Summary
En detaljeret metode er givet her beskriver rensning, refolkning, og karakterisering af selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) til brug i vaccine udvikling.
Abstract
Selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som gentagne antigen displays og kan bruges til at udvikle en bred vifte af vacciner til forskellige smitsomme sygdomme. I denne artikel viser vi en metode til at producere en SAPN kerne, der indeholder en seks-Helix Bundle (SHB) samling, der er i stand til at præsentere antigener i en trimert kropsbygning. Vi beskriver udtrykket af SHB-SAPN i et E. coli -system, samt de nødvendige protein rensning trin. Vi inkluderede et isopropanol vaske trin for at reducere rest bakterien lipopolysaccharid. Som en indikation af protein identitet og-renhed reagerede proteinet med kendte monoklonale antistoffer i Western blot-analyser. Efter at have refoldet, faldt størrelsen af partiklerne i det forventede interval (20 til 100 nm), som blev bekræftet af dynamisk lysspredning, nanopartikel tracking analyse, og transmission elektronmikroskopi. Den beskrevne metode er optimeret til SHB-SAPN, men med kun små modifikationer kan den anvendes på andre SAPN konstruktioner. Denne metode er også let overføres til storstilet produktion til GMP fremstilling for humane vacciner.
Introduction
Mens den traditionelle vaccine udvikling har fokuseret på de inaktiverede eller svækkede patogener, er fokus for moderne vacciner flyttet mod underenhed vacciner1. Denne tilgang kan føre til en mere målrettet respons, og potentielt mere effektive vaccinekandidater. En af de største ulemper er imidlertid, at under enheds vacciner ikke er partikler som hele organismer, hvilket kan resultere i nedsat immunogenicitet2. En nanopartikel som et gentaget antigen display system kan have fordelene ved både den målrettede underenhed vaccine tilgang samt partikel karakter af hele organismen1,3.
Blandt de eksisterende typer af nanovacciner giver rationelt designede protein samlinger mulighed for udformning og udvikling af vaccinekandidater, der kan præsentere flere eksemplarer af antigen potentielt i en indfødt-lignende kropsbygning1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein samlinger er de selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er baseret på coiled-Coil domæner og er traditionelt udtrykt i Escherichia coli8. Sapn vaccinekandidater er blevet udviklet til en række forskellige sygdomme som malaria, SARS, influenza, Toxoplasmose, og HIV-19,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. hver sapn-kandidats udformning er specifik for det patogen, der er interesse, men produktions-, rensnings-og refoldnings teknikken er generelt alment anvendelig.
En af vores nuværende interesser er en effektiv HIV-1 vaccine. I RV144 — det eneste kliniske fase III-forsøg med en hiv 1-vaccine, der udviste beskeden effekt — var den reducerede infektionsrisiko korreleret med IgG-antistoffer mod V1V2-løkken i konvolut proteinet20,21. Den indfødte-lignende trikemeje præsentation af denne region menes at være vigtigt for beskyttende immunogenicitet22. For at præsentere V1V2 loop i så tæt på Native-lignende konstellation som muligt, vi udviklet et bevis på princippet SAPN vaccinekandidat, der indeholdt HIV-1 konvolut post-fusion Six-Helix Bundle (SHB) at præsentere V1V2 loop i den korrekte kropsbygning9 . Denne kandidat blev anerkendt af kendte monoklonale antistoffer mod HIV-1 konvolut protein. Mus immuniseret med V1V2-SHB-sapn rejst V1V2 specifikke antistoffer, at, vigtigst, bundet til gp70 V1V2, den korrekte konformationelle epitoper9. SHB-SAPN kernen kunne have andre funktioner ud over rollen som en bærer til HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljeret metode til ekspression, oprensning, genfoldning og validering af SHB-SAPN kernen. Sekvens valget, nanoparti design, Molekylær kloning og omdannelse af E. coli er tidligere beskrevet9.
Protocol
1. ekspression af SHB-SAPN-proteinet i E. coli BL21 (DE3)
- Der blandes 95 mL komponent A og 5 mL af mediet B i en 2 L steril glaserlenmeyerkolbe som vist i fabrikantens anvisninger (Se tabellen over materialer). Tilsæt ampicillin til en slutkoncentration på 100 μg/mL.
- Inokulere medierne med E. coli fra en tidligere etableret glycerol bestand kultur. Inkuber kulturen ved 30 °C med omrystning ved 200 omdrejninger pr. minut (rpm) for 48 h.
Bemærk: den anvendte E. coli BL21 (DE3)-bestand indeholdt det ampicillin-resistente udtryk Vector23 med SHB-sapn-genet. Selv om den generelle protokol for medierne anbefaler 24 h inkubation ved 37 °C, 48 h af inkubation ved 30 °C gav højere udbytte for SHB-SAPN. - Overfør kulturen til 2 50 mL koniske rør. Rørene centrifugeres ved 4.000 x g i 10 minutter med en fast vinkel rotor ved 4 °c. Fjern supernatanten og Gem pellet til høst celler.
Bemærk: celle pellet kan enten forarbejdes straks eller fryses ved-80 °C indtil brug.
2. lysis af E. coli BL21 (DE3) ved sonikering
Bemærk: Brug ikke-pyrogene plasticware og glasvarer bagt ved 250 °C i mindst 30 min. tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) som reduktionsmiddel bryder disulfid-obligationerne inden for og mellem proteiner. TCEP er nødvendig i bufferne under denne protokol, hvis det viste antigen indeholder S-S-bindinger. For SHB-SAPN kerne kun, tilstedeværelsen af TCEP i buffere er ikke afgørende.
- Forbered imidazol-fri buffer (8 M urinstof, 50 mM natriumphosphat monobasic, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP) pH 8,0 (justeret med 5 N NaOH) og Filtrer den ved hjælp af en 0,22 μm vakuum flaske filtreringsenhed.
- Resuspendere de pelleteret celler (fra trin 1,3) med 40 mL imidazol-fri buffer i 1 50 mL konisk rør. Soniker de resuspenderede celler med en sonde på is i 5 minutter (4 s sonikering, 6 s af hvile) med en sonikering udgang på 150 W.
- Centrifuger cellulært lysat (40 mL) ved 29.000 x g ved 4 °c i 25 min i en fast vinkel rotor for at generere tydelig supernatant. Supernatanten overføres til en 150 mL steril kolbe, og pellet kasseres. Supernatanten fortyndes til 100 mL ved hjælp af den imidazolfri buffer (senere i den protokol, der omtales som "prøve").
Bemærk: dette fortyndings trin er nødvendigt for at forhindre, at FPLC-systemtrykket bliver for højt under indlæsning af lysat på søjlen.
3. protein rensning ved hjælp af en hans-kolonne
Bemærk: denne protokol blev udført med et FPLC-instrument, men den kan tilpasses tyngdekraften.
- Forbered følgende buffere og Filtrer dem ved hjælp af en 0,22 μm vakuum flaske filtreringsenhed: (i) imidazol-fri buffer "buffer A" (8 M urinstof, 50 mM natriumphosphat monobasic, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP) pH 8,0; II) 500 mM imidazolbuffer "buffer B" (8 M urinstof, 50 mM natriumphosphat monobasic, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol) pH 8,0; og III) isopropanol vask (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8,0.
Bemærk: pH for hver buffer blev justeret med 5 N NaOH. - Den pågældendes kolonne.
Bemærk: for Lab Scale produktion, denne protokol bruger en 5 mL færdigpakket hans-kolonne, men enhver større størrelse kolonne kan bruges.- Åbn FPLC-softwaren, og klik på indstillingen ny metode . Det vil straks åbne menuen metodeindstillinger . Vælg C1-port 3under rullemenuen for kolonne placering.
- På den viste ved teknik drop down menu vælge affinitet. På rullemenuen Kolonnetype vælger du andre, histrap HP, 5 ml. Kolonne volumen og tryk bokse vil automatisk blive indstillet til de relevante værdier.
- Klik på knappen metode disposition . Træk følgende knapper fra pop op-menuen fase bibliotek : ækvilibrering, eksempel applikation, kolonne vaskog eluering ved siden af pilen i den nøjagtige rækkefølge. Luk menuen fase bibliotek .
- Klik på knappen ækvilibrering . De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" (4%), "endelig buffer B" (4%) og "volumen (CV)" 5.
- Klik på eksempel ansøgningen boks. Klik på alternativknappen for Injicér prøve på kolonne med prøve pumpei feltet prøve indlæsning. Sørg for, at feltet ved siden af Brug strømningshastigheden fra metode indstillingerne er markeret i prøve injektionen med system pumpe boks. Ved siden af lydstyrke boksen i højre side af skærmen ændres værdien til 20 ml.
- Klik på knappen kolonne vask . De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" (4%), "endelig buffer B" (4%) og "volumen (CV)" 5. Ved siden af brøk indsamlings skemaet skal du fjerne markeringen i feltet Aktivér.
- Klik på elueringsknappen . De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" 0%, "Final buffer B" 100% og "Volume (CV)" 5. Klik på feltet Aktivér ud for brøk indsamlings skemaet. Fjern Klik på indstillingen Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger , og Juster brøk størrelsen til 4 ml i udfyldnings boksen nedenfor.
- Klik på knappen Gem som øverst i softwaren. Navngiv filen "equilibration".
- Tilslut en 5 mL færdigpakket hans-kolonne til den tilsvarende kolonne port 3 på FPLC. Både pumpe A-og pumpe B-slanger samt prøve pumpens slange skal placeres i 0,22 μm filtreret deioniseret vand. Kør ækvilibrering-programmet.
- Placer både pumpe A og pumpe B samt prøve pumpeslangen i den imidazolfri buffer (buffer A), og Kør ækvibrationsprotokollen igen.
- Binde prøven til kolonnen og rense proteinet.
- Åbn FPLC-softwaren, og klik på indstillingen ny metode . Det vil straks åbne menuen metodeindstillinger . Vælg C1-port 3under rullemenuen for kolonne placering . På den viste ved teknik drop down menu vælge affinitet. På rullemenuen kolonnetype vælger du andre, Histrap HP, 5 ml. Kolonne volumen og tryk bokse vil automatisk blive indstillet til de relevante værdier.
- Klik på knappen metode disposition . Træk knapperne fra pop op-menuen fase bibliotek : ækvibration, prøve påføring, kolonne vask (vask 1), kolonne vask (vask 2), kolonne vask (vask 3) og eluering ved siden af pilen i den nøjagtige rækkefølge. Luk menuen fase bibliotek .
- Klik på knappen Equilibration . De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" 4%, "endelig buffer B" 4% og "Volume (CV)" 5.
- Klik på eksempel ansøgningen boks. I feltet eksempel på indlæsning skal du klikke på alternativknappen for Inject prøve på kolonne med prøve pumpe. Sørg for, at feltet ved siden af Brug strømningshastigheden fra metode indstillingerne er markeret i prøve injektionen med system pumpe boks.
- Ved siden af lydstyrke boksen i højre side af skærmen ændres værdien til 100 mL. Klik på knappen Aktivér ud for brøk indsamlings skemaet. Fjern markeringen i feltet Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger , og Skift brøk størrelsen til 4 ml.
- Klik på den første kolonne vask knap (vask 1). De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" 4%, "Final buffer B" 4% og "Volume (CV)" 10. Klik på feltet Aktivér ud for brøk indsamlings skemaet. Fjern Klik på Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger , og skift derefter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klik på den anden kolonne vask knap (vask 2). De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" 0%, "Final buffer B" 0% og "Volume (CV)" 5. Klik på feltet Aktivér ud for brøk indsamlings skemaet. Fjern Klik på Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger , og skift derefter brøk størrelsen til 4 ml.
- Klik på den tredje kolonne vask knap (vask 3). De værdier, der er angivet i tabellen, skal være "Initial buffer B" 0%, "Final buffer B" 0% og "Volume (CV)" 5. Klik på Aktivérud for brøk indsamlings skemaet. Fjern markeringen i feltet Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger , og Skift brøk størrelsen til 4 ml.
- Klik på Elueringsknappen . Klik på de viste oplysninger i tabellen, og klik på Slet trini den menu, der kommer op. Træk den isokratiske farveforløbs knap til tabellen to gange, så der er to indgange.
- Værdien for den første post skal læses som "Initial buffer B" 30%, "Final buffer B" 30% og "Volume (CV)" 10. Værdien for den anden post skal læses som "Initial buffer B" 100%, "Final buffer B" 100% og "Volume (CV)" 10. Klik på knappen Aktivér ud for brøk indsamlings skemaet. Klik på feltet ud for Brug brøk størrelse fra metodeindstillinger.
- Klik på knappen Gem som øverst i softwaren. Navngiv filen "rensning". Pumpe en slange af FPLC skal placeres i imidazol-fri vaskebuffer, mens pumpe B slange skal placeres i 500 mM imidazol buffer. Prøve pumpens slange skal anbringes i 100 mL prøven.
- Kør "rensning" programmet og vente på det tidspunkt, hvor 60% isopropanol er nødvendig (vask 2). Pause programmet, flytte pumpe en slange fra imidazol-fri vask i 60% isopropanol vask. Genstart programmet.
- Når isopropanol-trinnet er afsluttet, skal du sætte programmet på pause igen og flytte pumpe en slange tilbage til imidazol-fri vaskebuffer. Genstart renseprogrammet (resten af kørslen er automatiseret).
4. vurdering af renhed og identifikation af proteiner ved SDS-PAGE
- Kombiner alle de fraktioner, der svarer til (i) gennemstrømning (celle lysatet, som ikke binder sig til hans kolonne), (II) vask 1, (III) vask 3 (60% isopropanol vask), og (IV) vask 3 i separate 50 mL koniske rør. De 2 mL fraktioner må ikke kombineres fra elueringstrinene.
- Bland 15 μL fra hver af de poolede fraktioner og alle fraktioner fra elueringstrin med 2x Laemmli-prøve buffer i et 0,5 mL mikrocentrifuge glas og denaturere dem ved 95 °C i 10 min.
- Mens proteinet denatureret, oprette gel kørende apparater med 3 pletfri 4 – 20% præfabrikerede polyacrylamid geler i 1x Tris-Glycine SDS-side kører buffer.
- Læg 8 μL molekylvægt markør til den første brønd og 30 μL denatureret prøve til de andre brønde i gelen. Kør geler på 200 V indtil farvestoffet foran rammer bunden af gelen (ca. 30 min). Fjern geler fra apparatet og skyl kortvarigt med deioniseret vand. Billede gelen med det samme ved hjælp af det pletfri billedsystem.
- Identificer de fraktioner, der indeholder protein bånd med den korrekte størrelse (18,07 kDa). Pulje alle disse fraktioner.
5. identifikation af proteiner af Western blot
- Køre en Western blot ved hjælp af en hans-specifikke antistof (anti-6x HisTag) og en SHB-specifikke antistof (167-D-IV) at identiteten af renset fuld-længde protein. Anti-6x-HisTag-antistoffet genkender N-endestation af proteinet, og 167-D-IV-antistoffet genkender C-endestation, som viser tilstedeværelsen af det fulde proteinindhold.
- Bestem proteinkoncentrationen af (i) gennemstrømning, (II) vask 1, (III) vask 2 (60% isopropanol vask), (IV) vask 3, og alle fraktioner fra elueringstrinene med spektrometer instrumentet ved en absorbans på 280 Nm. Der genereres fortyndinger, som indeholder 100 ng protein i 15 μL imidazol-fri buffer for hver af disse grupper.
- Tilsæt 15 μL 2x Laemmli-prøve buffer til hver 15 μL af prøverne, og denatur dem som i trin 4,1. Når denatureringen er afsluttet spin ned rørene for at sikre, at alle proteinet kan overføres.
- Læg prøverne og den forfarvede markør i en pletfri 4 – 20% præstøbt polyacrylamid-gel. Kør elektroforese ved 200 V, indtil farvestoffet forsiden når bunden af gelen.
- Mens gelen løber, skal du lave 1 L TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) og 200 mL 5% fedtfri mælk i TBS-T.
- Brug et Western blot Transfer system til at overføre protein på en nitrocellulose membran. Brug en færdigmonteret overførsels stak, og Anbring gelen på den. Indstil systemet til at køre ved 25 V i 7 min. Kontroller for tilstedeværelsen af den forfarvede markør på nitrocellulose membranen, der indikerer en komplet overførsel.
Bemærk: alle de efterfølgende trin udføres på en orbital shaker indstillet til 100 rpm ved stuetemperatur (RT). - Når overførslen er afsluttet, vask blots to gange med TBS-T for 10 min hver.
- Blok nitrocellulose membraner (blot) med 5% ikke-fed mælk i TBS-T i mindst 1 h. vask blots to gange med TBS-T for 10 min hver.
- Den primære 167-D-IV-og anti-6x-HisTag-antistoffer fortyndes til 1 mg/mL i TBS-T (Stock AB). Fortyndes bestanden ABS af 167-D-IV 10.000-fold og anti-6x HisTag 5.000-fold ved at tilføje 2 μL af bestanden 167-D-IV og 4 μL af bestanden anti-6x HisTag antistoffer til to forskellige rør indeholdende 20 mL TBS-T. Tilsæt den totale 20 mL volumen af primære antistoffer, en til hver blot, og Inkubér blots i 1 h. vask blots to gange med TBS-T i 10 min.
- 4 μL af 1 mg/mL af musens anti-humane sekundære antistof konjugeret med alkalisk fosfatase i 20 mL TBS-T (1:5000 fortynding) fortyndes. 4 μL 1 mg/mL ged anti-mus sekundært antistof konjugeret med alkalisk fosfatase i 20 mL TBS-T (1:5000 fortynding). Tilsæt sekundære antistoffer til tilsvarende blots.
Bemærk: den anti-humane sekundære antistof binder sig til 167-D og anti-Mouse binder sig til anti-6x HisTag. Vask blots to gange med TBS-T i 10 min. - Tilsæt nok BCIP/NBT alkalisk fosfatasesubstrat til at dække bloterne. Udvikle blots for ca 10 min indtil bands vises. Skyl blots med koldt vand fra hanen, og lad dem tørre, før du scanner med en flatbed-scanner.
6. opfoldning af SHB-SAPN
- Tilsæt det samlede protein (10 \ u201220 mL i alt) til en 10 kDa molekylvægt afskåret dialyse kassette og dialyze det til 8 M urea, 20 mM Tris, 5% glycerol, 5 mM TCEP pH 8,5 ved RT (18 \ u201226 °C) natten over.
- Langsomt dialysere urinstof ud af prøven ved at reducere urinstof koncentrationen i dialyse buffer trinvise med 2 M hver 2 h. Ved en urinstof koncentration på 2 M skal dialyseapparatet flyttes til 4 °C (brug ikke TCEP i dialyse bufferen fra dette trin). Afslut genfoldningen ved at dialyserer prøven til 120 mM urinstof, 20 mM Tris, 5% glycerol, pH 8,5 ved 4 °C natten over.
- Fjern det refoldede protein (SHB-SAPN) fra dialyse kassetten. Filter SHB-SAPN ved hjælp af en 0,22 μm polyvinylidenfluorid (PVDF) sprøjte filer. Aliquot SHB-SAPN i sterile rør og fryse dem ved-80 °C, hvilket giver mindst 100 μL ved RT for efterfølgende analyser.
7. validering af partikler efter størrelse og udseende
- Dynamisk lysspredning (DLS)
- Måle den gennemsnitlige partikelstørrelse af SHB-SAPN ved følgende parametre: Vælg protein som materiale, Opret en kompleks buffer til 120 mM urinstof, 20 mM Tris, 5% glycerol 25 °C for temperatur, Vælg engangs kuvetter til analysen, Vælg automatisk måling, der er indstillet til 5 kørsler.
- Tilsæt 45 μL SHB-SAPN til en engangs kuvette, og Kør softwaren ved at klikke på den grønne pil. Vælg den procentvise lydstyrke for udlæsningen.
- Nanopartikel tracking analyse (NTA)
- Prøven fortyndes med 1:20 i den genfoldnings buffer. Lav 10 mL fortyndet prøve.
- Brug 3 mL sprøjter til at skylle NTA-instrumentet med den genfoldnings buffer og indlæse ca. 1,5 mL prøve for at ækvibrere instrumentet. Brug resten af prøven til analysen.
- Opret en ny SOP i NTA-softwaren ved at klikke på fanen SOP . Under fanen ændre antallet af fanger til 3 og ændre Capture tid til 30 s. Tryk på knappen autofokus i venstre side af skærmen for at sætte prøven i fokus. Brug den manuelle fokusknap på siden af maskinen til at finjustere fokus.
- Kør den oprettede SOP, når systemet beder indlæse en lille mængde prøve med sprøjten. Efter at systemet har taget alle de fanger det vil automatisk opdrage analyse skærmen. Skub detektionsgrænse bjælken, så alle de rigtige partikler er markeret med Røde Kors. Tryk på knappen Kør analyse, hvorefter analysen automatisk begynder.
- Transmission elektronmikroskopi (TEM)
- Glow udledning formvar/Carbon 400 mesh kobber TEM støtte film.
- Der tilsættes 3 μL prøve i en 0,075 mg/mL-koncentration til gitteret i 30 s. væge af væsken ved hjælp af et filtrerpapir.
- Vask gitteret med 3 μL deioniseret vand tre gange, hver gang fugtspredende fra vandet med filtrerpapir.
- Der tilsættes 3 μL 0,5% ammoniumuranylcarbonat acetat til støtte filmen, og den kan sidde i 30 s. Wick off det meste af ammoniumuranylcarbonat acetat, men efterlade en tynd film på overfladen. Lad prøverne tørre, før de afbilde dem på transmissionselektronmikroskop.
- Billed prøver på 80 kV på et TEM.
8. bestemmelse af endotoksin i prøverne ved hjælp af en kinetisk Limulus amoebocyte lysat (Lal)-analyse
- Fjern sættet og prøverne fra køleskabet, og lad det være i ligevægt til RT.
- For at udføre denne analyse, en plade læser med en varmeblok og evnen til at læse prøverne for 40 læser ved en bølgelængde på 405 nm ved 37 °C er påkrævet. Skriv en program skabelon, så brøndene læses hver 150 s at identificere den debut tidspunkt (OD steg med 0,2 i forhold til den første læse).
- Prøven fortyndes til immuniserings dosis koncentrationen i PBS.
Bemærk: pH-værdien af den genfoldnings buffer ligger uden for LAL-analysens rækkevidde. Fortynding af prøven i PBS vil sætte pH til det acceptable interval. - Resuspension af kontrol endotoksin i den passende mængde af endotoksin-fri Lal vand som bestemt af analyseattesten til at generere 50 EU/ml. Vortex kraftigt hætteglasset i 15 min for at sikre fuldstændig opblanding af endotoksin.
- Fremstilling af endotoksin standardkurve ved at præforme en 10-fold seriel fortynding i hætteglas i intervallet 50 EU til 0,005 EU/mL. For hver fortynding tilsættes 0,1 mL af den foregående fortynding til 0,9 mL LAL vand. Vortex kraftigt efter kombination i 1 min.
- Tilsæt standardkurve fortyndinger og SHB-SAPN prøver i duplikat til en 96-brønd plade. Brug LAL vand som en negativ kontrol i duplikat så godt. Preincubat pladen ved 37 °C i 15 min.
- Mod slutningen af inkubationen, resuspendere assay reagens hætteglasset med 2,6 mL LAL vand. Bland forsigtigt indholdet med en serologisk pipette.
- Tilsæt 100 μL af analyse reagenset til hver brønd på 96-brønd pladen. Flyt pladen hurtigt til plade læseren, og Kør Programskabelonen, som er skrevet i trin 8,2.
- Når programmet er færdig, generere en standardkurve ved hjælp af log værdien af kontrollerne versus log værdi af den debut tid. Brug formlen genereret fra denne kurve til at beregne endotoksin koncentrationen i prøverne.
Representative Results
Den fuldt samlede SHB-SAPN vist her er bygget på protein sekvenser (figur 1a), der forventes at folde ind i en partikel, der indeholder 60 kopier af monomer (figur 1b). Figur 2 indeholder en skitse over metoden til produktion, rensning og identifikation af SHB-sapn-kernen. E. coli fra en glycerol bestand, der indeholdt en Ppep-T ekspressions vektor med gensekvens af SHB-sapn-kernen, blev INDUCERET i BL21 (DE3) E. coli. Bakterielle celler blev med succes dyrket og lyseres under Denaturerings-og reduktions betingelser.
Total Cell lysat blev brugt til at rense SHB-sapn monomerer af fplc ved hjælp af en ni2 + kolonne (figur 3a). FPLC-kromatografen viser, at protein elueres både ved 150 mM og 500 mM imidazol (figur 3a). Kromatogrammet viser også to andre toppe ved 185 mL og 210 mL total volumen svarende til isopropanol-vask og imidazolfri vask. Brøkdele og renhed af det rekombinante protein blev identificeret ved gradient SDS-PAGE gels (figur 3b). Det protein af interesse var primært placeret i fraktioner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL samlede volumen). Disse fraktioner blev kombineret til yderligere analyser. Western blot med anti-antistof (N-terminal) og 167-D-IV antistof (C-Terminus) indikerede, at de poolede fraktioner faktisk var protein af interesse (figur 4a, B). Disse blots også demonstreret tilstedeværelsen af SHB-SAPN multimere. Tidligere vaske og elueringsfraktioner havde en tendens til at indeholde en højere koncentration af multimeriseret protein og blev derfor udelukket.
De prøver, der indeholdt de protein monomerer af interesse blev foldet ind i fuldt samlet SHB-SAPN ved dialyse. Partikelstørrelsesfordelingen blev bestemt af DLS og nanoparti sporings analyse (figur 5a, B). DLS identificerede partikler med en Z-gennemsnitlig Hydrodynamisk diameter på 67 nm, mens NTA-systemet målte en gennemsnitsstørrelse på 81 nm. De små størrelsesforskelle skyldtes partikel størrelses teknikken, men størrelsen fra begge analyser var i det forventede interval på 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs blev visualiseret ved TEM og billederne viste velformede individuelle partikler med størrelsesfordelingen opnået fra de to partikel størrelses teknikker (figur 5c).
Under rensningen af proteinet blev søjlen vasket med isopropanol for at nedsætte LPS-forureningen i det endelige SHB-SAPN-produkt. For at kontrollere, om endotoksin niveauet var acceptabelt til immunisering, blev koncentrationen af LPS i SHB-SAPN-prøver renset med eller uden isopropanol-skylle trinnet bestemt af en kinetisk LAL-analyse. Resultaterne viste, at isopropanol-vasken reducerede endotoksin niveauerne fra > 0,25 EU/μg til 0,010 EU/μg SHB-SAPN-protein (tabel 1).
Figur 1: SHB-SAPN protein sekvens og struktur. A) aminosyresekvensen af SHB-sapn monomer. B) computer model for strukturen af den fuldt monterede SHB-sapn-kerne bestående af 60 protein monomerer. Farveskema for aminosyre sekvenser: grå = HisTag; Grøn = pentamer; Mørkeblå = de Novo designet trimer; Lyseblå = Six-Helix bundt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rutediagram over protokol for SHB-SAPN-produktion. Farveskema: sort = udtryk for protein monomer i E. coli; Mørkegrå = monomer rensning; Medium grå = monomer identifikation; Lysegrå = refolning og karakterisering; Hvid = fuldt samlet SHB-SAPN produkt. I trin mærket med mørk og medium grå, er proteinet under denaturering og reducere forholdene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: protein rensning af SHB-SAPN monomerer. A) kromatograf fra fplc-rensning. Den grønne linje over kromatogrammet angiver rensnings trinene. Blå linje i kromatogrammet repræsenterer den optiske densitet af fraktioner ved 280 nm bølgelængde. Den sorte linje viser, hvilken procentdel af buffer B (8 M urinstof, 20 mM Tris, 50 mM natriumphosphat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol, pH 8,5), der blev anvendt i hver fase af rensningen. B) SDS-side geler af de samlede fraktioner fra Lysatet (L), gennemstrømning (ft), første vask (w1), isopropanol vask (w2), tredje vask (W3) og individuelle fraktioner fra 150 mm imidazol (E150) og 500 mm imidazol (E500) elueringstrin i Rensning. Molekylære markører i den første vognbane (M) identificerer bånd mellem 10 og 250 kDa. Målprotein er indikeret med en sort pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: identifikation af proteinet af Western blot. Alle baner er fyldt med 100 ng protein. (A) resultater af en Western blot med anti-6X histag. B) resultater af et Western blot med et 167-D-IV HIV 1-monoklonalt antistof. Banerne er mærket som: M = molekylvægt markør; 1 = lysat; 2 = gennemstrømning; 3 = første vask; 4 = isopropanol vask (anden vask); 5 = tredje vask; 6 = samlede volumen fraktioner 56 \ u201261 (første elueringsspids), 7 = poolede volumen fraktioner 62 \ u201267 (mellem de to toppe), 8 = poolede volumen fraktioner 68 \ u201278 (anden elueringsspids). Målprotein med den forventede bånd størrelse på 18,07 kDa, da det monomeriske SHB-SAPN-bånd er angivet med en sort pil. Ekstra banding i Lanes 7 og 8 er dimere, trimers og multimere af SHB-SAPN (rød pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: karakterisering af den genfoldede SHB-SAPN. (A). partikelstørrelsesfordeling som bestemt af DLS. (B) partikelstørrelse som bestemt af nanopartikel tracking (system). C) visualisering af SHB-sapn-partiklerne efter tem. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | Endotoxin (EU/mL) | Endotoxin (EU/μg protein) |
| SAPN med isopropanol vask | 2,02 | 0,01 |
| SAPN uden isopropanol vask | > 50 | > 0,25 |
| Negativ kontrol | Under detekteringsniveau | Nielsen |
Tabel 1: endotoksin niveauer af refoldede SHB-SAPNs. Endotoksin i SHB-sapn-prøver, der er renset med eller uden en isopropanol-vask, frembydes både som endotoksin-enheder/ml og endotoksin enheder/μg SHB-sapn-protein.
Discussion
Nanoteknologi giver mange fordele og løsninger for udvikling af under enheds vaccine. Nanovaccines kan gentagne gange præsentere antigener som partikler til værts immunsystemet stigende immunogenicitet26. Mens der er mange forskellige typer af Nanovaccines, vi mener, at dem, der består af de Novo designet protein synes at være den stærkeste tilgang til vaccine udvikling1. De kan konstrueres uden nogen sekvenshomologi til værten proteiner og præsentere antigenet af interesse i tæt på indfødte-lignende kropsbygning samtidig give lave produktionsomkostninger og høje produkt udbytter. Et glimrende eksempel på denne fremgangsmåde er SAPN-teknologien, som vi har anvendt på vacciner mod flere smitsomme sygdomme7. Håndtering af vanskelighederne i HIV-1 vaccine udvikling, har vi konstrueret en unik SHB-SAPN kerne til effektivt at præsentere V1V2 antigen i en indfødt-lignende trimert kropsbygning9. Mange vaccine mål, især for virussygdomme, er til stede som trimere27. Dette fænomen indikerer, at vores sapn-design har store konsekvenser for udviklingen af underenhed vacciner.
I denne metode demonstrerer vi, hvordan man producerer SHB-SAPNs i et E. coli -udtryks system. Vi udtrykte høje udbytter af protein (ca. 6 mg/100 mL kultur). Proteinet indeholdt 10 histidiner og blev let renset ved hjælp af en immobiliseret metalaffinitets kromatografi med ni2 + kolonne. Denne længde af hans-tag blev fundet at være den optimale for den højeste proteinudbytte. Det rensede protein indeholdt den fulde længde af det designede protein, som indikeret ved tilstedeværelsen af både N-terminal HisTag og C-terminalen heptad REPEAT. Vi udnyttede bredt accepterede teknikker og optimeret dem til udtryk, produktion og karakterisering af SHB-SAPN kerne. Manglende produktion af fuld længde protein under udviklingen af en sapn indeholdende en ny protein epitop kunne indikere et udtryk problem med genet i værtscellen. Hvis det sker, skal genet og udtryks systemet redesignet og tilpasses til den beskrevne protokol. Ændring af sonikering tid eller intensitet kan også øge koncentrationen af den forventede fuld længde protein.
Refoldede partikler var i det forventede størrelsesinterval (20 til 100 nm)8,24,25 som bestemt af DLS og nanopartikel tracking analyse. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved anvendelse af TEM. Hvis der er problemer i dette trin, er det normalt på grund af et problem med pH eller ionisk styrke af refolding buffer. Når store størrelse partikler detekteres på partikel størrelses teknikker, det indikerer aggregering, som kan undgås ved at øge pH af refolding buffer. Hvis partiklerne ikke detekteres af DLS, kontrollere koncentrationen af proteinet og kontrollere pH af bufferen. Den endelige proteinkoncentration for DLS bør være mindst 100 μg/mL. Hvis koncentrationen ikke er problemet, indikerer det overflod af små, ufuldstændigt dannede partikler, hvis koncentration kan reduceres ved at sænke pH. Alternativt kan natriumklorid koncentrationen justeres til det optimale område for at minimere tilstedeværelsen af partikler med uønsket størrelse.
Endelig, ved hjælp af en isopropanol vask trin under rensning var vi i stand til at reducere kontaminerende LPS fra værten E. coli til 0,01 EU/ΜG sapn, som er under Food and Drug Administration (FDA) grænse på 5 EU/kg legemsvægt for injicerbare produkter 28. dette niveau kan reduceres yderligere ved hjælp af en anion-udvekslings kolonne, også kendt som Q-kolonne. Hvis der stadig er høje niveauer af endotoksin, bør du kontrollere alle materialer, som blev brugt til buffer fremstilling. Husk at bruge kun depyrogenated glas og endotoksin gratis plasticware i denne metode.
Disse resultater indikerer, at vi med succes har udviklet en metode til at producere SHB-SAPN kerne, der kan anvendes til prækliniske immuniserings undersøgelser. Denne metode med kun små ændringer, hvis nogen, kan anvendes til rensning af SHB-SAPNs, når et antigen af interesse tilsættes. Ved hjælp af denne metode som udgangspunkt er en af de store ændringer i elueringstrinnet. Forskellige proteiner elueret ved forskellige imidazolkoncentrationer, der skal bestemmes eksperimentelt. Den anden store forskel kan være sammensætningen af den genfoldnings buffer. Optimering ville kræve afprøvning af forskellige pH-forhold samt Ioniske styrker.
I betragtning af det fremtidige arbejde er der kun behov for to små ændringer for at tillade anvendelse af SHB-SAPN på mennesker. Den første er, at udtrykket vektor skal ændres til en kanamycin resistens valgbar markør på grund af ampicillin allergi i mennesker29. Det andet store krav til protein fremstilling til human brug er at fremstille SHB-SAPN i animalske produkt frie medier. En undersøgelse i mindre målestok viste allerede et rimeligt udbytte af protein i et plantebaseret medie. Det arbejde, der præsenteres her, er let skalerbar til ultimativ GMP-produktion som demonstreret med en malariavaccine kandidat, FMP01416. Denne store FMP014-SAPN-produktion omfattede både anionbytningen og kation udvekslings trinnene for yderligere at reducere LPS-og ni2 + -indholdet fra det endelige produkt. Denne bakterielle-udtrykte SAPN er allerede blevet opskaleret til et kommende fase 1/2A klinisk forsøg.
Disclosures
De udtrykte synspunkter er forfatternes og bør ikke opfattes som værende udtryk for den amerikanske hærs eller forsvarsministeriets holdninger. Peter Burkhard har en interesse i selskabet kaldet Alpha-O Peptides AG og har patenter på teknologien. De andre forfattere har intet tilhørsforhold eller økonomisk engagement med nogen virksomhed med en finansiel interesse i det emne, der præsenteres i dette dokument.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en samarbejdsaftale (W81XWH-11-2-0174) mellem Henry M Jackson Foundation til fremme af militær medicin, Inc., og det amerikanske forsvarsministerium. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV-antistoffet blev modtaget fra Dr. Susan Zolla-Pazner gennem NIH AIDS-reagens programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
| 2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
| 40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
| Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
| Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
| BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
| Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
| GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
| Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
| Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
| Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
| LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
| Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
| Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
| One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
| Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
| Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
| Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
| Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
| JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
| NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
| PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
| Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
| Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
| Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
| Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
| Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |
References
- Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
- Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
- Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
- Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
- Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
- Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
- Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
- Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
- Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
- Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
- Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
- Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
- El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
- Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
- Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
- Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
- Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
- El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
- Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
- Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
- O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
- Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
- Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
- Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
- Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
- Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
- Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
- Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).
