på 81 NM. Liten størrelse forskjellene skyldtes partikkel dimensjonering teknikker, men størrelsen fra begge analysene var i forventet område på 20 \ u2012100 NM8,24,25. SHB-SAPNs ble vist ved TEM og bildene viste godt formede individuelle partikler med størrelsesfordelingen fra de to partikkel størrelses teknikkene (figur 5c).
Under rensing av proteinet ble kolonnen vasket med isopropanol for å redusere LPS-forurensningen i det endelige SHB-SAPN-produktet. For å verifisere om endotoksin nivået var akseptabelt for immunisering, ble konsentrasjonen av LPS i SHB-SAPN prøver renset med eller uten isopropanol vaske trinnet ble bestemt av en kinetisk LAL analysen. Resultatene indikerte at isopropanol vask reduserte endotoksin nivåer fra > 0,25 EU/μg til 0,010 EU/μg av SHB-SAPN protein (tabell 1).
Figur 1: SHB-SAPN protein sekvens og struktur. (A) aminosyren SEKVENSEN av SHB-SAPN monomer. (B) datamaskinmodell av strukturen av den fullt monterte SHB-SAPN-kjernen bestående av 60 protein monomerer. Fargevalg for aminosyre-sekvenser: grå = HisTag; Grønn = pentamer; Mørk blå = de Novo designet trimer; Lyseblå = seks-Helix bunt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: flytskjema for protokoll for SHB-SAPN produksjon. Fargevalg: svart = uttrykk for proteinet monomer i E. coli; Mørkegrå = monomer rensing; Medium grå = monomer identifikasjon; Lys grå = refolding og karakterisering; Hvit = ferdig montert SHB-SAPN-produkt. I trinn merket med mørk og middels grå, er proteinet under denaturering og reduserer forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: protein rensing av SHB-SAPN-monomerer. (A) KROMATOGRAFISK fra FPLC rensing. Grønn linje over kromatogram indikerer rense trinnene. Blå linje i kromatogram representerer den optiske tettheten av fraksjoner ved 280 NM bølgelengde. Den svarte linjen viser hvor mange prosent av buffer B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM natrium fosfat enbasisk, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole, pH 8,5) som ble brukt i hvert trinn av rensing. (B) SDS-Page gels av de grupperte fraksjoner fra Lysat (L), strømme gjennom (ft), første vask (W1), isopropanol vask (W2), tredje vask (w3), og individuelle fraksjoner fra 150 mm Imidazole (E150) og 500 mm Imidazole (E500) eluering trinn i Rensing. Molekylære markører i første kjørefelt (M) identifiserer bånd mellom 10 og 250 kDa. Mål proteinet indikeres av en svart pil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: identifisering av proteinet ved Western Blot. Alle kjørefelt er lastet med 100 ng av protein. (A) resultatene av en Western Blot med anti-6-HisTag. (B) resultater av en Western Blot med et 167-D-IV HIV-1-monoklonale antistoff. Lanes er merket som: M = molekylvekt markør; 1 = lysat; 2 = strømme gjennom; 3 = vask først; 4 = isopropanol vask (andre vask); 5 = tredje vask; 6 = grupperte volum fraksjoner 56 \ u201261 (første eluering topp), 7 = grupperte volum fraksjoner 62 \ u201267 (mellom de to toppene), 8 = grupperte volum brøker 68 \ u201278 (andre eluering topp). Target protein med forventet bandet størrelse på 18,07 kDa som monomere SHB-SAPN bandet er indikert med en svart pil. Ekstra bånd i kjørefelt 7 og 8 er dimers, trimers og multimers av SHB-SAPN (rød pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: karakterisering av OMBRETTES SHB-SAPN. (A). Partikkelstørrelsesfordeling som BESTEMMES av DLS. (B) partikkelstørrelse som bestemmes av nanopartikkel Tracking (system). (C) VISUALISERING av SHB-SAPN partikler av tem. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Endotoksin (EU/mL) | Endotoksin (EU/mikrogram protein) |
| SAPN med isopropanol vask | 2,02 | 0,01 |
| SAPN uten isopropanol Wash | > 50 | > 0,25 |
| Negativ kontroll | Under deteksjons nivå | N/a |
Tabell 1: endotoksin nivåer av OMBRETTES SHB-SAPNs. Endotoksin nivåer i SHB-SAPN prøver renset med eller uten en isopropanol vask presentert både som endotoksin enheter/mL og endotoksin enheter/μg av SHB-SAPN protein.
Discussion
Nanoteknologi gir mange fordeler og løsninger for delenhet vaksine utvikling. Nanovaccines kan gjentatte ganger presentere antigener som partikler til verts immunsystemet øker immunogenisitet26. Mens det er mange forskjellige typer Nanovaccines, tror vi at de består av de Novo designet protein synes å være den sterkeste tilnærmingen for vaksine utvikling1. De kan være konstruert uten noen sekvens homologi til verten proteiner og presentere antigen av interesse i nær native-like konformasjon samtidig som lave produksjonskostnader og høy produkt avkastning. Et godt eksempel på denne tilnærmingen er SAPN teknologi, som vi har søkt på vaksiner mot flere smittsomme sykdommer7. Adressering vanskelighetene i HIV-1 vaksine utvikling, har vi utviklet en unik SHB-SAPN kjerne for effektivt å presentere V1V2 antigen i en innfødt-lignende trimeric konformasjon9. Mange vaksine mål, spesielt for virussykdommer, er tilstede som trimers27. Dette fenomenet indikerer at vår SAPN design har bred implikasjoner for utviklingen av delenhet vaksiner.
I denne metoden demonstrerer vi hvordan man produserer SHB-SAPNs i et E. coli Expression system. Vi uttrykte høye avlinger av protein (ca 6 mg/100 mL kultur). Proteinet inneholdt 10 histidines og ble lett renset ved hjelp av en immobilisert metall affinitet kromatografi med ni2 + kolonne. Denne lengden av HIS-tag ble funnet å være den optimale for den høyeste protein yield. Renset proteinet inneholdt full lengde av designet protein som indikert av tilstedeværelsen av både N-Terminal HisTag og C-terminalen heptad gjenta. Vi benyttet allment aksepterte teknikker og optimalisert dem for uttrykk, produksjon og karakterisering av SHB-SAPN kjernen. Mangel på produksjon av full-lengde protein under utviklingen av en SAPN inneholder et nytt protein epitope kan indikere et uttrykk problem av genet i verten cellen. Hvis det skjer, må genet og uttrykks systemet være redesignet og tilpasset den beskrevne protokollen. Modifisering av sonikering tid eller intensitet kan også øke konsentrasjonen av spådd full-lengde protein.
Ombrettes partikler var i forventet størrelsesområde (20 til 100 NM)8,24,25 som bestemmes av DLS og nanopartikkel Tracking analyse. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av TEM. Hvis det er problemer i dette trinnet, er det normalt på grunn av et problem med pH eller ioniske styrke refolding buffer. Når stor størrelse partikler oppdages på partikkel dimensjonering teknikker, indikerer det aggregering, som kan unngås ved å øke pH i refolding buffer. Hvis partiklene ikke oppdages av DLS, verifisere konsentrasjonen av proteinet og sjekk pH i bufferen. Den endelige protein konsentrasjonen for DLS bør være minst 100 μg/mL. Hvis konsentrasjonen er ikke problemet, indikerer det overflod av små, ufullstendig dannet partikler, hvis konsentrasjonen kan reduseres ved å redusere pH. Alternativt kan natriumklorid konsentrasjonen justeres til det optimale området for å minimere tilstedeværelsen av partikler med uønsket størrelse.
Til slutt, ved hjelp av en isopropanol vasketrinn under rensing vi var i stand til å redusere forurensende LPS fra verten E. coli til 0,01 EU/ΜG av SAPN som er under Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) grense på 5 EU/kg kroppsvekt for injiserbare produkter 28. dette nivået kan bli ytterligere redusert ved å bruke en anion utvekslings Kol onnen også kjent som Q kolonne. Hvis høye nivåer av endotoksin er fortsatt til stede, sjekk alle materialer som ble brukt for buffer forberedelse. Husk å bruke bare depyrogenated glass og endotoksin gratis plasticware i denne metoden.
Disse resultatene tyder på at vi har med hell utviklet en metode for å produsere SHB-SAPN kjernen som kan brukes for pre-kliniske immunisering studier. Denne metoden med bare små modifikasjoner, om noen, kan brukes til rensing av SHB-SAPNs når et antigen av interesse er lagt til. Ved hjelp av denne metoden som utgangspunkt en av de store endringene er i eluering trinn. Ulike proteiner eluere ved ulike imidazole konsentrasjoner som må fastsettes eksperimentelt. Den andre store forskjellen kan være sammensetningen av refolding buffer. Optimalisering vil kreve testing ulike pH forhold samt ioniske styrker.
I betraktning av fremtidig arbeid, er det bare to små modifikasjoner som trengs for å tillate menneskelig anvendelse av SHB-SAPN. Den første er at uttrykket vektoren må endres til en kanamycin motstand valgbar markør på grunn av Ampicillin allergi hos mennesker29. Det annet større behov av det protein fremstiller for Human bruk er å tilvirke det SHB-SAPN inne dyr fabrikat-ledig Media. En liten studie indikerte allerede en rimelig utbytte av protein i en plantebasert Media. Arbeidet som presenteres her er lett skalerbar for endelig GMP produksjon som demonstrert med en malaria vaksine kandidat, FMP01416. Denne stor skala FMP014-SAPN-produksjonen inkluderte både den anion utvekslingen og de avgjørende utvekslings trinnene for å redusere LPS og ni2 + innhold fra det endelige produktet. Dette bakteriell-uttrykt SAPN er allerede skalert opp for en kommende fase 1/2a klinisk studie.
Disclosures
Synspunktene uttrykt er de av forfatterne og bør ikke tolkes til å representere posisjonene til den amerikanske hæren eller Department of Defense. Peter Burkhard har en interesse i selskapet som heter Alpha-O peptider AG og har patenter på teknologien. De andre forfatterne har ingen tilknytning eller økonomisk engasjement med noe selskap med en finansiell interesse på emnet som presenteres i denne utredningen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en samarbeidsavtale (W81XWH-11-2-0174) mellom Henry M Jackson Foundation for fremming av militær medisin, Inc. og det amerikanske forsvarsdepartement. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antistoff ble mottatt fra Dr. Susan Zolla-Pazner gjennom NIH AIDS reagens program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
| 2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
| 40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
| Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
| Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
| BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
| Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
| GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
| Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
| Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
| Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
| LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
| Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
| Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
| One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
| Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
| Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
| Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
| Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
| JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
| NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
| PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
| Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
| Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
| Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
| Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
| Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |
References
- Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
- Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
- Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
- Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
- Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
- Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
- Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
- Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
- Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
- Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
- Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
- Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
- El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
- Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
- Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
- Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
- Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
- El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
- Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
- Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
- O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
- Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
- Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
- Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
- Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
- Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
- Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
- Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).
