Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60103
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1,2
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

Summary

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

Abstract

הרכבת עצמית חלקיקים חלבון (סאפאן) פונקציה כמו אנטיגן חוזרים מציג ניתן להשתמש כדי לפתח מגוון רחב של חיסונים עבור מחלות זיהומיות שונות. במאמר זה אנו מדגימים שיטה לייצר ליבה SAPN המכיל צרור שישה סליל (SHB) הרכבה כי הוא מסוגל להציג אנטיגנים trimeric conformation יווצרות. אנו מתארים את הביטוי של SHB-SAPN במערכת E. coli , כמו גם את הצורך לטיהור החלבון שלבים. . כדי להפחית את שרידי הלייפוסכפה החיידקי כאינדיקציה לזהות החלבון והטוהר, החלבון הגיב עם נוגדנים חד-שבטיים ידועים בניתוחי כתמי אבן מערביים. לאחר קיפול מחדש, גודל החלקיקים נפל בטווח הצפוי (20 עד 100 ננומטר), אשר אושר על ידי פיזור אור דינמי, ניתוח מעקב ננו-חלקיק, ומיקרוסקופ אלקטרון שידור. המתודולוגיה המתוארת כאן היא אופטימיזציה עבור SHB-SAPN, עם זאת, עם שינויים קלים בלבד זה יכול להיות מוחל על מבנים SAPN אחרים. שיטה זו גם ניתן להעברה בקלות לייצור בקנה מידה גדול עבור ייצור GMP עבור חיסונים אנושיים.

Introduction

בעוד פיתוח החיסון המסורתי התמקד פתוגנים מופעל או החליש, המיקוד של חיסונים מודרניים השתנה לכיוון החיסונים המשניים1. גישה זו יכולה להוביל לתגובה ממוקדת יותר, פוטנציאל יעיל יותר מועמדים חיסונים. עם זאת, אחד החסרונות העיקריים הוא כי חיסונים תת יחידות אינם חלקיקים כמו אורגניזמים שלמים אשר יכול לגרום חיסוני מופחת2. ננו-חלקיק כמו מערכת התצוגה אנטיגן חוזרים יכול להיות היתרונות של הן הגישה ממוקד החיסון הן כמו גם את האופי החלקיקי של האורגניזם כולו1,3.

בין הסוגים הקיימים של ננו חיסונים, הרכבות חלבון מעוצב באופן רציונלי לאפשר את העיצוב והפיתוח של מועמדים חיסונים שיכולים להציג עותקים מרובים של האנטיגן פוטנציאלי בצורה מקורית של1,4 ,5,6. דוגמה אחת של הרכבות חלבון אלה הם חלקיקי חלבון הרכבה עצמית (סאפאנס)7. הסימות מבוססים על הסליל המתפתל בתחומים והם מבוטאים באופן מסורתי ב- es, coli קולי8. Sapn מועמדים חיסונים פותחו עבור מגוון רחב של מחלות כגון מלריה, סארס, שפעת, טוקסופלזמוזיס, ו-HIV-19,10,11,12,13 , מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , 19. העיצוב של כל מועמד sapn הוא ספציפי לפתוגן של עניין, עם זאת, הייצור, טיהור, וטכניקות קיפול מחדש הם בדרך כלל החלים באופן כללי.

אחד האינטרסים הנוכחיים שלנו הוא חיסון אפקטיבי-1 לאיידס. בשנת RV144 – הניסוי הקליני היחיד בשלב III של חיסון HIV-1 שהפגין יעילות צנועה – הסיכון הקטן לזיהום היה מתואם עם נוגדנים igg לולאה V1V2 של חלבון המעטפה20,21. הצגת הtrimeric הטבעית של אזור זה נחשבת לחשובה לאימונוגלוגניות המגנה22. כדי להציג את הלולאה V1V2 בצורה הקרובה ביותר ליצירת מקורי כמו האפשרי, פיתחנו הוכחה של עיקרון המועמד SAPN החיסון כי הכיל את ה-HIV-1 המעטפה שלאחר היתוך שישה הסליל (SHB) להציג את הלולאה V1V2 לתוך החיבור הנכון9 . מועמד זה זוהה על ידי נוגדנים מונובטיים ידוע לחלבון מעטפות HIV-1. עכברים החיסונים עם V1V2-SHB-SAPN העלה V1V2 נוגדנים ספציפיים, כי, החשוב ביותר, כרוך gp70 V1V2, הקונפוראיות הנכונה9. הליבה SHB-SAPN יכול להיות פונקציות אחרות מעבר לתפקיד כנשא עבור הלולאה HIV-1 V1V2. כאן נתאר מתודולוגיה מפורטת לביטוי, טיהור, קיפול מחדש ואימות של ליבת SHB-SAPN. בחירת הרצף, עיצוב ננו-חלקיק, שיבוט מולקולרי, וטרנספורמציה של E. coli תוארו בעבר9.

Protocol

1. ביטוי של חלבון SHB-SAPN ב E. coli BL21 (DE3)

  1. מערבבים 95 מ ל של רכיב A ו-5 מ ל של רכיב B של המדיה ב 2 L סטרילי זכוכית סטרילית בקבוקון לפי הוראות היצרן (לראות את הטבלה של חומרים). הוסף אמפיצילין לריכוז הסופי של 100 μg/mL.
  2. האיחסן את התקשורת עם E. coli מתרבות מלאי שהוקמה בעבר הגליצרול. תרבית התרבות ב 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סיבובים לדקה (rpm) עבור 48 h.
    הערה: המניה E. coli BL21 (DE3) הכילה את הביטוי עמיד אמפיצילין וקטור23 עם הגן SHB-sapn. למרות הפרוטוקול הכללי של התקשורת ממליץ על 24 h של דגירה ב 37 ° c, 48 h של דגירה ב 30 ° c נתן תשואה גבוהה יותר עבור SHB-SAPN.
  3. להעביר את התרבות כדי 2 50 mL שפופרות חרוט. צנטריפוגה את הצינורות ב 4,000 x g עבור 10 דקות עם רוטור זווית קבועה ב 4 ° c. הסר את supernatant ולשמור את הגלולה כדי לקצור את התאים.
    הערה: ניתן לעבד את הגלולה הסלולרית מיד או לקפוא ב-80 ° c עד השימוש.

2. הליזה של E. coli BL21 (DE3) על ידי sonication

הערה: השתמש בכלי חרס שאינם פירוגניים וכלי זכוכית אפוי ב-250 ° c עבור לפחות 30 דקות. טריס (2-carboxyethyl) פוספאפין (TCEP) כסוכן מקטין שובר את איגרות החוב הדיסולניות בתוך ובין חלבונים. TCEP נחוץ במאגרים במהלך פרוטוקול זה אם האנטיגן המוצג מכיל אגרות חוב של S-S. עבור SHB-SAPN ליבה בלבד, הנוכחות של TCEP במאגרים אינו חיוני.

  1. הכנת מאגר בחינם של סרפידול (8 M שתנן, 50 mm נתרן פוספט מונוbasic, 20 מ"מ בסיס Tris, 5 מ"מ tcep) pH 8.0 (מותאם עם 5 N naoh) ולסנן אותו באמצעות 0.22 יקרומטר ואקום בקבוק היחידה סינון.
  2. השהה מחדש את התאים הפלטיים (משלב 1.3) עם 40 mL של מאגר ללא שימוש במאגר של 1 50 mL. Sonicate את התאים מחדש עם בדיקה על הקרח עבור 5 דקות (4 s של sonication, 6 s של מנוחה) עם פלט sonication של 150 W.
  3. צנטריפוגה את ליפוסט הסלולר (40 mL) ב 29,000 x g ב 4 ° צ' עבור 25 דקות ברוטור זווית קבועה כדי ליצור supernatant מובהר. העבר את supernatant ל 150 mL סטרילי בקבוקון ולמחוק את הגלולה. מדלל את הסופרנטאנט ל-100 mL באמצעות המאגר הנטול הסרמדול (מאוחר יותר בפרוטוקול המכונה "מדגם").
    הערה: שלב דילול זה דרוש כדי למנוע מהלחץ של מערכת FPLC להפוך לגבוה מדי במהלך טעינת ליפוסט בעמודה.

3. טיהור חלבון באמצעות עמוד שלו

הערה: פרוטוקול זה בוצע באמצעות מכשיר FPLC, אך ניתן להתאים אותו לזרימת הכבידה.

  1. הכן את המאגרים הבאים וסנן אותם באמצעות יחידת סינון ואקום מסוג 0.22 יקרומטר: (i) סרפידול-ללא מאגר חינם "מאגר a" (8 M שתנן, 50 mm נתרן פוספט מונוbasic, 20 מ"מ בסיס טריס, 5 מ"מ tcep) pH 8.0; (ii) 500 מ"מ באגירה מסוג" מאגר B "(8 M שתנן, 50 mM נתרן פוספט חד-בסיסי, 20 מ"מ בסיס טריס, 5 מ"מ TCEP, 500 מ"מ) pH 8.0; ו (iii) שטיפת אלכוהול איזופרופיל (20 מ"מ טריס, 60% איזופנול) pH 8.0.
    הערה: pH עבור כל מאגר הותאם עם 5 N NaOH.
  2. . הייתי מבין את הטור שלו
    הערה: עבור ייצור בקנה מידה מעבדה, פרוטוקול זה משתמש ב-5 mL בעמודה מלאה, אך ניתן להשתמש בכל עמודה גדולה יותר בגודל.
    1. פתח את תוכנת FPLC ולחץ על האפשרות שיטה חדשה . הוא ייפתח באופן מיידי בתפריט ' הגדרות שיטה '. תחת התפריט הנפתח עבור מיקום העמודה בחר ביציאה C1 3.
    2. בתפריט המוצג באמצעות הטכניקה הנפתחת בחר באהדה. בתפריט הנפתח סוג עמודה בחר באחרים, הידרצועה HP, 5 מ ל. אמצעי האחסון של העמודה ותיבות הלחץ נקבעו באופן אוטומטי לערכים המתאימים.
    3. לחץ על לחצן החלוקה לרמות של פעולת השירות . גרור את הלחצנים הבאים מהתפריט המוקפץ של ספריית הפאזה : משקל, יישום לדוגמה, שטיפת עמודותוהימנעות לצד החץ באותו סדר מדויק. סגור את התפריט ' ספריית פאזה '.
    4. לחץ על כפתור equilibration . הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" (4%), "מאגר סופי B" (4%), ו-"נפח (CV)" 5.
    5. לחץ על תיבת היישום לדוגמה . בתיבת הטעינה לדוגמה, לחץ על לחצן האפשרויות עבור דגימת הכנסה בעמודה עם משאבת דגימה. ודא שהתיבה הסמוכה לקצב הזרימה מהגדרות השיטה מסומנת בזריקה לדוגמה עם התיבה משאבת מערכת. לצד תיבת העוצמה שבצד השמאלי של המסך, שנה את הערך ל- 20 mL.
    6. לחץ על כפתור שטיפת העמודות . הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" (4%), "מאגר סופי B" (4%), ו-"נפח (CV)" 5. לצד ערכת איסוף השברים, בטל את הלחיצה על התיבה הפוך לזמינה.
    7. לחץ על כפתור להתחמק . הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" 0%, "מאגר סופי B" 100% ו "נפח (CV)" 5. ליד ערכת אוסף השברים לחץ על התיבה אפשר . בטל את הלחיצה על האפשרות השתמש בגודל השבר מהגדרות שיטה והתאם גודל שבר ל-4 mL בתיבת המילוי שמתחת.
    8. לחץ על לחצן שמור בשם בחלק העליון של התוכנה. נקוב בשמו של הקובץ "שליציה".
    9. חבר 5 mL לארוז מראש את העמודה שלו ליציאת העמודה המתאימה 3 ב-FPLC. שניהם משאבת A ו-משאבה צנרת B, כמו גם אבובים משאבת לדוגמה צריך להיות ממוקם לתוך 0.22 יקרומטר מסוננים מים מסונן. . תריץ את תוכנית האקוויליציה
    10. מניחים גם משאבה A ו-B משאבה, כמו גם לדוגמה אבובים משאבה לתוך מאגר הסרדידול חינם (מאגר A) ולהפעיל את פרוטוקול equilibration שוב.
  3. אגד את המדגם לעמודה וטהר את החלבון.
    1. פתח את תוכנת FPLC ולחץ על האפשרות שיטה חדשה . הוא ייפתח באופן מיידי בתפריט ' הגדרות שיטה '. תחת התפריט הנפתח עבור מיקום עמודה בחר את יציאת c1 3. בתפריט המוצג באמצעות הטכניקה הנפתחת בחר באהדה. בתפריט הנפתח סוג עמודה בחר באחרים, הידרצועה HP, 5 מ ל. אמצעי האחסון של העמודה ותיבות הלחץ יהיו באופן אוטומטי מוגדרים לערכים המתאימים.
    2. לחץ על לחצן החלוקה לרמות של פעולת השירות . גרור את הלחצנים מהתפריט המוקפץ של הספריה ' שלב ': חישוב, יישום לדוגמה, שטיפת עמודות (כביסה 1), שטיפת טור (כביסה 2), שטיפת עמודות (כביסה 3) והימנעות לצד החץ באותו סדר מדויק סגור את התפריט ' ספריית פאזה '.
    3. לחץ על לחצן Equilibration . הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" 4%, "מאגר סופי B" 4% ו "נפח (CV)" 5.
    4. לחץ על תיבת היישום לדוגמה . בתיבת הטעינה לדוגמה, לחץ על לחצן האפשרויות עבורדגימת עמודות בעמודה עם משאבת דגימה. ודא שהתיבה הסמוכה לקצב הזרימה מהגדרות השיטה מסומנת בזריקה לדוגמה עם התיבה משאבת מערכת.
    5. לצד תיבת העוצמה שבצד השמאלי של המסך, שנה את הערך ל-100 mL. לצד ערכת אוסף השברים, לחץ על לחצן הפעל. בטל את הלחיצה על האפשרות השתמש בגודל השבר מתוך הגדרות שיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל-4 mL.
    6. לחץ על לחצן שטיפת הטור הראשון (כביסה 1). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" 4%, "מאגר סופי B" 4% ו "נפח (CV)" 10. לצד ערכת אוסף השברים, לחץ על התיבה הפוך לזמינה. בטל את הלחיצה על גודל השבר מהגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל-4 mL.
    7. לחץ על לחצן שטיפת הטור השני (כביסה 2). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" 0%, "מאגר סופי B" 0% ו-"נפח (CV)" 5. לצד ערכת אוסף השברים, לחץ על התיבה הפוך לזמינה. בטל את הלחיצה על גודל השבר מהגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל-4 mL.
    8. לחץ על לחצן שטיפת העמודה השלישית (לשטוף 3). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר התחלתי B" 0%, "מאגר סופי B" 0% ו-"נפח (CV)" 5. לצד ערכת אוסף השברים לחץ על הלחצן הפוך לזמין. בטל את הלחיצה על האפשרות השתמש בגודל השבר מתוך הגדרות שיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל-4 mL.
    9. לחץ על כפתור להתחמק . בטבלה לחץ לחיצה ימנית על המידע המפורט, בתפריט שעולה, לחץ על מחק שלב. גרור את לחצן מעבר הצבע isocratic אל הטבלה פעמיים, כך שקיימים שני ערכים.
    10. הערך עבור הערך הראשון אמור לקרוא "מאגר התחלתי B" 30%, "מאגר סופי B" 30% ו "נפח (CV)" 10. הערך עבור הערך השני אמור לקרוא "המאגר ההתחלתי B" 100%, "המאגר הסופי B" 100% ו "נפח (CV)" 10. לצד ערכת אוסף השברים, לחץ על לחצן הפעל. לחץ על התיבה הסמוכה לשימוש בגודל השבר מהגדרות השיטה.
    11. לחץ על לחצן שמור בשם בחלק העליון של התוכנה. שם הקובץ "טיהור". משאבה צינורות של FPLC צריך להיות ממוקם לתוך מאגר לשטוף את הסרפידול חינם בזמן משאבה ב אבובים צריך להיות ממוקם לתוך מאגר מ500 מ"מ. משאבת לדוגמה אבובים צריך להיות ממוקם לתוך 100 mL דגימת.
    12. הפעל את התוכנית "טיהור" והמתן למועד שבו יש צורך ב-60% איזופנול (לשטוף 2). השהה את התוכנית, להעביר משאבה אבובים מתוך שטיפה של הסרדידול שוטף לתוך הכביסה 60% איזופנול. הפעל מחדש את התוכנית.
    13. ברגע שהצעד האיזופרופיל יושלם, השהה שוב את התוכנית והזז את המשאבה בחזרה לתוך מאגר הכביסה ללא הסרדידול. הפעל מחדש את תוכנית הטיהור (שאר ההפעלה היא אוטומטית).

4. הערכת טוהר וזיהוי חלבונים באמצעות SDS-עמוד

  1. לשלב את כל השברים המתאימים (i) זרימה-דרך (התאים האלה כי לא לאגד את הטור שלו), (ii) לשטוף 1, (iii) לשטוף 3 (60% אלכוהול איזופנול), ו (iv) לשטוף 3 בנפרד 50 mL שפופרות חרוט. אין לשלב את שני השברים mL משלבי הימנעות.
  2. מערבבים 15 μL מכל אחד מהשברים במאגר וכל השברים משלבי הימנעות עם מאגר לדוגמה 2x Laemmli בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL ולאחר מכן ב 95 ° c עבור 10 דקות.
  3. בעוד החלבון מתכתים, להגדיר את ג'ל פועל מכשיר עם 3 כתם חינם 4 – 20% הרבה ג'ל פוליאקרילמיד ב-1x טריס-גליצין SDS-עמוד פועל מאגר.
  4. טען 8 μL של סמן משקל מולקולרי לבאר הראשונה ו 30 μL של המדגם לאחר בארות אחרות של ג'ל. הפעל את הג ב 200 V עד שחזית הצבע תפגע בתחתית הג (כ -30 דקות). להסיר את ג'לים מן המנגנון ולשטוף בקצרה עם מים מוכי. התמונה ג'ל מיד באמצעות מערכת הדמיה ללא כתם.
  5. זהה את השברים המכילים להקות חלבון בגודל הנכון (18.07 kDa). . שמים את כל השברים האלה

5. זיהוי חלבונים באבן חשופה מערבית

  1. הפעל כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי שלו (אנטי 6x HisTag) ו נוגדן ספציפי SHB (167-D-IV) כדי לזהות את החלבון באורך מלא מטוהרים. הנוגדן האנטי-6x מזהה את המסוף N של החלבון ואת הנוגדן 167-D-IV מזהה את הטרמינוס C להפגין את נוכחותו של חלבון באורך מלא.
  2. לקבוע את ריכוז החלבון של (i) זרימה-through, (ii) לשטוף 1, (iii) לשטוף 2 (60% אלכוהול איזופנול), (iv) לשטוף את 3, ואת כל השברים מתוך הצעדים להתחמק עם מכשיר ספקטרומטר בספיגת של 280 ננומטר. ליצור דילול המכילים 100 ng של חלבון ב 15 μL של מאגר בחינם של שנדלידול עבור כל אחת מקבוצות אלה.
  3. הוסף 15 μL של מאגר המדגם של 2x Laemmli לכל 15 μL של הדגימות והספרות כמו בשלב 4.1. לאחר הרפתקאות הושלמה ספין למטה את הצינורות כדי להבטיח את כל החלבון ניתן להעביר.
  4. הטען דגימות ואת הסמן מראש מוכתם לתוך כתם חינם 4 – 20% אלקטרופורזה ג'ל. הפעל את האלקטרופורזה ב 200 V עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג.
  5. בעוד ג'ל פועל, לעשות 1 L של TBS-T (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ הנאל, ו 0.1% רצף 20) ו 200 mL של 5% לא שומן חלב ב-TBS-T.
  6. השתמש במערכת העברת כתמי אבן מערבית כדי להעביר חלבון אל קרום ניטרוצלולוזה. השתמש במחסנית העברה שהרכבה מראש והשם את הג'ל עליו. הגדר את המערכת לפעול בשעה 25 וולט עבור 7 דקות. בדוק אם הנוכחות של סמן מוכתם מראש על קרום הניטרוצלולוזה מצביע על העברה מלאה.
    הערה: כל השלבים הבאים מבוצעים על שייקר מסלולית להגדיר ב 100 rpm בטמפרטורת החדר (RT).
  7. לאחר השלמת ההעברה, לשטוף את הכלים פעמיים עם TBS-T עבור 10 דקות כל אחד.
  8. לחסום את ממברנות ניטרוצלולוזה (כתם) עם 5% לא שומן חלב ב-TBS-t עבור לפחות 1 h. לשטוף את הכלים פעמיים עם tbs-t עבור 10 דקות כל אחד.
  9. לדלל את העיקרי 167-D-IV ואנטי-6x נוגדנים HisTag 1 מ"ג/mL ב-TBS-T (מלאי Ab). לדלל את המניה Abs של 167-D-IV 10,000-קיפול ו-6x HisTag 5,000-קיפול על-ידי הוספת 2 μL של המניה 167-D-IV ו-4 μL של המניה anti-6x נוגדנים לשני צינורות שונים המכילים 20 מ ל של TBS-T. הוסף את סך 20 מ"ל נפח של נוגדנים ראשוני, אחד לכל אבן בלוק, ו-דגירה הכלים עבור 1 h. לשטוף את הכלים פעמיים עם TBS-T עבור 10 דקות.
  10. לדלל 4 μL של 1 מ"ג/mL של העכבר אנטי האדם נוגדן משני מצועם באמצעות פוספספטאז אלקליין ב 20 מ ל של TBS-T (1:5000 דילול). לדלל 4 μL של 1 מ"ג/מ ל של עז נגד העכבר משנית נוגדן מצועם עם פוספספטאז אלקליין ב 20 מ ל של TBS-T (1:5000 דילול). הוסף נוגדנים משניים כדי blots המתאימים.
    הערה: הנוגדן המשני האנטי-אנושי נקשר ל167-D והאנטי-עכבר נקשר להאייל האנטי-6x. רוחצים את הגושים פעמיים עם TBS-T עבור 10 דקות.
  11. להוסיף מספיק BCIP/NBT המצע פוספאטאז אלקליין כדי לכסות את blots. פתח את הגושים במשך כ -10 דקות עד שלהקות מופיעות. לשטוף הכלים עם מי ברז קר ולתת להם להתייבש לפני סריקת עם סורק שטוף.

6. קיפול מחדש של SHB-SAPN

  1. הוסף את החלבון במאגר (10 \ u201220 mL כולל) עד 10 משקל מולקולרי kDa לגזור את הקלטת דיאליזה dialyze זה ל 8 שתנן M, 20 mM טריס, 5% גליצרול, 5 מ"מ TCEP pH 8.5 ב RT (18 \ u201226 ° c) לילה.
  2. באיטיות את האוריאה מחוץ למדגם על ידי הפחתת הריכוז אוריאה ב מאגר דיאליזה מבחינת הסדר על ידי 2 M כל 2 h. בריכוז אוריאה של 2 מ ', הזיזו את מנגנון הדיאליזה ל -4 ° צ' (אל תשתמשו ב-TCEP במאגר הדיאליזה משלב זה). לסיים את קיפול מחדש על ידי dialyzing את המדגם לתוך 120 mM אוריאה, 20 mM טריס, 5% גליצרול, pH 8.5 ב 4 ° צ' לילה.
  3. הסר את החלבון המקופל (SHB-SAPN) מתוך קלטת הדיאליזה. לסנן את shb-sapn באמצעות 0.22 יקרומטר polyvinylidene פלואוריד (pvdf) מזרק filer. Aliquot SHB-SAPN לתוך צינורות סטרילי להקפיא אותם ב-80 ° c, עוזב לפחות 100 μL ב RT עבור ניתוחים הבאים.

7. ואלידציה של חלקיקים לפי גודל ומראה

  1. פיזור אור דינאמי (DLS)
    1. למדוד את גודל החלקיקים ממוצע של SHB-SAPN על ידי הפרמטרים הבאים: לבחור חלבון כמו החומר, ליצור מאגר מורכב עבור 120 mM אוריאה, 20 מ"מ Tris, 5% גליצרול 25 ° צ' לטמפרטורה, בחר כלים חד פעמיות לניתוח, בחר אוטומטית מדידה, מוגדר עבור 5 ריצות.
    2. הוסף 45 μL של SHB-SAPN קובט חד פעמיות ולהפעיל את התוכנה על ידי לחיצה על החץ הירוק. בחר את עוצמת הקול באחוזים עבור הבדיקה.
  2. ננו-חלקיק ניתוח מעקב (נ. ת. ע)
    1. דלל את המדגם ב-1:20 במאגר הקיפול החדש. הפוך 10 מ ל של דגימה מדוללת.
    2. שימוש 3 מ ל מזרקים, לשטוף את המכשיר נ. ת. ע עם מאגר קיפול מחדש לטעון על 1.5 mL של מדגם כדי להאביק את המכשיר. השתמש בשאר המדגם לניתוח.
    3. צור SOP חדש בתוכנה נ. ת. ע על ידי לחיצה על הכרטיסייה SOP . תחת הלשונית לשנות את מספר לוכדת ל 3 ולשנות את זמן הלכידה ל 30 s. לחצו על כפתור פוקוס אוטומטי בצד שמאל של המסך כדי להביא את המדגם לפוקוס. השתמש בכפתור המיקוד הידני בצד המכונה כדי לכוונן את הפוקוס.
    4. הפעל את ה-SOP שנוצר, כאשר המערכת מבקשת לטעון נפח קטן של דגימה באמצעות המזרק. לאחר שהמערכת לקחה את כל הלכידות זה יהיה באופן אוטומטי להעלות את המסך ניתוח. החלק את סרגל מגבלת הזיהוי כך שכל החלקיקים האמיתיים יסומנו על-ידי צלבים אדומים. לחץ על לחצן ניתוח ההפעלה והניתוח יתחיל באופן אוטומטי.
  3. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM)
    1. הפרשות זוהר formvar/פחמן 400 שינוי נחושת TEM סרטי תמיכה.
    2. הוסף 3 μL של מדגם ב 0.075 mg/mL ריכוז לרשת עבור 30 s. הפתיל מחוץ לנוזל באמצעות נייר סינון.
    3. שטוף את הרשת עם 3 μL של מים מוכי שלוש פעמים, בכל פעם מאונן את המים עם נייר סינון.
    4. הוסף 3 μL של 0.5% uranyl אצטט לסרט התמיכה ולאפשר לו לשבת 30 s. Wick את רוב אצטט uranyl אבל להשאיר סרט דק על פני השטח. הניחו לדגימות להתייבש לפני ההדמיה במיקרוסקופ האלקטרוני של השידור.
    5. דגימות תמונה ב 80 kV על TEM.

8. קביעת רמות אנדוטוקסין בדגימות באמצעות ליטויה קינטי (לל א) שיטת ליפוסט

  1. הסר את הערכה ודגימות מן המקרר ולאפשר שיווי משקל ל RT.
  2. כדי לבצע את הכדאיות הזו, קורא צלחת עם בלוק חום והיכולת לקרוא את הדגימות עבור 40 קריאות באורך גל של 405 nm ב 37 ° c נדרש. כתוב תבנית תוכנית כך הבארות לקרוא כל 150 s כדי לזהות את נקודת זמן התחלתה (OD גדל על ידי 0.2 בהשוואה לקריאה הראשונה).
  3. לדלל את המדגם לריכוז מינון חיסונים ב-PBS.
    הערה: ה-pH של המאגר המתקפל החדש נמצא מחוץ לטווח שיטת ה-לל. דילול המדגם ב-PBS יהיה להגדיר את ה-pH לטווח המקובל.
  4. השהה מחדש את שליטה אנדוטוקסין בנפח המתאים של מי-לל נטול האנדוטוקסין כפי שנקבע על ידי תעודת הניתוח כדי ליצור 50 EU/mL. מערבולת נמרצות את המבחנה עבור 15 דקות כדי להבטיח השעיה מלאה של האנדוטוקסין.
  5. צור את עקומת התקן אנדוטוקסין על-ידי יצירת דילול סדרתי 10 מקפלים בבקבוקונים זכוכית בטווח של 50 האיחוד האירופי ל 0.005 EU/mL. עבור כל דילול, להוסיף 0.1 mL של דילול הקודם ל 0.9 mL של מים לל. מערבולת במרץ לאחר שילוב עבור 1 דקות.
  6. הוסף מדלל עקום סטנדרטי ו SHB-SAPN דגימות בשכפול לצלחת 96-באר. השתמש במים לל כפקד שלילי גם בשכפול. לקדם את הצלחת ב 37 ° c עבור 15 דקות.
  7. לקראת סוף הדגירה, השהה מחדש את המבחנה מגיב עם 2.6 mL של מים לל. ערבבו בעדינות את התוכן בעזרת פיפטה סרוולוגית.
  8. הוסף 100 μL של השיטת מגיב לכל טוב של הצלחת 96-באר. הזז במהירות את הצלחת לקורא לוחית הרישוי והפעל את תבנית התוכנית הכתובה בשלב 8.2.
  9. לאחר השלמת התוכנית, צור עקומה סטנדרטית באמצעות ערך יומן הרישום של הפקדים לעומת ערך יומן הרישום של זמן התחלתה. השתמש בנוסחה שנוצרת מעקומה זו כדי לחשב את הריכוז האנדוטוקסין בדגימות.

Representative Results

התאספו במלואו SHB-SAPN המוצג כאן הוא בנוי על רצפי חלבון (איור 1A) כי הם ניבאו לקפל לתוך חלקיק המכיל 60 עותקים של המונומר (איור 1a). איור 2 מספק חלוקה לרמות של השיטה לייצור, טיהור וזיהוי של הליבה shb-sapn. E. coli מתוך מלאי גליצרול שהכיל וקטור ביטוי Ppep-T עם רצף גנים של הליבה shb-sapn המושרה ב BL21 (DE3) E. coli. התאים החיידקיים גדלו בהצלחה והיו תחת הרפתקאות והפחתת תנאים.

סה כ תא ליפוסט היה שימש כדי לטהר shb-סאקpn ונומרים על ידי fplc באמצעות Ni2 + עמודה (איור 3a). ה-FPLC chromatograph ממחיש כי החלבון משתמט הן ב-150 mM ו 500 מילימטר מהסרפידול (איור 3A). כרומוטוגרמה מראה גם שתי פסגות אחרות ב 185 mL ו 210 mL הנפח הכולל המתאים לשטוף את האיזופנול ואת שטיפת הסראזול, בהתאמה. השברים וטוהר החלבון הרקומביננטי זוהו על ידי SDS מעבר הצבע-ג'לים עמוד (איור 3B). חלבון הריבית ממוקם בעיקר בשברים 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL נפח כולל). שברים אלה שולבו עבור ניתוחים נוספים. כתם מערבי עם נוגדן אנטי שלו (N-מסוף) ו 167-D-IV נוגדן (C-טרמינוס) ציין כי שברים במאגר היו אכן חלבון הריבית (איור 4A, B). הכלים אלה הפגינו גם נוכחות של shb-sapn מלוטיימרים. שטיפות מוקדם יותר שברים להתחמק נטו להכיל ריכוז גבוה יותר של חלבון multimerized ולכן נשלל.

הדגימות שהכילו מונמרים חלבון של עניין היו מקופלים ל SHB-SAPN התאספו במלואו על ידי דיאליזה. התפלגות גודל החלקיקים נקבע על ידי DLS וניתוח מעקב ננו-חלקיק (איור 5a, B). DLS מזוהה חלקיקים עם קוטר Z ממוצע הידרודינמי של 67 ננומטר בעוד מערכת נ. ת. ע נמדד בגודל ממוצע של 81 ננומטר. ההבדלים גודל קל היו בשל טכניקות שינוי החלקיקים, אולם הגודל משני הניתוחים היו בטווח הצפוי של 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-סאפאן היו דמיינו על ידי TEM ואת התמונות הראו חלקיקים בודדים בנוי היטב עם התפלגות גודל שהתקבלו שתי טכניקות שינוי החלקיקים (איור 5C).

במהלך הטיהור של החלבון, העמודה נשטפה עם איזופנול כדי להקטין את זיהום LPS במוצר הסופי SHB-SAPN. כדי לוודא אם רמת האנדוטוקסין הייתה מקובלת על החיסון, ריכוז LPS בדגימות SHB-SAPN מטוהרים עם או בלי הצעד האיזופנול של שטיפת האלכוהול נקבע על ידי שיטת לל קינטית. התוצאות הראו כי השטיפה האיזופנול הצטמצמה את רמות האנדוטוקסין מ> 0.25 האיחוד האירופי/μg כדי 0.010 האיחוד האירופי/μg של SHB-SAPN חלבון (שולחן 1).

Figure 1
איור 1: רצף החלבון SHB-SAPN ומבנה. (א) ברצף חומצת האמינו של מונמר SHB-sapn. (ב) מודל המחשב של המבנה של הליבה shb-sapn התאספו במלואו המורכב של 60 monomers חלבון. ערכת צבע עבור רצפי חומצות אמינו: אפור = הצבי; ירוק = פנטמר; כחול כהה = דה נובו תוכנן trimer; כחול בהיר = צרור שישה סליל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרשים זרימה של ה פרוטוקול לייצור SHB-SAPN. ערכת צבעים: שחור = ביטוי של מונומר חלבון ב E. coli; אפור כהה = טיהור מונומר; אפור בינוני = מזהה מונומר; אפור בהיר = קיפול מחדש ואפיון; לבן = התאספו במלואו מוצר SHB-SAPN. בשלבים המסומנים באפור כהה ובינוני, החלבון הוא תחת הרפתקאות והפחתת תנאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: טיהור חלבון של SHB-המונמרים. (A) chromatograph מתוך טיהור fplc. הקו הירוק מעל כרומאטוגרם מציין את שלבי הטיהור. הקו הכחול ב chromatogram מייצג את הצפיפות האופטית של השברים ב 280 ננומטר גל. הקו השחור מראה איזה אחוז של מאגר B (8 M אוריאה, 20 מ"מ Tris, 50 mM נתרן פוספט מונוbasic, 5 מ"מ TCEP, 500 מ"מ הסרפידול, pH 8.5) ששימש בכל שלב של הטיהור. (ב) sds-דפי העמוד של שברים ממאגר מן הליפוסט (L), זרימה דרך (FT), שטיפת הראשון (W1), שטיפת אלכוהול איזופנול (W2), שטיפת שלישי (W3), ושברים בודדים מתוך הסרפירון 150 מ"מ (E150) ו 500 מילימטר (E500) שלבים של טיהור. סמנים מולקולריים בנתיב הראשון (M) מזהים להקות בין 10 ל-250 kDa. חלבון היעד מצוין על-ידי חץ שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי החלבון באבן החשופה המערבית. כל המסלולים עמוסים 100 ng של חלבון. (א) תוצאות של כתם מערבי עם הצבי האנטי-6x. (ב) תוצאות של אבן חשופה מערבית עם נוגדן 167-D-IV HIV-1. הנתיבים מסומנים כ-M = סמן משקל מולקולרי; 1 = ליפוסט; 2 = לזרום; 3 = השטיפה הראשונה; 4 = שטיפת איזופנול (כביסה שנייה); 5 = כביסה שלישית; 6 = שברים אמצעי אחסון במאגר 56 \ u201261 (הראשון בשיא הראש), 7 = פלגים נפח במאגר 62 \ u201267 (בין שתי הפסגות), 8 = שברי נפח במאגר 68 \ u201278 (השיא השני הימנעות). חלבון היעד עם גודל הלהקה צפוי של 18.07 kDa כמו monomeric SHB-SAPN להקה מצוין על ידי חץ שחור. פסים נוספים בנתיבים 7 ו 8 הם dimers טרימרס, ו שעוני של SHB-SAPN (החץ האדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אפיון ה-SHB-SAPN המקופל. (א). התפלגות גודל החלקיקים כפי שנקבע על ידי DLS. (ב) גודל החלקיקים כפי שנקבע על ידי ננו-חלקיק מעקב (מערכת). (ג) ויזואליזציה של חלקיקי SHB-sapn על ידי TEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמה אנדוטוקסין (האיחוד האירופי/mL) אנדוטוקסין (האיחוד האירופי/μg של חלבון)
SAPN עם שטיפת אלכוהול איזופרופיל 2.02 0.01
SAPN ללא שטיפת אלכוהול איזופרופיל > 50 > 0.25%
בקרה שלילית להלן רמת זיהוי N/A

שולחן 1: רמות אנדוטוקסין של SHB-סאפאנס מחדש. רמות אנדוטוקסין בדגימות SHB-SAPN מטוהרים עם או בלי שטיפת איזופנול הציג הן כיחידות אנדוטוקסין/mL ויחידות אנדוטוקסין/μg של חלבון SHB-SAPN.

Discussion

ננוטכנולוגיה מספקת יתרונות ופתרונות רבים עבור פיתוח חיסונים ביחידת המשנה. ננו חיסונים יכולים שוב ושוב להציג אנטיגנים כמו חלקיקים למערכת החיסונית מארח הגדלת החיסוני26. אמנם ישנם סוגים רבים ושונים של ננו חיסונים, אנו מאמינים כי אלה מורכב של החלבון דה נובו מעוצב נראה הגישה החזקה ביותר עבור פיתוח חיסונים1. הם יכולים להיות מהונדסים ללא כל רצף הומולוגיה לחלבונים המארחים ולהציג את האנטיגן של עניין קרוב מקורי כמו היווצרות תוך מתן עלות ייצור נמוכה ותשואות מוצר גבוה. דוגמה מעולה לגישה זו היא טכנולוגיית SAPN, אשר הגשתי חיסונים נגד מחלות זיהומיות מרובות7. מטפל בקשיים בפיתוח החיסון HIV-1, יש לנו מהונדסים ייחודי shb-sapn ליבה כדי להציג ביעילות את אנטיגן V1V2 בצורה מקורית trimeric קונפורמציה9. מטרות חיסון רבות, במיוחד עבור מחלות ויראליות, קיימות כטרימרס27. תופעה זו מציינת כי העיצוב שלנו SAPN יש השלכות רחבות להתפתחות של חיסונים תת-יחידתי.

בשיטה זו, אנו מדגימים כיצד לייצר SHB-סאפאן במערכת ביטוי E. coli . הביעו תשואה גבוהה של חלבון (כ -6 מ"ג/100 מ ל של התרבות). החלבון הכיל 10 histidines והיה מטוהר בקלות באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת מתוך קיבוע עם Ni2 + טור. האורך הזה של התגית שלו נמצא האופטימלי לתשואה החלבון הגבוהה ביותר. חלבון מטוהר הכיל את האורך המלא של החלבון מעוצב כפי שצוין על ידי הנוכחות של מסוף N-טרמינל ו C מסוף חוזר. אנו מנוצלים טכניקות מקובלות נרחב ואופטימיזציה אותם לביטוי, ייצור, ואפיון של הליבה SHB-SAPN. חוסר הייצור של חלבון באורך מלא במהלך הפיתוח של SAPN המכיל אפירופה חלבון חדש יכול להצביע על בעיית ביטוי של הגן בתא המארח. אם זה קורה, הגנים ומערכת הביטויים חייבים להיות מחדש ולהתאים לפרוטוקול המתואר. השינוי של sonication זמן או אינטנסיביות עשוי גם להגביר את הריכוז של חלבון באורך מלא החזוי.

החלקיקים המקופלים היו בטווח הגודל הצפוי (20 עד 100 ננומטר)8,24,25 כפי שנקבע על-ידי ניתוח DLS ו-ננו-חלקיק. תוצאות אלה אושרו עוד יותר באמצעות TEM. אם קיימות בעיות בשלב זה, היא בדרך כלל נובעת מבעיה בחוזק החומציות או היונית של המאגר המתקפל מחדש. כאשר חלקיקים גדולים מזוהים בטכניקות שינוי גודל החלקיקים, הוא מציין צבירה, אשר ניתן להימנע על ידי הגדלת ה-pH של מאגר מתקפל מחדש. אם החלקיקים אינם מזוהים על ידי DLS, לאמת את ריכוז החלבון ולבדוק את ה-pH של המאגר. ריכוז החלבון הסופי עבור DLS צריך להיות לפחות 100 μg/mL. אם הריכוז הוא לא הבעיה, זה מעיד על שפע של חלקיקים קטנים, בנוי לחלוטין, אשר ריכוז ניתן לצמצם על ידי הפחתת ה-pH. לחילופין, ריכוז נתרן כלוריד יכול להיות מותאם לטווח האופטימלי כדי למזער את הנוכחות של חלקיקים עם גודל לא רצוי.

בסופו של דבר, באמצעות צעד שטיפת איזופנול במהלך טיהור היינו מסוגלים להפחית LPS מזהם מן המארח E. coli כדי 0.01 האיחוד האירופי/ΜG של sapn שהוא מתחת מינהל המזון והתרופות (FDA) של 5 האיחוד האירופי/ק ג של משקל הגוף עבור מוצרי ההזרקה 28. רמה זו ניתן לצמצם עוד יותר באמצעות עמודת החליפין אניון המכונה גם עמודה Q. אם רמות גבוהות של אנדוטוקסין עדיין קיימות, בדוק את כל החומרים ששימשו להכנת המאגר. זכור להשתמש רק כלי זכוכית depyrogenated ו אנדוטוקסין חינם פלסטלינה בשיטה זו.

תוצאות אלה מצביעות על כך שפיתחנו בהצלחה שיטה כדי לייצר את הליבה SHB-SAPN שניתן להשתמש בו עבור לימודי חיסונים פרה-קליניים. שיטה זו עם שינויים קלים בלבד, אם בכלל, ניתן להחיל על טיהור של SHB-סאפאן כאשר אנטיגן של עניין נוסף. שימוש בשיטה זו כנקודת התחלה אחד השינויים העיקריים הוא בשלב הימנעות. חלבונים שונים בריכוזים שונים של ריכוזי שונות שיש לקבוע ניסויים. ההבדל העיקרי השני עשוי להיות ההרכב של המאגר מתקפל מחדש. אופטימיזציה ידרוש בדיקות התנאים pH שונים, כמו גם החוזקות יונית.

בהתחשב בעבודה בעתיד, יש צורך רק בשני שינויים קלים כדי לאפשר יישום אנושי של SHB-SAPN. הראשון הוא כי וקטור הביטוי צריך להיות שונה לסמן התנגדות kanamycin בעקבות אלרגיה אמפיצילין בבני אדם29. הדרישה העיקרית השנייה של ייצור החלבון לשימוש אנושי היא לייצר את SHB-SAPN בתקשורת ללא מוצרים בעלי חיים. מחקר בקנה מידה קטן כבר הצביע על תשואה סבירה של חלבון במדיה המבוססת על צמחים. העבודה המוצגת כאן הוא מדרגי בקלות עבור ייצור GMP האולטימטיבי כפי שהוצג עם מועמד חיסון נגד מלריה, FMP01416. זה בקנה מידה גדול FMP014-sapn הייצור כללה הן את החליפין אניון ואת שלבי חילופי הקטיון כדי להפחית lps ו Ni2 + תוכן מהמוצר הסופי. זה חיידקי מבוטא SAPN כבר בקנה מידה של שלב הקרובה 1/2a ניסוי קליני.

Disclosures

ההשקפות המבובעות הן אלה של המחברים, ואין לפרש אותן כדי לייצג את מעמדם של צבא ארה ב או של משרד הביטחון. פיטר Burkhard יש עניין בחברה בשם אלפא-O פפטידים AG ו יש פטנטים על הטכנולוגיה. למחברים האחרים אין השתייכות או מעורבות פיננסית עם כל חברה עם עניין פיננסי על הנושא המוצג בעיתון זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הסכם שיתופי (W81XWH-11-2-0174) בין קרן הנרי מ. ג'קסון לקידום הרפואה הצבאית, Inc., ומשרד ההגנה של ארה ב. הנוגדן נגד HIV-1 gp41 mAb 167-D הרביעי התקבל מ ד ר סוזן זוללה-פזנר דרך התוכנית הכימית של מערכת האיידס NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS BioRad 1610732 1 L
2-Mercaptoethanol BioRad 1610710 25 mL
2-propanol Fisher BP26181 4 L
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 1610737 30 mL
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers Malvern Panalytical ZEN0040 100 pack
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl BioRad 4561093 10 pack
Ampicillin Fisher BP1760-25 25 g
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] AbCam ab18184 100 mg
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) AIDS Reagent Repository 11681 100 mg
BCIP/NBT Substrate, Solution Southern Biotech 0302-01   100 mL
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-108 A variety of sizes
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm Ted Pella, Inc 01754-F 25 pack
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns GE HealthCare 45-000-325 5 pack
Glycerol Fisher BP229-4 4 L
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) ABCam ab97020 1 mg
Imidazole Fisher O3196-500 500 g
Instant NonFat Dry Milk Quality Biological A614-1003 10 pack
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay Lonza Walkersville 50650U 192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well Plates Lonza Walkersville 25-340 1 plate
Magic Media E. coli Expression Medium ThermoFisher K6803 1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters Millipore SLGV033RB 250 pack
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP Southern Biotech 9040-04   1.0 mL
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli ThermoFisher C601003 20 vials
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, BioRad 1610363 1 mL
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL ThermoFisher 66810 8 pack
Sodium Chloride Fisher BP358-212 2.5 kg
Sodium Phosphate Monobasic Fisher BP329-500 500 g
Tris Base Fisher BP152-1 1 kg
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Biosynth International C-1818 100 g
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S Electron Micoscopy Services 541-09-3 25 g
Urea Fisher BP169-500 2.5 kg
Whatman qualitative filter paper Sigma Aldrich WHA10010155 pack of 500
Name Company Catalog Number Comments
 Equipment
ChromLab Software ver 4 BioRad 12009390 Software
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH2 Plate Reader
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor ThermoFisher 096-145075 Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Gel Imager for Stain free Gels
JEOL TEM JEOL 1400 Transmission Electron Microscope
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BioRad 1658004 To run gels
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher ND-ONE-W For Protein Concentration
NanoSight NS300 Malvern Panalytical Particle Sizing
NanoSight NTA software NTA Malvern Panalytical Particle Sizing
New Brunswick Innova 44/44R Eppendorf M1282-0000 Incubator/Shaker
NGC Quest 10 Chromatography System BioRad 7880001 FPLC to aid in protein purification
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella, INC 91000S To clean grids
PowerPac Universal Power Supply BioRad 1645070 To run gels
Rocker Shaker Daigger EF5536A For Western
Sonifer 450 Branson also known as 096-145075  Sonicator
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge ThermoFisher 75-006-580 Centrifuge
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs BioRad 1704158 For Western
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad 1704150 For Western
Vortex-Genie 2 Daigger EF3030A Vortex
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Particle Sizing
Zetasizer Software Malvern Panalytical Particle Sizing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
  2. Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
  3. Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
  4. Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
  5. Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
  6. Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
  7. Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
  8. Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
  9. Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
  10. Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
  11. Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
  12. Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
  13. El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
  14. Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
  15. Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
  16. Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
  17. Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
  18. El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
  19. Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
  20. Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
  21. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
  22. O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
  23. Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
  24. Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
  25. Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
  26. Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
  27. Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  28. Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
  29. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).

Tags

Bioengineering סוגיה 150 חיסון משנה ננו חיסון הרכבת עצמית ננו-חלקיק חלבון sapn אנטיגן מצגת trimeric אנטיגן מבנה מקורי
ייצור של <em>E. coli</em>-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas,… More

Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas, G. R., Beck, Z. Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation. J. Vis. Exp. (150), e60103, doi:10.3791/60103 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter